"МУК 3.2.988-00. 3.2. Профилактика паразитарных болезней. Методы санитарно-паразитологической экспертизы рыбы, моллюсков, ракообразных, земноводных, пресмыкающихся и продуктов их переработки. Методические указания"
(утв. Минздрав России 25.10.2000)

1. Разработаны: Институтом медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е.И. Марциновского Минздрава РФ (О.П. Зеля, В.Д. Завойкин, А.С. Артамошин, В.И. Ходакова, Ю.А. Чефранова, В.П. Сергиев); Центром госсанэпиднадзора в Московской области (А.С. Довгалев); МГУ им. М.В. Ломоносова (Е.Д. Вальтер); Полярным научно-исследовательским институтом морского рыбного хозяйства и океанографии им. Н.М. Книповича (А.Б. Карасев); Институтом паразитологии РАН (Д.Г. Цейтлин).

2. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации 25 октября 2000 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие Методические указания устанавливают методы санитарно-паразитологической экспертизы рыбы и нерыбных объектов промысла (моллюсков, ракообразных, земноводных, пресмыкающихся), а также продуктов их переработки (далее по тексту - рыбная продукция).

1.2. Методические указания предназначены для применения в аккредитованных (или аттестованных, или лицензированных) лабораториях (в т.ч. контрольно-производственных) и лабораториях учреждений государственной санитарно-эпидемиологической и ветеринарной служб Российской Федерации, осуществляющих контроль качества гидробионтов и продуктов их переработки на соответствие СанПиН 2.3.2.560-96 и 3.2.569-96, а также научных учреждений, занимающихся изучением паразитарных болезней.

Специалисты лабораторий должны пройти подготовку в заявленной области аккредитации (аттестации, лицензирования), владеть метрологически аттестованными методиками и методами, утвержденными или допущенными к применению Госстандартом и госсанэпидслужбой России и соответствующих требованиям ГОСТа Р 8.563-96 "Методики выполнения измерений".

1.3. Среди всех классов паразитов (простейшие, ракообразные, гельминты и др.), встречающихся в рыбе и других гидробионтах, опасными для здоровья человека являются только личинки гельминтов: цестод, трематод, нематод и скребней. К наиболее социально значимым и широко распространенным заболеваниям, передающимся через рыбу и других гидробионтов, относятся описторхоз, дифиллоботриозы и эндемичные для Дальнего Востока России метагонимоз, нанофиетоз и клонорхоз. Определенную опасность для здоровья людей могут представлять гельминты, приживающиеся, но не развивающиеся до взрослой стадии у человека (использующие его в качестве резервуарного хозяина), что затрудняет диагностику заболевания. Это спирометра, гнатостомы, болбозомы, коринозомы и некоторые виды анизакид и парагонимид. Заражение человека пирамикоцефалусами, апофаллами, криптокотилюсами происходит крайне редко. Других гельминтов (меторхисов, псевдамфистомумов, гетерофиесов, эхинохазмусов и др.) можно отнести к паразитам, спорадически встречающимся у человека на определенных территориях.

1.4. Объектами исследований являются промысловые пресноводные и морские рыбы, моллюски, ракообразные, земноводные, пресмыкающиеся и продукты их переработки.

1.5. Потенциальную опасность для здоровья человека представляют только живые личинки гельминтов. В связи с этим, при паразитологическом инспектировании гидробионтов и продуктов их переработки следует определить жизнеспособность выявленных плероцеркоидов, метацеркарий, акантелл и личинок нематод (см. раздел 5).

1.6. При исследовании гидробионтов и продуктов их переработки следует соблюдать режим работы с инвазионным материалом, регламентированный Санитарными правилами 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами".

Отбор и объем проб рыбы, моллюсков, ракообразных, земноводных, пресмыкающихся и продуктов их переработки для исследования на соответствие требованиям безопасности для здоровья человека по паразитарным показателям осуществляется в соответствии с требованиями:

ГОСТа 7631-85 "Рыба, морские млекопитающие, морские беспозвоночные и продукты их переработки. Правила приемки, органолептические методы оценки качества, методы отбора проб для лабораторных испытаний";

Изменений N 2 к ГОСТу 7631-85 (п. 1.2), утвержденному Постановлением Госстандарта СССР от 25.10.89 N 3195;

СанПиНа 3.2.569-96 "Профилактика паразитарных болезней на территории Российской Федерации", приложение 3, п. 6.2 (при лабораторном контроле рыбной продукции) и п. п. 15.12, 15.13 (при оценке и контроле паразитологического состояния районов промысла (биотопов);

правил по сертификации "Типовой порядок обращения с образцами, используемыми при проведении обязательной сертификации. ПР 50.3.002-95".

Необходимые реактивы и оборудование:

1. Химические реактивы: глицерин, эфир или хлороформ.

2. Кюветы эмалированные.

3. Чашки Петри.

4. Пинцеты хирургические и глазные.

5. Препаровальные иглы.

6. Химические стаканы.

7. Кастрюли эмалированные.

8. Электроплитка.

9. Холодильник.

10. Весы с набором разновесов или весы электронные.

11. Сантиметр или линейка.

12. Марля, вата.

13. Фильтровальная бумага.

2.1.1. При оценке паразитологического состояния водоема (района промысла) следует начинать исследовать виды гидробионтов, наиболее подверженные заражению. Так, наилучшими индикаторами неблагополучия водоема в отношении инвазии личинками описторхисов является язь, далее по убывающей - елец, линь и т.д. (см. табл. 2), а в отношении Diphyllobothrium latum - щука и налим (см. табл. 1).

--------------------------------

<*> РП - ротовая присоска.

<**> БП - брюшная присоска.

Для исследования на наличие метацеркарий Opisthorchis felineus и плероцеркоидов D. latum целесообразнее отбирать рыб старших возрастов, т.к. личинки паразитов живут несколько лет, и их число увеличивается с возрастом рыб. Метацеркарии Metorchis bilis (albidus) чаще встречаются у сеголеток и рыб младших возрастов, а Echinochasmus perfoliatus - преимущественно у мальков.

2.1.2. До начала исследования рыбы, моллюсков, ракообразных, земноводных и пресмыкающихся следует точно определить видовую принадлежность исследуемого экземпляра и, руководствуясь табл. 1 - 4 и п. 4.4 настоящего документа и табл. 9 СанПиНа 3.2.569-96 (прилож. 3), определить, потенциальными носителями каких видов гельминтов, опасных для здоровья человека, он является.

Следует помнить, что один и тот же вид позвоночного или беспозвоночного может служить дополнительным или резервуарным (факультативным) хозяином для нескольких видов гельминтов.

2.1.3. Сохранять свежевыловленную рыбу и нерыбных промысловых гидробионтов до исследования следует в охлажденном состоянии (в холодильнике), не допуская кристаллизации, либо в слегка подвяленном на воздухе виде не более 3 - 5 дней.

2.1.4. Перед исследованием рыбу (или нерыбный объект промысла) отмывают от слизи, протирают, взвешивают, измеряют длину и делают в журнале записи, касающиеся учета исследований (раздел 7).

