"Методические указания по лабораторной диагностике болезни Ауески животных"
(рекомендованы Минсельхозом СССР 18.05.1978)

1.1. Лабораторная диагностика болезни Ауески животных заключается в следующем:

- обнаружении и идентификации вируса этой болезни в патологическом материале методами непрямой гемагглютинации (РНГА) или иммуноосмофореза;

- выявлении специфических антител в сыворотке крови больных и переболевших животных в РНГА или в реакции нейтрализации (РН) на культуре клеток (ретроспективная диагностика);

- постановке биологической пробы.

1.2. РНГА, реакцию иммуноосмофореза и РН применяют для исследования патологического материала и сывороток крови только от невакцинированных против болезни Ауески животных.

1.3. Лабораторный диагноз на болезнь Ауески ставят при получении положительного результата хотя бы по одному из методов исследования, указанных в п. 1.1.

Окончательный диагноз на болезнь Ауески устанавливают на основании эпизоотологических, клинических и патологоанатомических данных с учетом результатов лабораторного исследования.

2.1. В качестве исследуемого материала отбирают пробы патологического материала из разных участков головного мозга (полушарий, мозжечка, продолговатого мозга), заглоточных и бронхиальных лимфоузлов, легких, печени, селезенки, почек свиней, павших или вынужденно убитых в агональном состоянии.

Патологический материал измельчают, растирают в ступке и готовят суспензию (1:5) на физиологическом растворе для РНГА и суспензию (1:5) на веронал-мединаловом буферном растворе (pH 8,6) для метода иммуноосмофореза.

2.2. Реакция непрямой гемагглютинации.

2.2.1. Компоненты реакции:

- эритроцитарный диагностикум (эритроциты барана, сенсибилизированные антителами к вирусу болезни Ауески);

- испытуемый антиген;

- контрольный положительный антиген (вакцинный штамм вируса болезни Ауески) в рабочем разведении;

- контрольный отрицательный антиген в рабочем разведении;

- нормальная лошадиная сыворотка.

2.2.2. Подготовка исследуемого материала. Суспензию из органов (1:5) выдерживают одни сутки при температуре -20 °C в холодильнике, затем центрифугируют при 4 тыс. об/мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость очищают хлороформом, добавляя его в количестве 1/4 части объема жидкости, затем вновь центрифугируют при 4 тыс. об/мин в течение 20 мин.

Надосадочную жидкость используют в РНГА в качестве испытуемого антигена.

2.2.3. Постановка реакции. РНГА ставят на микропанелях с помощью аппарата "микротитратор" системы Такачи.

Испытуемые и контрольные антигены разводят 1:2 и выше в объеме 0,05 мл 1%-ным раствором нормальной лошадиной сыворотки. Затем добавляют по 0,025 мл эритроцитарного диагностикума. Смесь встряхивают и выдерживают при комнатной температуре в течение 2...3 ч.

Контроли:

- контрольный положительный антиген + эритроцитарный диагностикум;

- контрольный отрицательный антиген + эритроцитарный диагностикум;

- эритроцитарный диагностикум + 1%-ный раствор нормальной лошадиной сыворотки.

2.2.4. Учет реакции. Учет РНГА проводят при полном оседании эритроцитов в контроле с отрицательным антигеном. Положительными считают те пробы антигенов, которые в разведении 1:8 и выше вызывают агглютинацию эритроцитов при положительном результате в контроле со специфическим антигеном и отрицательном результате с контрольным отрицательным антигеном.

2.3. Реакция иммуноосмофореза.

2.3.1. Компоненты реакции:

- специфическая к вирусу болезни Ауески иммуноасцитическая жидкость белых крыс (ИАЖ);

- контрольный положительный антиген;

- контрольный отрицательный антиген;

- испытуемый антиген.

Для постановки реакции необходимо иметь камеру из плексигласа для электрофореза, универсальный источник питания УИП-1, агар "Дифко", веронал-мединаловый буфер с pH 8,6, стекла обезжиренные (9x12 см), металлический штамп, пробирки, центрифугу.

2.3.2. Подготовка исследуемого материала. Суспензию из органов (1:5) подвергают однократному замораживанию (при -15...-20 °C) с последующим оттаиванием. Затем суспензию центрифугируют при 4 тыс. об/мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость используют в качестве испытуемого антигена.

2.3.3. Приготовление агаровой среды. Для постановки реакции готовят 1,5%-ный гель из агара "Дифко" на веронал-мединаловом буфере с pH 8,6. Пропись буфера: веронал - 1,66 г, мединал - 10,51, молочнокислый кальций - 1,536 г, дистиллированная (слегка подогретая) вода - 1 л. В качестве антибактериального средства в агаровую среду вносят мертиолят из расчета 1:10 000 и хранят в холодильнике.

Для постановки реакции агар, расплавленный и остуженный до 56 °C, наносят пастеровской пипеткой на стекла размером 9x12 см. Толщина агаровой пластинки 4...5 мм. Расход агара около 15 мл. В затвердевшем агаре выштамповывают лунки диаметром 5 мм, с расстоянием между лунками 5 мм.

2.3.4. Постановка реакции. В лунки, которые расположены ближе к катоду, вносят исследуемые антигены; в лунки, расположенные ближе к аноду, вносят специфическую асцитическую жидкость в рабочем разведении. Иммуноосмофорез проводят в камере для электрофореза на бумаге при напряжении тока 200...220 В в течение 1...2 ч. В качестве контроля используют положительный антиген со специфической асцитической жидкостью.

