"Методические указания по лабораторной диагностике везикулярной болезни и везикулярной экзантемы свиней"
(утв. Минсельхозом СССР 15.06.1979)

1.1. Лабораторная диагностика везикулярной болезни (ВБС) и везикулярной экзантемы синей (ВЭС) заключается в:

- обнаружении антигена в патологическом материале (везикулы, везикулярная жидкость) методами реакции связывания комплемента (РСК), реакции диффузионной преципитации (РДП);

- выделении возбудителя из патологического материала в культуре клеток и его идентификации в серологических реакциях: иммунофлуоресценции (ИФ), РСК или реакции нейтрализации (РН);

- выявлении антител в крови больных и переболевших животных (ретроспективная диагностика) в одной из серологических реакций РСК, РДП, РН;

- биологической пробе;

- исследовании физико-химических свойств выделенного вируса.

1.2. При диагностике везикулярной болезни и везикулярной экзантемы проводят дифференциацию везикулярного стоматита и ящура в РСК или РДП и биологической пробе с использованием сопутствующих каждой инфекции диагностических наборов, выпускаемых биологической промышленностью.

1.3. Лабораторный диагноз на везикулярную болезнь и везикулярную экзантему свиней ставят на основании положительных результатов исследования патологического материала на обнаружение антигена с помощью одной из серологических реакций (РСК, РДП) или выделения возбудителя в РСК или РН или установления двукратного нарастания титра антител в организме животных с учетом эпизоотологических и клинических данных.

1.4. Для постановки лабораторного диагноза методом обнаружения антигена в патологическом материале требуется 1 ... 3 дня, для выявления вируса и его идентификации - до 10 дней, для выявления прироста антител в крови животных - от 2 до 4 недель.

2.1. В лабораторию для исследования направляют стенки невскрывшихся везикул и везикулярную жидкость от 2 ... 5 больных животных в количестве не менее 2 г. Везикулы от свиней берут с кожи "пятачка", венчика, мякишей или вымени, предварительно промыв эти участки кожи водой с антибиотиками (1000 ЕД пенициллина и стрептомицина на 1 мл). Стенки везикул срезают ножницами, помещают во флакон или пробирки, опечатывают и в термосе со льдом направляют в лабораторию с нарочным.

Для ретроспективной диагностики на исследование направляют пробы крови от 5 ... 10 переболевших животных.

2.2. В лаборатории везикулы отмывают физиологическим раствором, растирают в ступке и добавляют 1:5 фосфатно-буферный раствор с pH 7,2 ... 7,4. После двукратного замораживания и оттаивания взвесь центрифугируют при 10 000 об/мин на холоде в течение 30 мин. Надосадочную жидкость исследуют в РСК на наличие антигена. Для РДП используют неразведенную везикулярную жидкость из невскрывшихся везикул или 35 ... 50%-ную взвесь на физиологическом растворе из стенок везикул.

2.3. Для выделения вируса в культуре клеток готовят 10%-ную взвесь из везикул на фосфатно-буферном растворе или питательной среде и, не подвергая замораживанию и оттаиванию, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин. В надосадочную жидкость добавляют антибиотики по 1000 ЕД/мл пенициллина и стрептомицина и используют для заражения.

3.1. Компоненты реакции:

- испытуемый антиген, приготовленный, как указано в п. 2.2;

- два типоспецифических комплементсвязывающих (КС) антигена вируса ВБС (0-72 и Т-75);

- два типоспецифических КС антигена вируса ВЭС (С-72 и А-48);

- контрольный (отрицательный) антиген;

- две типоспецифических комплементсвязывающих сыворотки к вирусу ВБС (0-72 и Т-75);

- две типоспецифических КС сыворотки к вирусу ВЭС (С-72 и А-48);

- контрольная (отрицательная) сыворотка;

- гемолизин;

- комплемент;

- эритроциты барана (2%-ная взвесь).

3.2. Испытуемый антиген исследуют в двукратных разведениях, остальные антигены и сыворотки - в удвоенном титре.

3.3. Постановка реакции: реакцию ставят в пробирках, титрование гемолизина и комплемента проводят в объеме 2,5 мл, а основной опыт - в объеме 0,5 мл.

РСК проводят в четыре этапа: титрование гемолизина, титрование комплемента, титрование антигенов и сывороток в присутствии комплемента и постановка главного опыта.

3.3.1. Титрование гемолизина. Для титрования гемолизина готовят основное его разведение 1:100 (0,2 мл гемолизина и 9,8 мл физиологического раствора, с учетом того, что гемолизин в ампуле разведен глицерином), затем - разведение 1:1000 и из этого разведения готовят все последующие по схеме 1.

Примечание: 0 - полный гемолиз; ++++ - полная задержка.

Титром гемолизина считают наивысшее его разведение, дающее полный гемолиз эритроцитов.

Рабочим разведением гемолизина считают четырехкратную концентрацию его предельного титра с учетом консервирования глицерином.

Например, если предельный титр гемолизина 1:4000, рабочее разведение его составит 1:1000, то берут его в соотношении 2:1000 (0,2 мл гемолизина и 99,8 мл физиологического раствора).

Для приготовления гемсистемы используют гемолизин в рабочем разведении и смешивают с равным количеством 2%-ной взвеси эритроцитов и выдерживают при комнатной температуре в течение 10 ... 15 мин.

3.3.2. Титрование комплемента. Комплемент титруют в разведении 1:20 в различных дозах по схеме 3.

Титром комплемента считают наименьшее его количество, при котором наступает полный гемолиз эритроцитов. Для титрования антигенов, сывороток и постановки главного опыта используют 2 дозы комплемента, которые соответствуют пробирке, находящейся через одну пробирку вправо от последней пробирки с полным гемолизом.

По схеме 3 полный гемолиз дают 2% комплемента, следовательно, рабочей дозой комплемента является разведение с содержанием 3% комплемента. Разведение готовят из цельного комплемента.

Например, по схеме 3 в опыт на 100 пробирок требуется 10 мл разведенного комплемента, для этого берут 0,3 мл цельного комплемента и добавляют 9,7 мл физиологического раствора.

3.3.3. Титрование типоспецифических антигенов. Титрование антигенов проводят с целью установления рабочей дозы антигена по схеме 4. Типоспецифические сыворотки используют в двойном титре.

Титром антигена считают его наибольшее разведение, давшее со специфической сывороткой задержку гемолиза не менее чем на три креста.

Рабочим разведением антигена считается удвоенный титр антигена. По схеме 4 рабочее разведение антигена будет равно 1:2.

3.3.4. Титрование типоспецифических сывороток проводят по схеме 4, используя разведения их до предельного титра, а антигены - в рабочих разведениях.

3.3.5. Постановка главного опыта РСК. Реакции связывания комплемента ставят в объеме 0,5 мл. Первую фазу реакции (фазу связывания комплемента) проводят на водяной бане при температуре 37 °C в течение 20 ... 30 мин. Вторую фазу (фазу выявления) также проводят на водяной бане при температуре 37 °C в течение 20 ... 30 мин.

Учет РСК проводят по 100%-ному гемолизу. Главный опыт ставят по схеме 5.

Учет результатов проводят по схеме 6.

Примечания. Испытуемый антиген относится к 1-му серотипу вируса ВБС шт. 0-72.

Обозначение результатов РСК: ++++ - 100%-ная задержка гемолиза; +++ - 75%-ная задержка гемолиза; ++ - 50%-ная задержка гемолиза; + - 25%-ная задержка гемолиза; - - полный гемолиз.

3.4. Положительной РСК считается в том случае, когда наблюдается 100%-ная или 75%-ная задержка гемолиза (четыре-три креста) в присутствии одной из типоспецифических сывороток и антигена из испытуемого материала при полной задержке гемолиза в контрольных пробирках с соответствующими специфическими антигенами и сыворотками и при полном гемолизе в пробирках с контрольным - нормальным антигеном и гетерологичными сыворотками.

При получении сомнительного результата (один-два креста) РСК повторяют.

При получении повторного сомнительного результата реакцию считают положительной.

При получении отрицательного результата в РСК (тепловой вариант с учетом по 100%-ному гемолизу) проводят постановку модифицированной РСК с регистрацией результатов фотоэлектроколориметрией.

