"Методические указания по определению гетерофоса, этафоса и их метаболитов в биологическом материале, молоке, яйцах методом газожидкостной хроматографии"
(утв. Минздравом СССР 08.06.1987 N 4339-87)

--------------------------------

<*> Разработаны: М.В. Письменной, М.А. Клисенко (ВНИИГИНТОКС) [1]; В.Р. Хаитовым, Г.Л. Холмухамедовой, А.Д. Сайфутдиновой (УзНИВИ) [2].

Краткая характеристика препаратов. Характеристики гетерофоса, этафоса приведены в Унифицированной методике.

Характеристика метаболитов этафоса и гетерофоса приведена в таблице 28.

Принцип метода. Методика основана на определении S-пропильных ФОП (гетерофоса, этафоса и десяти их метаболитов) методом ГЖХ. Указанные соединения извлекают из субстратов смесью ацетона и 0,1 н HCl (9:1), гетерофос из молока и яиц извлекают смесью ацетона с этанолом (3:1). Экстракты очищают перераспределением в системе жидкость - жидкость.

Определение методом ГЖХ проводят на хроматографе, снабженном ТИД и ДПР. Используют неподвижные фазы SE-30 на хроматоне N-AW-HMDS и 3% OV-101 на инертоне-супер. Для разделения пестицидов и их метаболитов определение проводят в изотермическом режиме при двух температурах - 190 и 127 °C.

Метрологическая характеристика метода приведена в таблице 29.

--------------------------------

<*> Расчет проведен суммарно для различных органов (печень, почки, мозг и др.).

<**> Приведены нижние пределы обнаружения в исследуемых объектах в зависимости от взятой навески (2 - 20 г).

Избирательность метода. Определению могут мешать ФОП, имеющие близкие времена удерживания.

Реактивы и растворы. Ацетон ч. Хлороводородная кислота ч., 0,1 н водный раствор. н-Гексан ч., х.ч. Спирт этиловый, ректиф. Сульфат натрия безводный свежеприготовленный. Вода дистиллированная.

Приборы и посуда. Газовый хроматограф с ТИД и ДЭЗ марки "Цвет", "Газохром" и др. Микроизмельчитель тканей РТ-2 или мясорубка. Прибор для отгонки растворителей (ротационный вакуумный испаритель) типа ИР-1М. Микрошприцы на 10 мкл (МШ-10). Колбы: конические со шлифом и пробками вместимостью 100, 250 и 500 мл; круглодонные со шлифом для отгонки растворителей; мерные вместимостью 50 и 100 мл. Делительные воронки на 50, 100 и 250 мл. Воронки химические. Пробирки мерные со шлифом вместимостью 5 и 10 мл. Пипетки на 1, 5 и 10 мл. Микропипетки на 0,1 мл.

Подготовка к определению. Для проведения клинических исследований на содержание гетерофоса и этафоса отбирают 100 мл суточной мочи, 2 мл крови.

Подготовка хроматографической колонки для ГЖХ. Колонку заполняют общепринятым в хроматографии способом, кондиционируют 48 ч при температуре на 20 °C выше рабочей температуры колонки.

Ход анализа. Экстракция и очистка экстракта. Исследуемые органы и ткани (печень, почки, селезенка, легкие, головной мозг, мясо) измельчают в микроизмельчителе тканей или мясорубке. Отбирают 2 - 20 г средней пробы (для пищевых продуктов навеска 20 г), заливают в зависимости от взятой навески 15 - 250 мл смеси ацетона с 0,1 н хлороводородной кислотой (9:1) и оставляют на 1 ч, периодически перемешивая пробу стеклянной палочкой и встряхивая. Затем растворитель сливают в делительную воронку, фильтруя через вату. Заливают пробу новой порцией смеси и экстрагируют еще 30 мин. Экстракты объединяют. Пробу промывают смесью дважды порциями по 5 - 10 мл и смывы присоединяют к экстракту. В делительную воронку приливают 50 мл дистиллированной воды, перемешивают и добавляют 50 мл н-гексана. Осторожно встряхивают в течение 5 мин. Отделяют верхний н-гексановый слой, сливая его через безводный сульфат натрия (7 - 10 г), насыпанный на фильтр, вложенный в воронку. Из нижнего водного слоя экстрагируют ФОП н-гексаном еще два раза порциями по 40 мл, объединяя экстракты с первым. Упаривают экстракт на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани 40 - 45 °C примерно до 1 мл. Переносят остаток в мерную пробирку со шлифом, ополаскивая колбу небольшими порциями (по 0,3 - 0,4 мл) н-гексана. Доводят объем в пробирке н-гексаном точно до 2 мл, перемешивают и аликвоту хроматографируют.

К 2 - 5 мл цельной крови, собранной в стаканы вместимостью 50 - 100 мл, прибавляют при непрерывном перемешивании стеклянной палочкой безводный сульфат натрия до образования сухой массы (20 г). Затем приливают 30 - 40 мл диэтилового эфира и 10 мин. перемешивают пробу с эфиром. Сливают эфир в колбу для отгонки растворителей, фильтруя через фильтр "красная лента". Экстракцию повторяют еще раз. Эфирные экстракты объединяют, упаривают на ротационном испарителе при температуре бани 20 - 25 °C до объема 1 - 2 мл. Остаток упаривают досуха при комнатной температуре. К сухому остатку в колбе прибавляют 1 мл н-гексана и аликвоту хроматографируют.

Пробу мочи (20 мл) переносят в делительную воронку, разбавляют 20 мл дистиллированной воды, перемешивают и прибавляют 20 мл диэтилового эфира. Осторожно встряхивают 5 мин. и дают отстояться. Отделяют верхний эфирный слой, сливая его через безводный сульфат натрия. Операцию экстрагирования повторяют дважды. Объединенные экстракты переносят в колбу для отгонки растворителей и далее поступают так же, как при экстракции из крови.

Из 10 г (мл) средней пробы молока, яиц, органов и тканей гетерофос извлекают 50 мл смеси ацетона с этанолом (3:1). Экстрагируют при встряхивании в течение 20 мин., после чего экстракты помещают в морозильную камеру холодильника на 1 ч. Пробы фильтруют через бумажный фильтр в колбы для отгонки либо в фарфоровые чашки, промывают посуду и фильтр 20 мл экстрагирующей смеси. Фильтрат концентрируют под вакуумом на ротационном испарителе (температура бани 40 °C) или упаривают в фарфоровых чашках на водяной бане при температуре 40 °C в слабом токе теплого воздуха до объема 1 - 2 мл. Остатки фильтруют через бумажный фильтр в делительные воронки. Колбы для отгонки или фарфоровые чашки тщательно ополаскивают 10 мл смеси этанола с водой (1:3), фильтруют в те же делительные воронки, добавляют 25 мл дистиллированной воды и встряхивают 0,5 - 1 мин. Из водно-спиртового раствора гетерофос трижды экстрагируют гексаном порциями по 30 мл в течение 2 - 3 мин. при встряхивании. Объединенный гексановый экстракт сушат безводным сульфатом натрия, помещают в колбы для отгонки или в фарфоровые чашки и концентрируют до объема 0,5 мл. Оставшийся растворитель отгоняют досуха при комнатной температуре. Сухой остаток растворяют в 5 мл этилового спирта и аликвотную часть (2 - 3 мкл) хроматографируют.

Время удерживания и пределы обнаружения исследуемых соединений при указанных условиях определения методом ГЖХ приведены в таблице 30.

--------------------------------

<*> Для удобства работы можно приготовить смеси, в которых концентрация каждого соединения соответствует его концентрации, указанной в таблице для рабочих растворов. Смесь I: гетерофос, метаболиты N 1, 2, 3, 4, 6. Смесь II: гетерофос, метаболит N 5. Смесь III: метаболиты N 7, 8, 9, 10.

<**> В скобках указана концентрация раствора при работе с ДПР.

Обработка результатов анализа. Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Для этого до и после анализа проб вводят в хроматограф по 3 - 5 мкл рабочих стандартных растворов. Измеряют высоту пиков и вычисляют среднее арифметическое из пяти определений. Если при введении в хроматограф аликвотной части (3 - 5 мкл) конечного экстракта пробы получаются слишком большие пики или происходит "зашкаливание", пробу разбавляют н-гексаном. Для определения гетерофоса и всех его метаболитов каждую пробу следует анализировать при двух температурах колонки (190 и 127 °C), используя соответствующие стандарты.

Содержание пестицида или его метаболитов в пробе (X, мг/кг, мг/л) рассчитывают по формуле:

Требования безопасности. Соблюдают общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями и токсичными веществами.