2.3.5. Учет реакции. Результаты иммуноосмофореза учитывают через 1,5...2 ч с момента включения камеры в сеть.

Реакция считается положительной при образовании линии преципитации между лунками с исследуемыми антигенами и специфической асцитической жидкостью при положительном результате в положительном контроле (контрольный положительный антиген + ИАЖ) и отрицательном результате в отрицательном контроле (контрольный отрицательный антиген + ИАЖ).

3.1. Ретроспективная диагностика основана на обнаружении специфических к вирусу болезни Ауески антител в сыворотке крови больных и переболевших животных в реакции непрямой гемагглютинации, а также в реакции нейтрализации на культуре клеток.

3.2. Реакция непрямой гемагглютинации.

3.2.1. Компоненты реакции:

- эритроцитарный диагностикум (эритроциты барана, сенсибилизированные вакцинным штаммом вируса болезни Ауески);

- испытуемые сыворотки;

- контрольная положительная иммуноасцитическая жидкость;

- эритроциты барана.

3.2.2. Подготовка исследуемых и контрольных сывороток. Перед постановкой РНГА исследуемые и контрольные сыворотки разводят 1:2 забуференным раствором, инактивируют в водяной бане при температуре 56 °C в течение 30 мин и истощают эритроцитами барана.

В 1 мл сыворотки вносят 0,1 мл 5%-ной взвеси отмытых эритроцитов барана, выдерживают в термостате при температуре 37 °C в течение 30...40 мин и удаляют эритроциты центрифугированием. При массовых исследованиях сыворотки после истощения можно выдерживать в течение 12...24 ч при 4 °C, затем их исследуют в РНГА в разведении 1:2 и выше.

3.2.3. РНГА проводят по методике, описанной в п. 2.2.

3.2.4. Учет реакции. Результаты реакции учитывают при полном оседании эритроцитов в контроле с отрицательной асцитической жидкостью.

Положительными к вирусу болезни Ауески считают те пробы сывороток, в которых при разведении 1:8 и выше наблюдают агглютинацию эритроцитов.

3.3. Реакции нейтрализации.

3.3.1. Реакцию нейтрализации проводят на культуре клеток ПП, СПЭВ и первично-трипсинизированной культуре куриных фибробластов.

3.3.2. Компоненты реакции:

- вирус болезни Ауески (вакцинный штамм);

- исследуемые сыворотки крови (инактивированные);

- контрольная положительная сыворотка.

3.3.3. Для постановки реакции необходимо предварительно провести пассаж вакцинного штамма вируса болезни Ауески на культуре клеток и определить его титр.

3.3.4. Чтобы провести пассаж вакцинного штамма вируса, содержимое ампулы разводят до нативного состояния (1:1), затем готовят разведение вируса 1:10 на питательной среде. Разведенный вирус в дозе 1 мл вносят в культуру клеток, выращенную в пенициллиновых флаконах, и инкубируют при температуре 37 °C. Через 24 ч клетки сморщиваются, округляются, монослой нарушается и образуются островки клеток. Через 72 ч монослой полностью нарушается и на стекле остаются единичные клетки.

Культуральный (вакцинный) штамм вируса хранят в холодильнике при температуре 4 °C и освежают один раз в 3 мес.

3.3.5. Для титрования вируса готовят десятикратные разведения вируса (от 10^-1 до 10^-8) на питательной среде без сыворотки. Каждым разведением в объеме 1 мл заражают отмытую раствором Хенкса культуру клеток (по 4 пенициллиновых флакона). Культуру клеток инкубируют при 37 °C, ежедневно просматривая ее под микроскопом. Окончательный учет результатов проводят через 72 ч.

Титром вируса считают наибольшее его разведение, вызывающее цитопатическое действие (ЦПД) в 50% культур клеток. Титр вычисляют по методу Рида и Менча и выражают количество ЦПД в 1 мл.

3.3.6. Постановка реакции нейтрализации. РН ставят с дозой вируса, равной 100 ТЦД₅₀ в 0,1 мл. Исследуемые сыворотки разводят 1:2 и выше в объеме 0,5 мл. К каждому разведению сыворотки добавляют равный объем (0,5 мл) вируссодержащей культуральной жидкости. Пробирки со смесью встряхивают и оставляют при температуре 37 °C в течение 60 мин. После инкубации смесь вируса с сывороткой вводят во флаконы с культурой клеток и результаты учитывают через 72 ч.

Для контроля заражают культуру клеток смесью вируса с контрольной положительной сывороткой, вирусом без сыворотки и одновременно в одном флаконе с культурой клеток сменяют питательную среду (контроль культуры клеток).

3.3.7. Учет реакции нейтрализации. Подавление цитопатического действия вируса специфической (контрольной) сывороткой и исследуемыми сыворотками при наличии ЦПД в контроле (культура клеток, зараженная вирусом без сыворотки) указывает на наличие специфических антител к вирусу болезни Ауески в сыворотке крови свиней.

4.1. Для постановки биопробы патологический материал (селезенку, печень, головной мозг, легкие) растирают в ступке с физиологическим раствором в соотношении 1:10. Полученную суспензию вводят внутримышечно кролику или кошке в дозе 1 мл. Через 2...3 сут после заражения при наличии вируса в патологическом материале животное заболевает.

Болезнь характеризуется беспокойством, зудом, расчесами на месте инъекции. Если зараженные животные погибают на 3...6-й день, но у них не наблюдалось зуда и расчесов, то патологический материал от павшего кролика (или кошки) пассируют еще раз на таких же животных (1).