2.1.5. Для определения возраста у рыб с циклоидной чешуей последнюю берут с передне-боковой поверхности выше боковой линии, в количестве 15 - 20 крупных чешуек. У рыб с ктеноидной чешуей, а также с голой кожей берут отолиты или колючий шип грудного плавника.

2.1.6. Для исследования на наличие метацеркарий Metagonimus yokogawai и Metagonimus katsuradai отбирают по 20 чешуек из разных частей тела рыбы в спинной области, у карася - вдоль боковой линии. Крупные чешуйки (у сазанов, карасей) перед исследованием просветляют в течение 15 - 20 мин. в 50% растворе глицерина.

2.1.7. Перед исследованием живых раков и крабов рекомендуется поместить в кипящую воду на 0,5 - 1,5 мин. (в зависимости от размеров ракообразных) до прекращения движения или усыпить их эфиром (или хлороформом).

2.2.1. Сохранять свежих или охлажденных гидробионтов и продукты их разделки до исследования следует в холодильнике при температуре 2 - 4 °C. Замороженная рыбопродукция (сырье, полуфабрикаты и готовые изделия) до исследования хранится при температуре и в условиях согласно нормативно-технической документации на нее.

2.2.2. Непосредственно перед исследованием мороженую рыбную продукцию размораживают до температуры не ниже 0 °C в толще тела рыбы, моллюсков, ракообразных, земноводных, пресмыкающихся и продуктов их переработки. Живых ракообразных усыпляют (см. п. 2.1.7).

2.2.3. При исследовании вяленой, соленой и копченой рыбы ее предварительно вымачивают в течение суток до размягчения мышц, меняя воду каждые 4 - 6 ч.

2.2.4. Соленую икру (зернистую, паюсную, ястыковую) выдерживают в воде в течение 2 - 3 ч. Другие виды рыбной продукции (пресервы, жареная рыба, фарш и пр.) специальной подготовки не требуют и сохраняются в холодильнике до начала исследования.

2.2.5. О видовой принадлежности исследуемого образца судят по документам, сопровождающим пробу. При поступлении гидробионтов в виде, позволяющем произвести видовое определение, следует его уточнить.

Необходимые реактивы и оборудование:

1. Химические реактивы: физиологический раствор.

2. Предметные стекла.

3. Большие предметные стекла (6 - 8 х 12 - 15 см, толщиной 3 - 5 мм) или компрессорий.

4. Кюветы эмалированные.

5. Деревянная доска.

6. Чашки Петри.

7. Часовые стекла.

8. Пинцеты разных размеров (хирургические, анатомические, глазные).

9. Ножницы.

10. Скальпели.

11. Препаровальные иглы разной толщины.

12. Пипетки стеклянные (пастеровские).

13. Резиновые груши.

14. Фильтровальная бумага.

15. Марля, вата.

16. Лупа.

17. Бинокулярный микроскоп типа МБС.

18. Осветитель для бинокуляра любой марки.

19. Световой микроскоп типа Биолам, Бимам.

20. Осветитель к микроскопу любой марки.

21. Деревянный молоток.

3.1.1. При исследовании рыбной продукции используют два основных подхода:

1) выявление личинок гельминтов, видимых невооруженным глазом (плероцеркоиды, акантеллы, личинки нематод размером > 2 мм), путем тщательного осмотра всех органов, полостей и тканей промежуточных (или резервуарных) хозяев;

2) выявление личинок гельминтов, плохо или не видимых невооруженным глазом (в основном метацеркарий трематод и мелких нематод), путем исследования органов и тканей - мест наиболее вероятной их локализации, с использованием оптических средств. Уточнение видовой принадлежности личинок гельминтов в обоих случаях ведется с применением световых микроскопов типа МБС, Биолам или др.

3.1.2. Порядок исследования и необходимость проведения всех или только отдельных его этапов зависит от вида (видов) гельминта, встречающегося в исследуемом гидробионте, типичной локализации личинок в нем (таблицы 1 - 4, пункты 4.4.1, 4.4.2) и вида продукции.

3.1.2.1. При паразитологическом исследовании свежевыловленной и охлажденной рыбы на наличие цестод, нематод и скребней необходимо проводить практически весь предложенный ниже комплекс исследований (п. п. 3.2.1 - 3.2.7, 3.2.11). При поиске плероцеркоидов Diphyllobothrium dendriticum и акантелл рода Bolbosoma основное внимание обратить на рекомендации в пункте 3.2.4, Diphyllobothrium luxi (D. klebanovskii) - в пункте 3.2.11.1, Gnathostoma hispidum и Gnathostoma spinigerum - в пунктах 3.2.11.3 - 3.2.11.4.

На наличие метацеркарий большинства видов трематод - исследуют только верхний слой мышечной ткани и подкожную клетчатку в области спинных мышц (п. 3.2.11.3). Для обнаружения метацеркарий Metagonimus yokogawai и Metagonimus katsuradai в первую очередь исследуют чешую (п. 3.2.12), Echinochasmus perfoliatus - жабры (п. 3.2.9), Apophallus muhlingi и Rossicotrema donicum - ткани плавников (п. 3.2.8), Nanophyetus salmincola - почки (п. 3.2.7).

3.1.2.2. Мороженую, соленую, пряную, маринованную, вяленую, сушеную и копченую рыбную продукцию после предварительной подготовки (п. п. 2.2.2, 2.2.3) исследуют по методике неполного гельминтологического вскрытия, приведенной ниже (п. п. 3.2 - 3.4). При обнаружении личинок гельминтов следует определить их жизнеспособность (раздел 5).

3.1.2.3. Такие продукты переработки рыбы, как пресервы, фарш, жареная или заливная рыба, предварительно осматривают, а затем исследуют компрессорным методом (п. 3.2.11.3) или методом переваривания в искусственном желудочном соке (п. 3.2.11.4).

3.1.2.4. Рыбу потрошеную, обезглавленную, разделанную на тушку, спинку, кусок и филе, лапки земноводных, мышечные ткани и мантию двустворчатых моллюсков, а также мантию головоногих в зависимости от целей паразитологического инспектирования (вида гельминта) исследуют по одной из предложенных методик исследования мускулатуры (п. 3.2.11).

3.1.2.5. Икру (гонады), как свежую, так и продукты ее переработки, исследуют в соответствии с пунктом 3.2.6.

3.1.2.6. Молоки (семенники) тщательно осматривают снаружи на наличие полостных паразитов. Внутри молок опасных для здоровья человека паразитов нет.

3.2.1. Рыбу вскрывают в большой эмалированной кювете или на широкой гладкой доске. Прежде всего, проводят наружный осмотр рыбы для выявления личинок, просвечивающих через кожу, извлекают их препаровальной иглой.

3.2.2. Затем вырезают левую стенку полости тела и открывают доступ к последней. Для этого, повернув рыбу брюхом кверху, делают короткий надрез вперед от анального отверстия, куда затем вводят тупой конец ножниц и разрезают рыбу вдоль срединной линии брюшка до угла нижней челюсти. Делают дугообразный надрез, вырезают левую брюшную стенку, отделяют ее. Рыбу кладут на правый бок. При внимательном осмотре полости тела и внутренних органов могут быть обнаружены свободно лежащие или под серозой, или в капсулах личинки цестод, нематод, скребней, видимые невооруженным глазом.

3.2.3. Накладывают лигатуры на кишечник близ анального отверстия и на пищевод в его начальном отделе, чтобы содержимое пищеварительного тракта не вышло наружу. Затем извлекают внутренние органы. Вырезают яичники (икру) или семенники (молоки), помещая их в отдельные чашки Петри, и просматривают. Осматривают плавательный пузырь снаружи и внутри. Вырезают и осматривают сердце, а также сердечную полость. Компрессорным способом исследуют содержимое, оставшееся в полости тела. Последнюю протирают марлевой салфеткой, соскабливают брюшину.

3.2.4. Затем отпрепаровывают комплекс органов пищеварительной системы. В первую очередь выделяют желчный пузырь, лежащий на поверхности печени, так, чтобы его содержимое (в том числе и паразиты) не залило остальные внутренние органы. Затем выделяют пищеварительный тракт, печень, селезенку, поджелудочную железу. Эти органы отделяют друг от друга и от окружающей их жировой ткани и осматривают. Жировую ткань разрезают на тонкие пластинки толщиной около 3 мм или исследуют компрессорно между стеклами на темном фоне или в полупроходящем свете.

Исследуют освобожденный от жировой ткани пищеварительный тракт, отыскивая личинок в капсулах на его поверхности или просвечивающих через серозные покровы (Diphyllobothrium dendriticum, Diphyllobothrium latum, Dioctophyme renale, Eustrongylides exicisus, Corynosoma strumosum, Corynosoma semerse, Bolbosoma caenoforme, личинки сем. Anisakidae). Пилорические придатки (развитые у налима, сиговых, лососевых) расправляют и осматривают снаружи (Pyramicocephalus phocarum). Стенки желудка и пищевода после наружного осмотра исследуют под бинокулярной лупой, подбирая степень увеличения в зависимости от объекта.

3.2.5. При наружном осмотре печени невооруженным глазом можно заметить плероцеркоиды цестод (Diphyllobothrium latum, Pyramicocephalus phocarum, Eustrongylides exicisus) и личинки анизакид. Поджелудочную железу, селезенку, печень осматривают снаружи и также разрезают на пластинки толщиной около 3 мм.

3.2.6. У яичника разрезают оболочку, содержимое соскабливают и компрессуют. Здесь часто встречаются плероцеркоиды Diphyllobothrium latum. Компрессорным методом удобно просматривать лишь мелкую икру. При исследовании крупных икринок следует разбирать их препаровальными иглами в чашке Петри с небольшим добавлением воды.

Соленую икру (зернистую, паюсную, ястыковую) после предварительной подготовки (п. 2.2.4) исследуют таким же способом. При исследовании семенников (молок) тщательно просматривают их поверхность.

3.2.7. Последними из внутренних органов исследуют почки, лежащие вдоль позвоночника. Так как ткань почек очень рыхлая, обычно не удается выделить их целиком. Их соскабливают и по частям исследуют компрессорным способом, добавляя несколько капель воды. Почки - орган наиболее вероятной локализации метацеркарий Nanophyetus salmincola.

3.2.8. Отрезают плавники и просматривают их с использованием микроскопа МБС при увеличении 16 - 48 (окуляр 8х, 12х, объектив 2х, 4х) раз в небольшом количестве воды. Здесь могут быть заметны в виде маленьких черных точек пигментированные цисты Apophallus muhlingi и Rossicotrema donicum, а также метацеркарии Metagonimus yokogawai и Metagonimus katsuradai. Мышцы плавников исследуют компрессорным способом (3.2.11.3).

3.2.9. Снимают жаберную крышку и ножницами вырезают все жаберные дуги. Их по очереди рассматривают в чашке Петри под бинокуляром, перебирая лепестки препаровальными иглами и следя за тем, чтобы они были покрыты водой. Затем отрезают от дуги лепестки у их основания и, разбирая препаровальными иглами, выявляют паразитов, оставшихся незамеченными. На жабрах можно обнаружить метацеркарии Echinochasmus perfoliatus, Metagonimus yokogawai, Metagonimus katsuradai, Nanophyetus salmincola, Opisthorchis felineus.

3.2.10. После просмотра внутренних органов с рыбы снимают кожу в направлении от головы к хвосту, подрезая ее ножницами и оттягивая хирургическим пинцетом или рукой. Осматривают внутреннюю сторону кожи, а часть мышц, отделившихся с кожей, разрезают на пластинки или соскабливают и компрессуют.

3.2.11. Метод исследования мускулатуры выбирается в зависимости от целей паразитологического контроля (вида гельминта).

3.2.11.1. Метод параллельных разрезов. Метод применяется для обнаружения в мышечной ткани рыбы личинок гельминтов, видимых без использования увеличительных приборов (цестод, нематод, скребней).

Мышечную ткань острым скальпелем разрезают на пластинки толщиной до 5 мм, которые затем раздвигают и просматривают в падающем свете невооруженным глазом. Разрезы можно делать как поперек, так и вдоль мышечных волокон. Делая разрезы мускулатуры и встречая в ее толще крупных личинок или капсулы с личинками (величиной около 1 см и более), нужно извлечь несколько экземпляров паразитов целиком для определения вида.

Выделенных личинок следует поместить в чашку Петри или часовое стекло с физиологическим раствором.

При исследовании тихоокеанских лососей, кунджи и сахалинского тайменя на наличие плероцеркоидов Diphyllobothrium luxi (D. klebanovskii) разрезы проводят поперек мышечных волокон всей дорсальной части тела, большинство личинок локализуется между жировым и спинным плавниками.

3.2.11.2. Метод исследования мышечной ткани на просвет. Используется также для выявления личинок нематод, цестод, скребней. Для применения этого метода необходимо изготовить специальное приспособление - столик с прозрачной крышкой (размером не менее 40 х 40 см, лучше из молочного или матового стекла) и подсветкой снизу. Можно пользоваться столиком микроскопа типа МБС с нижней подсветкой.

Мышечную ткань рыбы (или филе) острым скальпелем или ножом нарезают на пластинки толщиной не более 2 - 3 см.

Куски мышц помещают на верхнюю крышку столика и просматривают. Яркость подсветки и толщина ломтиков в зависимости от степени просвечиваемости мяса конкретного вида рыбы устанавливается опытным путем.

Обнаруженных личинок гельминтов выделяют из мышечных тканей рыбы с помощью препаровальных игл.

Выделенных личинок помещают в чашку Петри или часовое стекло с физиологическим раствором.

3.2.11.3. Компрессорный метод

3.2.11.3.1. Метод применяется в основном для выявления метацеркарий трематод. Это очень мелкие, незаметные или малозаметные невооруженным глазом объекты, поэтому для их обнаружения и дифференциации видовой принадлежности необходимы специальные микроскопические исследования. Используют метод при просмотре мышечной ткани и внутренних органов рыб, а также мышечной ткани ракообразных. Возможно его использование при исследовании внутренних органов рыб на наличие личинок нематод и цестод.

3.2.11.3.2. Целесообразно компрессорному исследованию подвергать органы и участки мышечной ткани наиболее вероятной локализации метацеркарий (табл. 2).

3.2.11.3.3. Участок тела наиболее вероятной локализации метацеркарий освобождают от чешуи, затем скальпелем надрезают кожу по средней линии спины и двумя надрезами от первого надреза до боковой линии выделяют участок средней трети спины. Кожу с вычлененного участка поднимают пинцетом и с помощью скальпеля отделяют ее так, чтобы подкожная клетчатка осталась на поверхности мышц. Острым скальпелем соскабливают или срезают тонкие пластинки поверхностного слоя мышц, толщиной не более 2 - 3 мм, размещают их на нижнем стекле компрессория, накрывают другим стеклом и сдавливают их. Наиболее удобно использовать компрессорные стекла, нарезанные из обычного оконного стекла с краями, обработанными наждаком. Размеры стекол 6 - 8 х 12 - 15 см, нижнее стекло немного больше верхнего, толщина 3 - 5 мм. Срезы просматривают с помощью микроскопа типа МБС, используя увеличение в 16 - 48 раз (окуляр 8х, 12х, объектив 2х, 4х). Для уточнения диагноза кусочки тканей с личинками переносят на предметные стекла, накрывают покровными и исследуют при большем увеличении (например, объектив 8х, 10х, окуляр 7х или 10х, бинокулярная насадка 1,5х) с помощью микроскопа типа Биолам, Бимам.

При обнаружении личинок можно ограничиться просмотром мышц с одной стороны тела. При отсутствии личинок необходимо просмотреть срез и с другой стороны. При исследовании молоди рыб длиной до 20 - 25 мм их компрессуют целиком. Более крупных сеголеток распластывают на две половинки и просматривают в компрессории со стороны разреза, не снимая кожи и не освобождая от чешуи.

Подсыхающие срезы, препараты увлажняют водой или физиологическим раствором из пипетки.

3.2.11.4. Метод переваривания в искусственном желудочном соке

Необходимые реактивы и оборудование (дополнительно):

1. Химические реактивы: пепсин; концентрированная HCl; NaCl; дистиллированная вода.

2. Весы с набором разновесов или весы электронные.

3. Шпатели (лопаточки) металлические, стеклянные, деревянные.

4. Воронки стеклянные разных размеров.

5. Мерные цилиндры (0,5 - 0,25 л).

6. Банки стеклянные с притертой пробкой для хранения реактивов (0,1, 0,25, 0,5 л).

7. Банки стеклянные (или колбы) для дистиллированной воды емкостью 1 - 2 л.

8. Набор стеклянных мерных пипеток (от 1 до 10 мл).

9. Химические стаканы.

10. Покровные стекла.

11. Ситечки с ячеей 1 х 1 мм.

12. Термостат.

13. Холодильник.

3.2.11.4.1. В специальных целях при необходимости выделения личинок из тканей гидробионтов (для дифференциации видовой принадлежности, получения материала для контрольной биологической пробы, при низкой интенсивности инвазии или для ее подсчета) используется метод переваривания. Он также более эффективен при исследовании продуктов переработки гидробионтов (фарша, пресервов). В основном используется для выделения метацеркарий трематод, реже личинок нематод.

3.2.11.4.2. Метод основан на том, что в кислой среде метацеркарии освобождаются от наружной оболочки, а окружающая их мышечная ткань переваривается в искусственном желудочном соке.

3.2.11.4.3. Приготовление искусственного желудочного сока. На 1000 мл дистиллированной воды (при ее отсутствии можно использовать кипяченую остывшую до температуры 37 - 38 °C водопроводную воду) добавляют 7 г пепсина, 9,0 г поваренной соли (NaCl) и 10 мл концентрированной соляной кислоты (HCl).

3.2.11.4.4. Для выделения метацеркарий трематод берут подкожную мышечную ткань (до 0,5 см), а мелких личинок нематод - всю мышечную ткань. Ее отделяют от кожи, измельчают ножом или в мясорубке (при выделении личинок нанофиетуса используют дополнительно и почки). Затем ее заливают в соотношении 1:10 приготовленным искусственным желудочным соком (1 часть фарша и 10 частей искусственного желудочного сока). Пробу помещают в термостат на 3 ч при температуре 36 - 37 °C, после чего содержимое фильтруют в стеклянные цилиндры через металлический фильтр с размером ячеек 1 х 1 мм или однослойный бинт. Через 15 - 20 мин. верхний слой желудочного сока с переваренной мышечной тканью сливают, а осадок переносят в чашку Петри (или глубокое часовое стекло) и микроскопируют. Для лучшего отделения личинок в чашку Петри наливают физиологический раствор, делают несколько круговых движений, в результате которых метацеркарии концентрируются в центре чашки Петри (часового стекла), а излишки физраствора с остатками мышечной ткани удаляют пипеткой. Процедуру повторяют до полного исчезновения остатков непереваренной мышечной ткани.

Эффективность метода переваривания, в сравнении с компрессорным, в 1,5 раза выше. Метацеркарии трематод, выделенные этим способом из свежей рыбы, сохраняют свою структуру и жизнеспособность в физрастворе в течение 10 - 24 ч при температуре 20 - 25 °C и 5 - 7 дней при температуре 1 - 4 °C и могут быть использованы для биопробы.

3.2.12. Заранее подготовленную чешую (2.1.6) исследуют с использованием микроскопа МБС (увеличение 16 - 48 раз, окуляр 8х, 12х, объектив 2х, 4х) в небольшом количестве воды на наличие метацеркарий Metagonimus yokogawai, Metagonimus katsuradai.

3.3.1. Процедура и порядок исследования земноводных и пресмыкающихся аналогичны таковым при инспектировании рыбы. Исследуют полость тела, органы и ткани, включая мускулатуру.

3.4.1. Двустворчатые моллюски.

3.4.1.1. Для раскрытия раковины тонкий нож или скальпель вводят между створками и разрезают мускул-замыкатель. Из открытой раковины, надрезав мантию в передней ее части, сливают мантийную жидкость. Между одной из створок и прилегающей к ней мантийной складкой вводится плоская ручка скальпеля. Двигая ее по краю створки вперед и назад, сначала отделяют край мантии, прикрепленный к створке, затем передний и задний мускулы-замыкатели (аддукторы). На следующем этапе отделяют мантию и аддукторы от другой створки, после чего раковина легко удаляется. У гребешков и устриц аддуктор один и находится в середине тела, несколько ближе к заднему краю.

3.4.1.2. Вынутое из раковины тело моллюска помещают в кювету (или чашку Петри) с водой. Осматривают мантию и просвечивающие в спинной части тела через полупрозрачную кожу внутренние органы: печень, лежащую непосредственно позади переднего аддуктора или на спинной стороне над аддуктором (у гребешков и устриц), перикардий и граничащие с задним аддуктором почки. Обнаруженных личинок нематод извлекают препаровальной иглой.

3.4.1.3. Мантийные складки отрезают и просматривают на просвет (п. 3.2.11.2) или компрессорно (п. 3.2.11.3). Затем отрезают и осматривают жабры.

3.4.1.4. Отпрепаровывают гонады, залегающие в спинной части ноги. Они расчленены и слагаются из многочисленных мелких долек, окружающих петлю кишечника. Гонады исследуют компрессорным способом. Здесь наиболее вероятно обнаружение личинок Echinocephalus sinensis и Sulcascaris sulcata. Затем выделяют пищеварительную систему и исследуют таким же образом.

3.4.1.5. Аддукторы и ногу исследуют так же, как мускулатуру у рыб (п. 3.2.11). Аддуктор гребешков - место наиболее вероятной локализации Sulcascaris sulcata.

3.4.1.6. Выявленных личинок помещают в чашку Петри или часовое стекло с физиологическим раствором для дальнейшего определения вида паразита.

3.4.2. Головоногие моллюски. У кальмаров и каракатиц разрезается мантия на брюшной стороне. Разрез делают ножницами или скальпелем по срединной линии, начиная от края мантии, до основания плавника. При этом стараются не повредить чернильный мешок. У осьминогов, кроме того, разрезают мускулистую продольную перегородку, открывая доступ в мантийную полость. Отгибают стенки мантии и осматривают внутренности. Последовательно отделяют жабры, гонады, пищеварительную систему. Внутренние органы исследуют компрессорно. Особое внимание обращают на гонаду, где возможно обнаружение личинок нематод рода Anisakis. Освобожденную от внутренних органов мантию исследуют аналогично мышечной ткани рыб - на просвет (п. 3.2.11.2) или методом параллельных разрезов (п. 3.2.11.1). На внутренней стороне мантии, в пленках встречаются личинки нематод родов Anisakis и Contracaecum.

3.4.3. Ракообразные.

3.4.3.1. При инспектировании пресноводных крабов и раков на наличие метацеркарий парагонимид в первую очередь исследуют мышцы грудного отдела и сердце как места наиболее вероятной локализации личинок (до 90% случаев). Для этого у ракообразных ножницами срезают карапакс, затем с помощью скальпеля вырезают мышцы грудного отдела. Используя компрессорный метод (п. 3.2.11.3), микроскопируют при увеличении в 16 - 48 раз (окуляр 8х, 12х, объектив 2х, 4х). Из задней части грудного отдела вычленяют сердце и исследуют таким же образом.

3.4.3.2. С боковых сторон головогруди срезают жабры и исследуют компрессорно в небольшом количестве воды.

3.4.3.3. Для выделения мяса из абдомена, последний отрезают от груди и ножницами разрезают панцирь от верхнего края "шейки" до тельсона (хвостового веера). Конечности (у крабов и раков) разрезают на части (поперек) вблизи кожистых суставов, одновременно разрезая хитиновую пластинку, прикрепленную к суставу. Панцирные трубки разрезают вдоль и извлекают мясо. Клешню разбивают резким и сильным ударом деревянного молотка. Всю мышечную ткань просматривают в компрессории.

3.4.3.4. Всю выделенную мышечную ткань можно исследовать методом переваривания в искусственном желудочном соке (п. 3.2.11.4).

Необходимые реактивы и оборудование:

1. Химические реактивы: физиологический раствор; жидкость для просветления нематод (1 часть дистиллированной воды + 1 часть концентрированной молочной кислоты + 1 часть глицерина).

2. Предметные стекла.

3. Большие предметные стекла (6 - 8 х 12 - 15 см, толщиной 2 - 4 мм).

4. Покровные стекла.

5. Чашки Петри.

6. Часовые стекла.

7. Пинцеты разных размеров (анатомические, хирургические, глазные).

8. Препаровальные иглы разной толщины.

9. Пипетки стеклянные (пастеровские).

10. Резиновые груши.

11. Бинокулярный микроскоп типа МБС.

12. Лупа.

13. Осветитель для бинокуляра любой марки.

14. Световой микроскоп типа Биолам, Бимам.

15. Осветитель к микроскопу любой марки.

16. Окуляр-микрометр для светового микроскопа.

17. Окуляр-микрометр для бинокулярного микроскопа.

18. Объект-микрометр.

Для определения видовой принадлежности личинок гельминтов необходимо исследование с применением оптических средств.

Извлеченных из рыб, моллюсков, ракообразных, земноводных и пресмыкающихся плероцеркоидов, личинок нематод, скребней, отделенных от тканей метацеркарий или включения, которые могут быть приняты за паразитов (в том числе инцистированных или инкапсулированных) помещают на предметное стекло в каплю воды или физиологического раствора, накрывают покровным стеклом и исследуют сначала под малым (в 56 - 150 раз, окуляр 7х, 10х, объектив 8х, 10х, бинокулярная насадка 1,5х), а затем под большим (в 140 - 600 раз, окуляр 7х, 10х, объектив 20х, 40х, бинокулярная насадка 1,5х) увеличением микроскопа.

Дифференциальная диагностика нематод требует предварительного выдерживания личинок в просветляющей жидкости. Крупных личинок с плотной кутикулой просветляют до двух-трех дней (личинки сем. Anisakidae), мелких с тонкой кутикулой - не менее 3 - 5 ч.

Для проведения необходимых измерений личинок, отдельных их частей или органов следует пользоваться окуляром-микрометром (окуляром, с установленной в его фокальной плоскости прозрачной пластинкой с линейкой длиной в 1 см с делениями, соответствующими 0,1 мм). Цена деления шкалы при использовании разных объективов меняется и вычисляется с помощью объект-микрометра - препарата, представляющего собой нанесенную на стекло шкалу с ценой деления 0,01 мм. Если m делений изображения объект-микрометра по величине соответствует n делениям окулярной шкалы, точное значение увеличения объектива (b) будет равно b = 10 n/m. При измерении объектов наблюдают, в пределах скольких делений n окулярной шкалы располагается изображение измеряемого элемента, и размер его (a) подсчитывают по формуле: a = 0,1 n/m.

В случае, если исследователь не может установить видовую принадлежность личинок гельминтов, паразитов следует поместить в фиксатор (см. раздел 6) и направить на консультацию в базовые (головные в системах сертификации или СНЛК <*>) испытательные лаборатории (центры), аккредитованные в установленном порядке или в профильные научно-исследовательские институты.

--------------------------------

<*> СНЛК - сеть наблюдения и лабораторного контроля.

4.1.1. Цестоды, заражение человека которыми происходит при употреблении в пищу необеззараженной рыбной продукции, относятся к семейству Diphyllobothriidae.

В пресноводных, проходных и морских рыбах, а также земноводных и пресмыкающихся паразитирует личиночная стадия лентецов - плероцеркоид, имеющий вид нерасчлененного мягкого червя (складки на теле могут создавать вид ложной сегментации), слегка уплощенного в дорзо-вентральном направлении, молочно-белого или кремового цвета. Головной конец (сколекс) не имеет крючьев или других подобных образований, но имеет две щелевидные присоски (ботрии) - органы прикрепления. Длина тела личинки колеблется от 1 - 2 мм до 10 и более сантиметров. Установить наличие у личинки сколекса с ботриями необходимо, так как за плероцеркоида могут быть приняты их фрагменты или фрагменты других цестод.

У живых, только что извлеченных из свежей рыбы плероцеркоидов, сколекс втянут (инвагинирован) или частично втянут, но при помещении их в теплую воду сколекс вытягивается, то сокращаясь, то расслабляясь. На вытянутом сколексе становятся заметными ботрии.

4.1.2. Половозрелые формы гельминтов p. Diphyllobothrium встречаются в кишечнике морских и наземных млекопитающих, рыбоядных птиц. У человека могут паразитировать Diphyllobothrium latum, Diphyllobothrium dendriticum и Diphyllobothrium luxi (D. klebanovskii). Diphyllobothrium ditremum - паразит рыбоядных птиц - также может приживаться у человека, но половой зрелости не достигает и яиц не выделяет, медицинское значение его невелико. Отмечаются случаи паразитирования у человека лентецов рода Dyplogonoporus (D. fukuokaensis зарегистрирован у человека в Японии), заражение которыми происходит от необеззараженных морских и проходных рыб. Плероцеркоиды рода Dyplogonoporus морфологически сходны с таковыми рода Diphyllobothrium.

Случаи спарганоза человека, вызываемого Spirometra erinaceieuropaei, встречаются спорадически в России и странах Юго-Восточной Азии, реже на других континентах (в Австралии и Америке распространены другие виды Spirometra). Плероцеркоиды (спарганумы) рода Spirometra у человека не развиваются до взрослой стадии. Их окончательные хозяева - домашние и дикие плотоядные (сем. Собачьи, Кошачьи).

4.1.3. При определении видов плероцеркоидов используют морфологические признаки, характер локализации личинок (капсул с личинками), состав дополнительных хозяев, географическое распространение (см. табл. 1, рис. 1 - 5 - здесь и далее рисунки не приводятся).

Кроме того, при исследовании свежей и охлажденной рыбы имеет значение такой признак как срок выживания личинок в пресной воде. Так, развитые плероцеркоиды Diphyllobothrium latum и Diphyllobothrium luxi (D. klebanovskii) выживают в воде около суток и более, Diphyllobothrium dendriticum - до 2,5 ч (мелкие - не более 1 ч), а Diphyllobothrium ditremum (по локализации инкапсулированных личинок сходного с Diphyllobothrium dendriticum) - не более 10 мин.

Спарганумы Spirometra erinacei-europaei с неповрежденным тегументом выживают в водопроводной воде более суток, в физиологическом растворе - до 8 - 13 дней.

4.2.1. Трематоды - наиболее распространенные паразиты морских и пресноводных рыб. Подавляющее их большинство не опасно для здоровья человека. Метацеркарии трематод - возбудители заболеваний человека - относятся к 5 семействам: Opisthorchidae, Heterophyidae, Nanophyetidae, Echinostomatidae и Paragonimidae.

При определении семейства и вида трематод в первую очередь ориентируются на размер и форму цисты, характер ее оболочек; положение личинки в цисте (подвижность <*>) и ее строение, в т.ч. размер, цвет и форму экскреторного пузыря; круг дополнительных хозяев и локализацию в теле рыбы или ракообразных (см. табл. 2, 3). Все опасные для здоровья человека метацеркарии, встречающиеся в рыбе, заключены в цисты. Размеры цист не превышают 1 мм. Поэтому обнаруженные в рыбе более крупные или свободные, не инцистированные метацеркарии не нуждаются в дальнейшем исследовании.

--------------------------------

<*> В тех случаях, когда для метацеркарии характерна подвижность внутри цисты, ее можно наблюдать не только в свежевыловленной рыбе, но и в течение нескольких дней после. Подвижность может восстанавливаться и после промораживания рыбной продукции, недостаточного по времени для гибели личинки, при повышении температуры до 37 °C.

--------------------------------

<*> Наружный слой тонкий (0,004 мм), сильно преломляющий свет, средний слой имеет характерные утолщения у противоположных полюсов.

Метацеркарии сем. Paragonimidae могут быть как в цистах, так и свободными.

Определение трематод до вида по строению цисты возможно только при достаточном навыке исследователя. В противном случае для уточнения видовой принадлежности трематод целесообразно извлечь метацеркарию из цисты.

Тщательно отделенную от окружающих тканей цисту помещают на стекло в каплю воды или физиологического раствора. Оболочку ее разрывают тонкими иглами (лучше энтомологическими булавками N 00) или легким надавливанием покровного стекла. Если при этом личинка сама не выходит из цисты, то ее вымывают водой из пипетки. Выход метацеркарий из цист можно стимулировать, воздействуя дуоденальным содержимым человека или животных, или трипсином (см. п. 5.3.1).

По морфологии выделенных из цист личинок во многом можно судить о строении взрослых трематод. Ротовое отверстие у метацеркарий трематод всех пяти семейств расположено на переднем конце, окружено ротовой присоской. Передний конец тела не несет каких-либо выростов или боковых присосок. Брюшная присоска более или менее выражена. Орган Брандеса позади брюшной присоски отсутствует. Кишечник с бифуркацией. Ветви кишечника без ответвлений.

Дальнейшее определение метацеркарий, имеющих вышеперечисленные признаки, проводят следующим образом:

4.2.3. К сем. Heterophyidae относятся мелкие трематоды с телом, покрытым чешуеобразными шипиками, число которых уменьшается к заднему концу. Присоски слабо развиты. У видов, имеющих медицинское значение ротовая присоска без шипов. Зачатки семенников в заднем конце тела, обычно на одном горизонтальном уровне или слегка наискось. На брюшной стороне имеется более или менее сильно развитая впадина - генитальный синус, в котором бывает скрыта редуцированная брюшная присоска. Имеется половая присоска, которая часто объединяется с брюшной в общий комплекс.

Обычно паразиты кишечника рыбоядных птиц и млекопитающих. Случаи заражения человека Heterophyes heterophyes описаны в Японии, Индии, Палестине, Египте, Тунисе. Заболевания человека, вызванные паразитированием Metagonimus yokogawai, регистрируются только в странах Юго-Восточной Азии и южной части Дальнего Востока РФ, в то время как в Европейско-Кавказской части ареала трематода обнаружена лишь у млекопитающих и птиц.

4.2.4. К сем. Nanophyetidae относятся маленькие грушевидные или удлиненные трематоды. Ротовая присоска субтерминальна, хорошо развита. Глотка имеется. Пищевод очень короткий, кишечник различной длины (ветви не переходят за уровень заднего края зачатков семенников). Брюшная присоска в средней трети тела. Зачатки семенников симметрично лежат в задней части тела. Выделительный пузырь мешковидный. Паразиты кишечника человека, рыбоядных млекопитающих и птиц (Nanophyetus salmincola) (рис. 17).

4.2.5. У трематод сем. Echinostomatidae передний конец тела образует особый воротничок (адоральный диск), окружающий ротовую присоску и несущий по краю одинарный или двойной ряд крупных шипов, число и расположение которых определенно для отдельных родов и видов. Определение связано с трудностями, так как на первых этапах развития (10 - 12 дней) личинки не имеют адорального диска. Половозрелые черви p. Echinochasmus - паразиты кишечника рыбоядных птиц. Описаны случаи заражения человека Echinochasmus perfoliatus (рис. 18).