4.1. Данный метод используют для исследования проб патологического материала (везикул и везикулярной жидкости) с низкой комплементсвязывающей активностью. Метод основан на учете результатов гемолиза на спектрофотометре (фотоэлектроколориметре) с нефелометром.

4.2. Компоненты реакции:

- испытуемый антиген, приготовленный, как указано в п. 2.2;

- два типоспецифических КС антигена вируса ВБС (0-72 и Т-75);

- два типоспецифических КС антигена вируса ВЭС (С-72 и А-46);

- контрольный (отрицательный) антиген;

- две типоспецифические КС сыворотки к вирусу ВБС (0-72 и Т-75);

- две типоспецифические КС сыворотки к вирусу ВЭС (С-72 и А-48);

- три типоспецифические сыворотки к вирусу ящура типов А, О и С;

- две типоспецифические сыворотки к вирусу везикулярного стоматита типов "Индиана" и "Нью-Джерси";

- контрольная (отрицательная) сыворотка;

- гемолизин;

- комплемент;

- эритроциты барана, приготовленные на вероналовом буфере;

- физиологический раствор.

4.3. Приготовление стандартной суспензии эритроцитов.

Эритроциты барана 3 ... 4 раза отмывают и из осадка готовят 0,6 ... 0,7%-ную взвесь на вероналовом буфере. Стандартную взвесь готовят по следующей схеме:

В РСК используют взвесь эритроцитов, в которой средний показатель оптической плотности должен быть равен 0,50.

4.3.1. Примечание: Состав вероналового буфера:

- барбитуровая кислота - 2,875 г;

- барбитурат натрия - 1,875 г;

- сернокислый магний - 0,616 г;

- хлористый кальций - 0,080 г;

- хлористый натрий - 45,5 г;

- дистиллированная вода - 2 л.

Вначале в мерной колбе на 2 л растворяют барбитуровую кислоту в 500 мл подогретой дистиллированной воды, а затем все остальные компоненты с добавлением воды до метки. Раствор стерилизуют автоклавированием при 110 °C в течение одного часа. Хранят до 2 мес при 4 °C. Перед употреблением разбавляют 2:3 дистиллированной водой.

4.4. Гемолитическая система. Готовят разведение гемолизина соответственно удвоенному его титру в обычной РСК. Смешивают равные объемы раствора гемолизина и стандартной суспензии эритроцитов. Смесь выдерживают в течение 15 мин при комнатной температуре.

4.5. Титрование комплемента проводят трехкратно. Комплемент разводят 1:200 и титруют по следующей схеме:

Учет результатов.

Полученные результаты наносят на миллиметровую бумагу и находят точку, соответствующую 50%-ному гемолизу эритроцитов (ОП = 0,25). В опыт берут 1,2 CH₅₀ комплемента.

4.6. Постановка основного опыта. Готовят двукратные разведения испытуемого антигена от 1:5 до 1:400, а далее в зависимости от примерной исходной активности антигена. Разливают по 0,5 мл каждого разведения антигена. Количество пробирок зависит от числа специфических сывороток, взятых в опыт. Вносят по 0,5 мл рабочего разведения сывороток согласно титру в обычной РСК. Добавляют комплемент в рабочем разведении и инкубируют при 37 °C в течение 30 мин. Затем вносят по 0,5 мл гемсистемы, выдерживают снова 30 мин при 37 °C и проводят учет реакции.

4.7. Учет реакции. В левый кюветодержатель ФЭКН-57 ставят кювету с буфером, а в правый кюветодержатель - кювету с измеряемой пробой. Вращением правого барабана устанавливают стрелки прибора на нуль. Проводят отсчет показания прибора по правому барабану. Разница показания прибора на 0,15 и более между опытной пробиркой и контрольной - на антикомплементарность антигена + сыворотки, принимается за положительный результат. Разница 0,10 ... 0,14 - за сомнительный, 0,10 и ниже - за отрицательный результат.

4.8. Настройку прибора ФЭКН-57 и измерение проводят по инструкции, прикладываемой к прибору.

