"МУК 4.1.3656-20. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение витамина B5 (пантотеновой кислоты) в пищевой продукции методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 26.10.2020)

1. Разработаны ФБУЗ "Федеральный центр гигиены и эпидемиологии" Роспотребнадзора (В.Ю. Ананьев, А.А. Гарбузова, М.В. Зароченцев, О.В. Андросова, А.А. Константинов, И.П. Семенова, И.П. Холстов, М.М. Дударев).

2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 26 октября 2020 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) распространяются на исследования пищевой продукции и биологически активные добавки к пище (далее - БАД) и устанавливают метод определения витамина B₅ (пантотеновой кислоты) с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ).

1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также могут быть использованы организациями, аккредитованными в установленном порядке на проведение исследований продовольственного сырья, пищевых продуктов.

1.3. МУК носят рекомендательный характер.

2.1. Методика основана на определении витамина B₅ (пантотеновой кислоты) методом ВЭЖХ на обращенной фазе со спектрофотометрическим детектором.

3.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций (в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6).

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

5.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности - по ГОСТ 12.1.004 и ГОСТ 12.1.018.

Требования электробезопасности при работе с приборами - по ГОСТ 12.1.019 и в соответствии с инструкцией по эксплуатации прибора.

5.2. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт эксплуатации данного оборудования, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

6.1. При выполнении анализа в лаборатории следует соблюдать следующие условия:

- температура окружающего воздуха от 15 °C до 30 °C;

- относительная влажность воздуха от 20% до 80%.

7.1. Подготовка жидкостного хроматографа.

7.1.1. Жидкостной хроматограф готовят в соответствии с инструкцией по эксплуатации.

7.1.2. Хроматографические условия проведения анализа:

- хроматографическая колонка стальная, длиной 150 мм, внутренним диаметром 2,1 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18, зернение 5 мкм;

- длина волны поглощения 220 нм;

- подвижная фаза метанол:водный раствор фосфата натрия (1 : 9) с pH = 2,5;

- скорость потока элюента 0,5 мл/мин;

- объем вводимой пробы 20 мм³;

- ориентировочное время удерживания пантотеновой кислоты 5 - 6 мин;

- подготовленную пробу вводят в инжектор хроматографа не менее двух раз.

Допустимо использование других хроматографических условий, обеспечивающих разделение компонентов в пробе, необходимую чувствительность и воспроизводимость.

7.2. Приготовление градуировочных растворов.

7.2.1. Приготовление основного стандартного раствора пантотеновой кислоты 600 мкг/см³.

Взвешивают 60 +/- 0,15 мг пантотеновой кислоты, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ и растворяют в дистиллированной воде. Растворы хранят в холодильнике в течение 1 месяца.

Основной стандартный раствор пантотеновой кислоты также используют при построении градуировочной зависимости в качестве раствора N 4.

7.2.2. Приготовление градуировочных растворов пантотеновой кислоты.

Градуировочные растворы пантотеновой кислоты готовят по схеме, представленной в табл. 2. Аликвотные части основного стандартного раствора пантотеновой кислоты переносят в мерные колбы объемом 100 см³ и доводят до метки дистиллированной водой. Градуировочные растворы используют в день приготовления.

7.3. Приготовление раствора трихлоруксусной кислоты массовой концентрации 50 г/см³.

Взвешивают 50,0 +/- 0,01 г трихлоруксусной кислоты и растворяют в 30 - 40 см³ дистиллированной воды в мерной колбе вместимостью 100 см³, доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают. Раствор годен в течение 2 месяцев.

7.4. Приготовление разбавленного (1 : 9) раствора ортофосфорной кислоты.

В конической колбе вместимостью 250 см³ смешивают отмеренные мерным цилиндром 20 см³ концентрированной ортофосфорной кислоты и 180 см³ дистиллированной воды. Раствор годен в течение 6 месяцев.

7.5. Приготовление подвижной фазы.

Взвешивают 3,50 +/- 0,01 г безводного однозамещенного фосфата натрия, растворяют его в 950 мл дистиллированной воды и доводят pH раствора до значения 2,5 +/- 0,05 ед. концентрированной ортофосфорной кислотой. Полученный раствор переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см³, доводят до метки водой и тщательно перемешивают. Для приготовления подвижной фазы смешивают 900 см³ полученного раствора фосфата натрия и 100 см³ метанола для ВЭЖХ. Полученную подвижную фазу перед использованием фильтруют через фильтр с размером пор 0,45 мкм.

7.5. Установление градуировочной характеристики.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика от концентрации пантотеновой кислоты в растворе (мкг), устанавливают методом абсолютной калибровки по 6 градуировочным растворам пантотеновой кислоты.

В инжектор хроматографа вводят по 20 мм³ каждого градуировочного раствора N 1 - 4 (пп. 7.2.1 - 7.2.2) и анализируют согласно п. 7.1.2. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений.

Устанавливают площади пиков пантотеновой кислоты для каждого градуировочного раствора, на основании которых строят градуировочную линейную зависимость.