4.2.6. Тело эксцистированной метацеркарии сем. Paragonimidae удлиненно-овальной формы. В живом виде метацеркария способна сильно вытягиваться и сокращаться. Тегумент вооружен густыми рядами шипиков, величина которых уменьшается к заднему концу. Присоски развиты слабо, одинакового размера, в ротовой почти всегда имеется стилет. Пищевод короткий, ветви кишечника достигают конца тела, все пространство между ними заполняет большой мешковидный черный (в проходящем свете) экскреторный пузырь. Впереди брюшной присоски располагаются разделенные на две группы 14 крупных железистых клеток (рис. 19 - 22).

В табл. 3 приведены диагностические признаки метацеркарий парагонимид, достоверно зарегистрированных в качестве возбудителей разных форм парагонимоза у человека. Тем не менее, нужно считать, что потенциальное медицинское значение имеют все виды парагонимид: одни вызывают типичный легочный парагонимоз, другие дают больший процент атипичных локализаций, а третьи не развиваются в человеке до стадии мариты, а используют его как резервуарного хозяина.

4.3.1. Нематоды, заражение которыми происходит через рыбную продукцию, относятся к разным систематическим группам и разнообразны по морфологическому строению. Общие систематические признаки: удлиненная и веретенообразная форма; наличие кутикулы; хорошо развитая пищеварительная система; раздельная половая система - непарная у самцов, парная у самок (на стадии личинки они различаются в основном по форме хвостового конца); развитие с 4 линьками и 5 стадиями. Жизненный цикл идет с участием одного или двух промежуточных хозяев, часто и резервуарного хозяина, в которых обычно встречаются личинки II, III, иногда IV стадии. Инвазионными для человека являются личинки III и IV стадии.

Размеры личинок, характер вооружения головного конца, строение пищеварительной системы используются в систематике нематод для дифференциальной диагностики (табл. 4).

4.3.2. К сем. Dioctophymidae относятся нематоды с простым головным концом (без мышечной присоски). Кутикула поперечно исчерчена. Dioctophyme renale - во взрослом состоянии паразиты почек диких и домашних животных, редко человека. Промежуточные хозяева - олигохеты, роль резервуарных хозяев выполняют земноводные и рыбы, в которых развитие не идет - личинки остаются на III стадии (рис. 24). Отмечены случаи заражения человека диоктофимидами Eustrongylides excisus. Обычно это паразиты желудка водоплавающих птиц. В рыбах, играющих роль второго промежуточного или резервуарного хозяина, встречаются на III и IV стадии развития. У рыб семейства осетровых при определенных условиях Eustrongylides excisus могут развиваться до половозрелой стадии. В этом случае опасности для человека они не представляют.

4.3.3. К сем. Gnathostomatidae относятся нематоды с 4 - 6 одноядерными пищеводными железами. Пищевод состоит из мышечного и железистого отделов. Губы (псевдолабии) большие трехлопастные или куполообразные.

Личинки Echinocephalus sinensis (рис. 25) и Echinocephalus sp. представляют потенциальную угрозу для здоровья человека. В эксперименте заражаются котята и макаки-резусы: личинки III стадии проникают через стенки желудка, толстого и тонкого кишечника. Заражение человека возможно при употреблении в пищу сырых (или не проваренных) съедобных морских моллюсков. Нельзя исключать как фактор заражения и морских черепах, в кишечнике и желудке которых встречаются личинки IV стадии. Облигатные окончательные хозяева - морские скаты.

Представители сем. Gnathostomatidae паразитируют у человека, но до половозрелой стадии не развиваются. Окончательные хозяева - кошка, собака, свинья, реже корова. Резервуарные хозяева - земноводные, пресмыкающиеся, рыбы. Живые личинки Gnathostoma hispidum (рис. 26) и Gnathostoma spinigerum содержат кроваво-красную полостную жидкость.

4.3.4. Наиболее распространенными паразитами почти всех видов морских, проходных, полупроходных рыб, а также некоторых пресноводных рыб, экологически связанных с опресненными зонами морей, являются личинки сем. Anisakidae III стадии (рис. 27 - 31). Тонкие личинки с более или менее выраженными губами вокруг ротового отверстия и сверлильным зубом. Кутикула гладкая, с нежными кольцевыми штрихами. Ротовая полость (стома) и глотка выражены слабо, а пищевод - хорошо. Для диагностики анизакисных личинок в качестве основных дифференциальных признаков следует использовать структуру переднего отдела пищеварительного тракта, величины отношений длины тела к длине пищевода, длины тела к длине желудочка, а также положение экскреторной поры.

Хозяинная (гостальная) специфичность ко II промежуточным хозяевам отсутствует или выражена слабо. Ими обычно являются мелкие рыбы, а резервуарными - крупные рыбы и головоногие моллюски (кальмары, осьминоги и каракатицы), в которых накапливаются личинки 3-ей стадии. Последняя линька происходит в позвоночных - окончательных хозяевах (ластоногих и китообразных).

У съедобных двустворчатых морских моллюсков и морских черепах встречаются личинки Sulcascaris sulcata (рис. 31). В настоящее время эта нематода не рассматривается как представляющая угрозу для здоровья человека. Однако наличие у нее гиперпаразитов (Urosporidium spisuli) практически в 100% случаев и то, что устриц и гребешков едят как вареными, так и сырыми, требует выбраковывания моллюсков с нематодами из эстетических соображений (портится товарный вид). Проблема анизакидозов человека особенно существенна для Японии, Кореи, США, Великобритании, Франции, Нидерландов, стран Скандинавии, прибрежных районов России (Тихоокеанское побережье, побережье северных морей, Балтийское и Каспийское моря), где в пищу употребляют сырую или слабо обработанную кулинарно, т.е. необеззараженную морскую рыбу. Диагностика заболевания у человека затруднена, так как паразит не развивается до половой зрелости. В связи с этим, необходима тщательная паразитологическая экспертиза морской рыбы.

Возможно заражение человека скребнями, относящимися к сем. Polymorphidae (p. Corynosoma и p. Bolbosoma). Во взрослом состоянии они паразитируют в кишечнике у морских млекопитающих и рыбоядных птиц. Рыба может быть как резервуарным, так и окончательным хозяином у разных видов скребней. В резервуарном хозяине личинка мигрирует из кишечника в полость тела, потом в другие органы и мышцы, где инцистируется, и остается на стадии личинки - акантеллы. Для личинки (как и для зрелых) скребней характерно наличие на переднем конце тела хоботка, вооруженного загнутыми назад крючками. У личинки, находящейся в рыбе, хоботок обычно ввернут внутрь и выворачивается наружу при помещении ее в воду или при попадании в окончательного хозяина. Акантеллы локализуются у рыб в полости тела, внутренних органах и тканях (брыжейка, гонады, печень, почки, серозные покровы желудка и кишечника, мышцы). Личинки в прозрачных капсулах.