Для измерения используют фотоэлектроколориметр с нефелометром. Учет результатов проводят с использованием кюветы на 10 мм при переключении на нефелометрическое измерение с красным светофильтром (N 8).

При малых объемах материала объем каждого реагента можно уменьшить до 0,25 мл, добавить физраствора 1,5 мл. Измерение при этом проводят в кюветах на 5 мм.

5.1. Для постановки РДП используют 1,5%-ный агар, приготовленный на дистиллированной воде с добавлением 1,6% хлористого натрия. Для сохранения агара к нему добавляют 10%-ный раствор фенола из расчета 50 мл раствора на 1 л агара и 0,03 г мертиолята. Такой агар хранится в течение двух месяцев. Перед постановкой реакции его разливают в чашки Петри и штампом делают лунки (диаметр лунок 5 мм, расстояние между лунками 5 мм).

5.2. Компоненты реакции:

- испытуемые антигены, приготовленные, как указано в п. 2.2;

- два контрольных типоспецифических антигена штаммов ВБС (0-72 и Т-75);

- контрольный типоспецифический антиген штамма ВЭС (С-72);

- две типоспецифические сыворотки к штаммам ВБС (0-72 и Т-75);

- типоспецифическая сыворотка к штамму ВЭС (С-72);

- типоспецифические сыворотки к 7 типам вируса ящура.

5.3. Постановка реакции. В центральные лунки вносят испытуемый и контрольный антигены, в периферические - типоспецифические сыворотки. Чашки инкубируют при 37 °C. Учет реакции проводят через 24, 48 и 72 ч.

5.4. Учет реакции. Положительная реакция характеризуется образованием четкой, белого цвета одной или двух линий преципитации между антигеном и гомологичной сывороткой.

Возбудитель относят к тому виду (типу), с сывороткой которого испытуемый антиген дает положительную реакцию.

6.1. Для выделения вируса используют перевиваемую (ПП) или первично-трипсинизированную культуры клеток почки поросенка. Для заражения используют 10%-ную взвесь из стенок везикул, приготовленную, как указано в п. 2.3.

Одной исследуемой пробой заражают не менее 4 ... 6 пробирок или флаконов с культурой клеток, внося в каждую пробирку по 0,1 мл (во флакон - по 0,5 мл) взвеси, предварительно удалив из пробирок питательную среду и промыв культуру клеток раствором Хенкса.

Пробирки выдерживают в течение 60 мин при комнатной температуре, после чего в них добавляют поддерживающую питательную среду (0,9 мл в пробирки, 10 мл - во флаконы) и инкубируют в течение 3 ... 5 сут, не меняя среды. Для контроля оставляют 4 ... 6 пробирок с незараженной культурой клеток.

6.2. Поддерживающая среда состоит из раствора Хенкса с 0,5%-ным гидролизатом лактальбумина с добавлением по 200 ЕД/мл пенициллина и стрептомицина, с pH 7,2 ... 7,4.

6.3. Учет реакции. Для выявления цитопатического действия вируса в зараженных культурах их ежедневно просматривают под малым увеличением микроскопа в течение 3 ... 5 дней. При наличии вируса ВБС или ВЭС в исследуемом материале ЦПД обнаруживается через 24 ... 48 ч. Оно характеризуется мелкоклеточной деструкцией по всему монослою с последующим образованием мелких конгломератов и отслоением от стекла. Для вируса ВЭС характерно появление светопреломляющих округлых клеток по всему монослою с последующим образованием гроздевидных скоплений, которые затем также отслаиваются от стекла.

6.4. При наличии ЦПД-вируса на два креста (деструкция 50% клеток) проводят его идентификацию в РСК (как описано в п. 3) или в реакциях нейтрализации и иммунофлуоресценции.

7.1. Метод иммунофлуоресценции используется только для идентификации вируса ВЭС.

7.2. Выделенный вирус выращивают в культуре клеток на покровных стеклах. При появлении ЦПД (через 6 ... 8 ч инкубации) покровные стекла вынимают из пробирок и многократно отмывают фосфатно-буферным раствором, затем стекла подсушивают на воздухе и фиксируют метиловым спиртом в течение 5 мин.

7.3. Для выявления вируса ВЭС используют специфическую флуоресцирующую сыворотку в рабочем разведении. Для контроля используют нормальную флуоресцирующую сыворотку в том же разведении.

7.4. Проведение реакции. Фиксированные препараты многократно отмывают фосфатно-буферным раствором, высушивают на воздухе в течение 10 ... 20 мин и обрабатывают флуоресцирующей сывороткой. Для контроля однотипные препараты обрабатывают нормальной флуоресцирующей сывороткой. Препараты помещают во влажную камеру и выдерживают в течение 30 мин при 37 °C. Окрашенные препараты многократно промывают фосфатно-буферным раствором, высушивают на воздухе, покрывают забуференным глицерином (9:1) и покровным стеклом и микроскопируют.

7.5. Оценка результатов. Положительной считается реакция, при которой в препарате наблюдается специфическое флуоресцирующее свечение клеток или цитоплазмы клеток не менее чем на два креста в трех и более полях зрения.

7.6. В сомнительных случаях окончательный диагноз на ВЭС ставят по результатам РН.

8.1. Идентификацию и серотипирование выделенного вируса проводят с помощью типоспецифических вируснейтрализующих сывороток:

- две сыворотки к вирусам ВБС (к штаммам 0-72 и Т-75);

- две сыворотки к вирусам ВЭС (к штаммам С-72 и А-46).

8.2. При необходимости дифференциации выделенного вируса от вируса ящура и вируса везикулярного стоматита в РН дополнительно используют сыворотки к указанным вирусам.

8.3. Постановка реакции. Выделенный вирус в культуре клеток отстаивают при комнатной температуре (20 °C), затем центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин и надосадочную жидкость используют для постановки РН. Из надосадочной жидкости готовят десятикратные разведения (от 10^-1 до 10^-6) на 0,5%-ном гидролизате лактальбумина и к 0,5 мл каждого разведения добавляют такой же объем типоспецифической сыворотки. В реакции используют в четырехкратном титре сыворотки, инактивированные при температуре 57 °C в течение 30 мин. Смесь встряхивают, выдерживают при комнатной температуре в течение 60 мин. Затем по 0,2 мл каждой смеси вносят в пробирки с культурами и доливают в них поддерживающую среду до объема 1 мл. Перед заражением проводят однократное отмывание монослоя поддерживающей средой.

8.3.1. Контроли:

- незараженная культура клеток;

- культура клеток, зараженная выделенным вирусом в разведении от 10^-1 до 10^-6;

- культура клеток, в которую внесены типоспецифические сыворотки в разведении 1:10.

Культуры клеток инкубируют при 37 °C и ежедневно просматривают под микроскопом.

8.4. Учет реакции. Культуры просматривают в течение 3 ... 5 дней до выявления ЦПД в пробирках с культурой, зараженной вирусом.

По выявлении ЦПД определяют титр инфекционности выделенного вируса (предельное его разведение, которое вызывает ЦПД в 50% зараженных пробирок не менее, чем на два креста).

Предельное разведение вируса, дающее ЦПД, обозначают как одну дозу ТЦД₅₀ (титр высчитывают по методу Рида и Менча). Индекс нейтрализации высчитывают по разности показателей ТЦД₅₀ выделенного вируса в присутствии типоспецифических сывороток и определяют серотиповую принадлежность вируса.

9.1. Для ретроспективной диагностики исследуют парные или однократно отобранные сыворотки переболевших животных. Сыворотки исследуют на наличие антител с помощью типоспецифических антигенов в РСК, РДП или РН.

9.2. Реакция связывания комплемента. РСК проводят в варианте длительного связывания.

Компоненты реакции:

- типоспецифические антигены ВБС (штаммы 0-72 и Т-75);

- типоспецифические антигены ВЭС (штаммы С-72 и А-48);

- контрольный отрицательный антиген;

- типоспецифические сыворотки к штаммам (0-72, Т-75, С-72 и А-48);

- контрольная отрицательная сыворотка;

- испытуемые сыворотки, инактивированные;

- гемолизин к эритроцитам теленка;

- комплемент.