7.6. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее двух образцов концентраций для градуировки, содержание пантотеновой кислоты в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 10,0 до 600,0 мкг/см³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

X - концентрация пантотеновой кислоты в пробе при контрольном измерении, мкг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора пантотеновой кислоты, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

B - норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (равен 10% при P = 0,95).

Если величина расхождения (A) превышает 10%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов пантотеновой кислоты, предусмотренных методическими указаниями. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново согласно п. 7.5.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

8.1. Отбор проб пищевой продукции и биологически активных добавок проводят с учетом требований нормативно-технической документации на конкретный вид продукта.

9.1. Пробоподготовка молока и молочных продуктов.

Пробу массой 5 - 7 г помещают в коническую колбу вместимостью 100 см³, добавляют раствор разбавленной ортофосфорной кислоты (п. 7.4) в количестве 30 см³ и полученную смесь встряхивают на орбитальном шейкере в течение 30 минут. Через 30 мин в полученный экстракт добавляют 2 см³ раствора трихлоруксусной кислоты (п. 7.3) и оставляют перемешиваться на шейкере еще на 10 минут. Полученный экстракт количественно переносят в центрифужный стакан объемом 50 см³. Условия центрифугирования: скорость не менее 5000 об./мин, время - 20 мин. Надосадочную жидкость фильтруют через бумажный фильтр ("синяя лента"), количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 см³, доводят дистиллированной водой до метки, а затем фильтруют аликвоту через шприцевой фильтр с размером пор не более 0,45 мкм. Полученный экстракт анализируют в условиях хроматографирования по п. 7.1.2.

9.2. Пробоподготовка мясных изделий.

Навеску 10 - 15 г отбирают из тщательно гомогенизированного образца, помещают в коническую колбу объемом 250 см³ и добавляют 150 см³ раствора разбавленной ортофосфорной кислоты (п. 7.4). Колбу с экстрактом подвергают обработке на ультразвуковой бане в течение 30 минут при слабом нагреве (30 - 35 °C), затем охлаждают до комнатной температуры, в колбу добавляют 5 см³ раствора трихлоруксусной кислоты (п. 7.3) для осаждения белков и других посторонних примесей. Содержимое колбы фильтруют на бумажном фильтре "синяя лента", фильтрат количественно переносят в мерную колбу объемом 200 см³ и доводят дистиллированной водой до метки. Далее 10 - 15 см³ полученного раствора центрифугируют (не менее 5000 об./мин, время - 20 мин), затем аликвоту пропускают через шприцевой микрофильтр с размером пор не более 0,45 мкм. Полученный экстракт анализируют в условиях хроматографирования по п. 7.1.2.

9.3. Пробоподготовка биологически активных добавок к пище.

Навеску образца БАД 5 - 10 г отбирают из тщательно гомогенизированного образца. При исследовании образца БАД в виде капсулы оболочку капсулы отделяют и в анализе учитывают только наполнитель. Навеску помещают в коническую колбу объемом 250 см³ и добавляют 150 см³ раствора разбавленной ортофосфорной кислоты (п. 7.4). Колбу с экстрактом подвергают обработке на ультразвуковой бане в течение 45 минут. Содержимое колбы фильтруют на бумажном фильтре "синяя лента", фильтрат количественно переносят в мерную колбу объемом 200 см³ и доводят дистиллированной водой до метки. Далее 10 - 15 см³ полученного раствора центрифугируют (не менее 5000 об./мин, время - 30 мин), затем аликвоту пропускают через шприцевой микрофильтр с размером пор не более 0,45 мкм. Полученный экстракт анализируют в условиях хроматографирования по п. 7.1.2.

В случае если обнаруживаемая концентрация пантотеновой кислоты находится ниже нижнего диапазона построения градуировочного графика, допускается увеличение навески анализируемой пробы.

10.1. Расчет концентрации пантотеновой кислоты в пищевых продуктах (мг/100 г продукта) проводится по формуле:

C - концентрация пантотеновой кислоты, найденная по градуировочному графику, мкг/см³;

V₁ - общий объем экстракта, см³ (50);

m - масса навески, г.

11.1. За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/100 г;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12.1. Результат анализа представляют в виде:

- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/100 г;

- граница абсолютной погрешности, мг/100 г;

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

13.1. Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6.

1. ГОСТ 12.1.004 "Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования".

2. ГОСТ 12.1.005 "Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны".

3. ГОСТ 12.1.007 "Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".

4. ГОСТ 12.1.010 "Система стандартов безопасности труда. Взрывобезопасность. Общие требования".

5. ГОСТ 12.1.018 "Система стандартов безопасности труда. Пожаровзрывобезопасность статического электричества. Общие требования".

6. ГОСТ 12.1.019 "Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты".

7. ГОСТ 12.4.009 "Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание".

8. ГОСТ 12.4.021 "Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования".

9. ГОСТ OIML R 76-1 "Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания".

10. ГОСТ 1770 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) "Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия".

11. ГОСТ Р ИСО 5725-6 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике".

12. ГОСТ Р 52501 "Вода для лабораторного анализа. Технические условия".

13. ГОСТ 4328 "Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия".

14. ГОСТ 28498 "Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний".

15. ГОСТ 29169 "Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой".