"Методические указания по лабораторной диагностике оспы птиц"
(утв. Минсельхозом СССР 04.06.1985 N 115-6а)

1.1. Лабораторная диагностика оспы птиц включает: обнаружение в патологическом материале вирусных оспенных частиц; выделение вируса из патологического материала на куриных эмбрионах (КЭ); постановку биологической пробы (в сомнительных случаях).

2.1. В ветеринарную лабораторию направляют 5...6 клинически больных или павших птиц (куры, индейки, голуби, канарейки и др.).

2.2. Из свежих оспин или с мест поражений слизистых оболочек птиц готовят на предметных стеклах тонкие мазки-отпечатки для микроскопического исследования. Одновременно отбирают патологический материал (эпителиомы, дифтеритические наложения) для выделения вируса.

2.3. Отобранный патологический материал тщательно растирают в ступке со стерильным битым стеклом и готовят 10%-ную суспензию на стерильном физиологическом растворе с pH 7,2...7,4, которую затем обрабатывают в течение 12 ч при 4 °C смесью в составе 500 ЕД/мл пенициллина, 250 мкг/мл стрептомицина и 50 ЕД/мл нистатина. После указанной обработки суспензию центрифугируют 10 мин при 1500 об/мин и делают высевы на МПБ, МПА с целью исключения бактериальной контаминации.

3.1. Для обнаружения вирусных оспенных частиц приготовленные мазки-отпечатки (п. 2.2) подсушивают на воздухе, перед окраской выдерживают 10...15 мин в дистиллированной воде и окрашивают методом серебрения по Морозову или по методу Пашена (см. приложение).

3.2. При микроскопическом исследовании мазков (окраска по Морозову) на светло-коричневом фоне препарата обнаруживают вирусные оспенные частицы в виде мелких круглых образований темно-коричневого или черного цвета, расположенных поодиночке, парно, короткими цепочками или скоплениями; при окрашивании препаратов по Пашену при наличии вирусных оспенных частиц в поле зрения микроскопа видны мелкие округлые образования темно-красного цвета.

4.1. Вирус оспы птиц выделяют на 10...12-суточных КЭ, полученных из хозяйства, благополучного по инфекционным болезням птиц.

4.2. Из полученной и обработанной 10%-ной суспензии, свободной от контаминации микрофлорой, дополнительно готовят суспензию на физиологическом растворе 10^-2 и 10^-3 и затем каждым разведением в объеме по 0,2 мл заражают на хорионаллантоисную оболочку (ХАО) по 4 эмбриона. После заражения КЭ инкубируют в течение 6 сут в термостате при 36,5...37 °C и относительной влажности 60...70%. Эмбрионы ежедневно овоскопируют. КЭ, погибшие в первые 48 ч после заражения, не учитывают (неспецифическая гибель). Эмбрионы, погибшие на 3-и сутки и позже и все оставшиеся живыми на 6-е сутки после заражения, охлаждают в холодильнике при 4 °C в течение 4...5 ч, затем их вскрывают и просматривают состояние ХАО. В положительных случаях на ХАО обнаруживают отдельно расположенные или слившиеся оспины.

4.3. При обнаружении на ХАО оспин надо учитывать, что вирус оспы кур вызывает образование на ХАО мелких плоских поражений, иногда обширных, беловатого цвета; вирус оспы голубей - крупных с выпуклой серединой очагов оспенных поражений, иногда значительные утолщения и желеобразный отек всей ХАО (вид медузы); вирус оспы индеек образует на ХАО слабо выраженные очаги оспенного поражения, часто окруженные кольцеобразной зоной; при заражении вирусом оспы канареек на ХАО обнаруживают первичные разлитые очаги поражения и вторичные в виде мелких беловатых точек.

Из оспенных поражений ХАО делают тонкие мазки или мазки-отпечатки на предметных стеклах и окрашивают методом серебрения по Морозову или по методу Пашена для выявления в них вирусных (оспенных) частиц (см. приложение).

В случае неясности результатов, полученных при выделении вируса в первом пассаже, проводят второй последовательный пассаж испытуемого вируса.

5.1. Биологическую пробу ставят в случаях получения сомнительных результатов исследований мазков-отпечатков (п. 2.2) и при выделении вируса на КЭ.

5.2. Биопробу проводят на неиммунных к вирусу оспы цыплятах 3...4-месячного возраста, полученных из хозяйств, благополучных по инфекционным болезням птиц.

5.3. Суспензию исследуемого материала, приготовленную, как указано в п. 2.3, втирают в слегка скарифицированную поверхность гребня и в фолликулы голени сразу после выщипывания перьев.

5.4. При наличии в исследуемом материале вируса оспы птиц на 5...6-й день после заражения на гребне появляются характерные эпителиомы, а на голени - типичный для оспы фолликулит. При микроскопическом исследовании мазков-отпечатков, приготовленных из эпителиом гребня или из пораженных фолликулов голени и окрашенных методом серебрения по Морозову или по методу Пашена, обнаруживают вирусные оспенные частицы.

6. Лабораторный диагноз на оспу считают установленным в случаях: обнаружения в мазках-отпечатках из патологического материала вирусных оспенных частиц; выделения возбудителя оспы на КЭ; получения положительных результатов биологической пробы.

7. Сроки исследований: микроскопических - 1 день; выделение вируса на КЭ - 6 сут; при проведении второго пассажа - 12 сут; биологической пробы - 8 сут.

1.1. Окраска по Морозову. Предварительно готовят три реактива:

- реактив N 1 (жидкость Руге): 1 мл ледяной уксусной кислоты, 2 мл 40%-ного формальдегида, 100 мл дистиллированной воды и 1 мл жидкой карболовой кислоты;

- реактив N 2: 5 г танина, 100 мл дистиллированной воды и 1 мл жидкой карболовой кислоты;

- реактив N 3: 5 г кристаллического азотнокислого серебра растворяют в 100 мл дистиллированной воды; из этого раствора в отдельный сосуд отливают 20 мл. К 80 мл оставшегося раствора азотнокислого серебра по каплям добавляют 25%-ный раствор аммиака, пока образующийся желтовато-коричневый, а затем буро-черный осадок не растворится и останется лишь легкая опалесценция. Если добавление аммиака вовремя не прекращено, то берут раствор азотнокислого серебра (из 20 мл) и добавляют его по каплям до появления легкой опалесценции. Для окраски препаратов готовый реактив разбавляют дистиллированной водой в соотношении 1:10.

На приготовленные препараты (п. 3.1) наносят реактив N 1 (жидкость Руге), который через 1 мин сливают, промывают дистиллированной водой и протравливают реактивом N 2 при подогревании над пламенем спиртовки до появления паров (1...2 мин). Затем после промывания водой препараты покрывают одним слоем фильтровальной бумаги и обрабатывают реактивом N 3 при легком подогревании, пока мазки не приобретут темно-коричневую окраску, после чего их вновь тщательно промывают дистиллированной водой, высушивают на воздухе и просматривают под иммерсионной системой микроскопа.

1.2. Окраска по Пашену. Для окраски препаратов по методу Пашена предварительно готовят раствор для протравы по Леффлеру, состоящий из 20%-ного водного раствора танина - 100 мл, насыщенного водного раствора сернокислого закисного аммиачного железа - 50 мл и насыщенного спиртового раствора основного фуксина - 10 мл. Перед окраской раствор фильтруют, наносят его на препараты, осторожно подогревают до появления паров и оставляют на несколько минут для остывания; затем смывают дистиллированной водой и наносят на препараты карболовый фуксин Циля; осторожно подогревают до появления паров, оставляют для остывания и снова промывают дистиллированной водой, высушивают на воздухе и просматривают под иммерсионной системой микроскопа (1).