9.3. В РСК используют 3%-ную взвесь эритроцитов теленка и гемолизин соответственно к ним. Комплемент используют биофабричного производства. Типоспецифические антигены предварительно титруют с соответствующими типоспецифическими сыворотками для определения рабочего разведения, как указано в п. 3.7.

9.4. Для дифференциации везикулярного стоматита и ящура при исследовании сывороток используют соответствующие антигены.

9.5. Схема постановки главного опыта при ретроспективной диагностике.

9.6. Схема учета главного опыта при ретроспективной диагностике.

Ретроспективный диагноз считается положительным при двукратном нарастании титра специфических антител к вирусу ВБС или ВЭС.

9.7. Реакция диффузионной преципитации. Для исследования в РДП используют парные пробы сывороток и типоспецифические антигены ВБС (штаммы 0-72 и Т-75), ВЭС (штаммы С-72 и А-48), ящура (А, О, С, Сат-1, Сат-2, Сат-3 и Азия-1), а также контрольные положительные и контрольные отрицательные сыворотки. Постановку и учет РДП проводят, как указано в пп. 4.3 и 4.4.

9.8. Реакция нейтрализации. Для реакции нейтрализации используют парные сыворотки свиней и вирусы ВБС (штаммы 0-72 и Т-75), ВЭС (штаммы С-72 и А-48) и вирусы ВС и ящура (7 серотипов). Испытуемые сыворотки инактивируют и разводят от 1:8 до 1:64. Вирусы предварительно титруют в культуре клеток и используют в РН в дозе 1000 ТЦД₅₀ в 1 мл. Постановку реакции проводят общепринятым методом.

9.9. Ретроспективный диагноз считается положительным при нарастании титра антител в парных сыворотках или при обнаружении титра антител 1:32 и выше у 10 и более свиней от числа однократно обследованных.

10.1. Биопробу проводят на белых мышах однодневного возраста и морских свинках. Материалом для заражения служит взвесь из стенок везикул (1:10) от больных свиней.

10.2. Испытуемый материал вводят морским свинкам интраплантарно в дозе 0,2 мл, мышам - интрацеребрально в дозе 0,02 мл. Наблюдают за животными в течение 10 дней после заражения.

10.3. Морские свинки чувствительны к вирусам везикулярного стоматита и ящура, мыши чувствительны только к вирусу ВБС. Через 36 ... 72 ч при наличии вируса ВБС мыши гибнут с явлениями паралича. Из органов и тканей павших животных готовят суспензию (как указано в п. 2.2) и исследуют в РСК на наличие антигена вируса ВБС.

11.1. Для определения чувствительности выделенного вируса к эфиру и к pH 5,0, а также стабилизирующего действия MgCl₂ при 50 °C используют нативную культуральную вируссодержащую жидкость.

11.2. Определение чувствительности вируса к эфиру. Вируссодержащую жидкость в количестве 5 ... 10 мл смешивают с равным объемом эфира, встряхивают в течение 20 мин при комнатной температуре и смесь оставляют на 18 ... 20 ч при 4 °C. Затем смесь центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 мин, верхний слой, содержащий эфир, удаляют, а нижний слой, содержащий вирус, титруют в культуре клеток ПП.

11.3. Определение чувствительности вируса к pH 5,0. К 9 частям среды с pH 5,0 (доводят до нужного значения добавлением 1 N HCl) добавляют 1 часть вируссодержащего материала, выдерживают в течение 1 ... 2 ч при комнатной температуре и затем титруют в культуре клеток ПП.

11.4. Определение стабилизирующего действия 1 М MgCl₂ при 50 °C. Вируссодержащий материал смешивают с равным объемом 2 М MgCl₂ и подогревают в течение одного часа при 50 °C, затем его титруют в культуре клеток ПП.

11.5. Сравнительные данные физико-химических свойств вирусов.

По результатам физико-химических исследований проводят идентификацию и дифференциацию вирусов ВБС, ВЭС, везикулярного стоматита (ВС) и ящура.

С изданием настоящих Методических указаний считается утратившим силу "Временное наставление по лабораторной диагностике везикулярной болезни свиней", утвержденное Главным управлением ветеринарии МСХ СССР 19 февраля 1975 г.