4.4.1. P. Corynosoma. Виды этого рода распространены в разных районах Мирового океана, во всех морях, омывающих Россию, а также в Каспийском море и Ладожском озере, реках, впадающих в них.

Второй промежуточный хозяин - различные морские, проходные, а также пресноводные рыбы, обитающие в нижнем течении рек и в некоторых континентальных водоемах (лососевые, корюшковые, сельдевые, тресковые, мерлузовые, нототениевые, белокровные, терпуговые, камбаловые), и миноги. Обычны акантеллы p. Corynosoma и для осетровых Каспийского моря.

Наиболее часто заражены придонные рыбы.

Размер капсул с личинками 2 - 4 мм. Тело личинки грушевидной формы, расширенное к передней части, длиной до 10 мм. Поверхность передней части личинки покрыта шипами: более крупными, расположенными в шахматном порядке, - в первой трети тела и более мелкими, расположенными хаотично, - в остальной части. Хоботок почти цилиндрический, слегка расширяющийся в середине. У C. strumosum (рис. 6) на хоботке 18 продольных рядов крючьев по 10 - 12 в каждом ряду. Тело 3,5 - 9 мм длиной, шириной до 1,5 мм. У C. semerse на хоботке 22 - 24 продольных рядов крючьев, длина личинки до 5 мм.

Половозрелые формы - паразиты кишечника морских млекопитающих и рыбоядных птиц.

4.4.2. P. Bolbosoma. Акантеллы болбозом встречаются в полости тела и на внутренних органах у скумбриевых рыб в Сев. Атлантике; мерлузовых, волосохвостых в Южной Атлантике; у лососевых, скарпеновых, бериксовых, гемпиловых и скумбриевых в Тихом океане.

У B. caenoforme тело личинки обычно цилиндрическое, но в передней части образует бульбусовидное расширение, передняя часть которого вооружена шипами. Акантеллы размером 7 - 12 х 0,9 - 1,2 мм. Живые личинки розовато-красноватого цвета. На цилиндрическом хоботке 18 продольных рядов крючьев по 6 в каждом ряду.

Половозрелые формы локализуются в кишечнике морских млекопитающих.

При обнаружении личинок в рыбной продукции, в том числе при оценке эффективности ее обеззараживания, необходимо определить их жизнеспособность.

Необходимые реактивы и оборудование:

1. Химические реактивы: физиологический раствор.

2. Предметные стекла.

3. Покровные стекла.

4. Чашки Петри.

5. Часовые стекла.

6. Колба (0,1 - 0,2 л).

7. Пробирки.

8. Пинцеты глазные.

9. Спиртовка.

10. Спиртовой термометр для воды.

11. Препаровальные иглы разной толщины.

12. Бинокулярный микроскоп типа МБС.

13. Лупа.

14. Осветитель для бинокуляра любой марки.

15. Световой микроскоп типа Биолам, Бимам.

16. Осветитель к микроскопу любой марки.

5.1.1. Личинок цестод, нематод и скребней помещают в чашку Петри или часовое стекло с подогретым физиологическим раствором (37 - 40 °C) и рассматривают под бинокулярной лупой (микроскопом типа МБС) при увеличении, соответствующем размеру личинки или ее рассматриваемой части. Инцистированных личинок извлекают из оболочек. Живые личинки могут не проявлять признаков активности. Их движения можно стимулировать с помощью физического раздражения, уколов личинку острой препаровальной иглой. У живой личинки уколы вызывают сокращение тела. Личинок анизакид (в физиологическом растворе) помещают на 2 ч в термостат с t = 37 °C. Изменение цвета, отслоение покровов, другие деструктивные изменения тела указывают на нежизнеспособность личинок. Если видимых изменений нет, но и признаков жизни обнаружить не удается, то применяют метод химического воздействия (п. 5.3.2).

5.1.2. Метацеркарий трематод, выделенных из тканей рыбы (или ракообразных) с помощью препаровальной иглы, помещают в каплю теплой воды или физраствора (37 - 40 °C) на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и исследуют под малым и большим увеличением микроскопа. Явное нарушение целости оболочек цист, грубые изменения внутреннего строения личинки, распад ее содержимого, разрушение экскреторного пузыря являются признаками гибели метацеркарий.

Метацеркарии обладают способностью совершать движения, находясь в цисте. Наличие даже самых слабых самостоятельных движений личинки свидетельствует о ее жизнеспособности. Отсутствие движения еще не свидетельствует о гибели. Движение можно стимулировать слабым придавливанием метацеркарий покровным стеклом.

Необходимые реактивы и оборудование:

1. Химические реактивы: физиологический раствор или вода.

2. Большие предметные стекла (6 - 8 х 12 - 15 см, толщиной 2 - 4 мм).

3. Чашки Петри.

4. Пинцеты глазные.

5. Препаровальные иглы разной толщины.

6. Источник постоянного тока (батарейка с напряжением 1,5 В).

7. Тонкая проволока.

8. Фильтровальная бумага.

9. Бинокулярный микроскоп типа МБС.

10. Лупа.

11. Осветитель для бинокуляра любой марки.

5.2.1. Применим только к личинкам нематод, цестод и скребней. Личинок помещают на мокрую фильтровальную бумагу и воздействуют на них слабым постоянным электрическим током (0,5 - 1,5 В), пропускаемым через личинку. Для этого два тонких изолированных провода от положительного и отрицательного полюсов элемента (источника постоянного тока) проводятся к двум препаровальным иглам. Проявление сократительных движений контролируют под микроскопом типа МБС.

Необходимые реактивы и оборудование:

1. Химические реактивы: физиологический раствор; дуоденальное содержимое, полученное при зондировании человека, или желчь животных (аптечная); трипсин (0,5% раствор, приготовленный на физрастворе: 0,5 г трипсина растворяют в 100 мл физраствора).

2. Предметные стекла.

3. Покровные стекла.

4. Чашки Петри.

5. Часовые стекла.

6. Препаровальные иглы разной толщины.

7. Спиртовка.

8. Колба (0,1 - 0,2 л).

9. Пробирки.

10. Пинцеты глазные.

11. Спиртовой термометр для воды.

12. Бинокулярный микроскоп типа МБС.

13. Лупа.

14. Осветитель для бинокуляра любой марки.

15. Световой микроскоп типа Биолам, Бимам.

16. Осветитель к микроскопу любой марки.

17. Термостат.

5.3.1. Вызвать движение личинок можно, воздействуя дуоденальным содержимым, полученным при зондировании человека, либо желчью животных, либо трипсином. В основном метод применяют для определения жизнеспособности метацеркарий трематод.

На выделенных метацеркарий наносят несколько капель химического реагента так, чтобы полностью покрыть личинок. Для ускорения эксцистирования предметное (часовое) стекло с личинками можно слегка подогреть над пламенем спиртовки или внести предварительно подогретый до 37 - 40 °C трипсин (или желчь), либо поставить в термостат с t = 37 °C на 10 мин. Через несколько секунд под воздействием химического раздражителя начинается выход личинок из цист и их активное движение, что служит показателем жизнеспособности. Процесс эксцистирования личинок контролируют под микроскопом типа МБС.

Отсутствие в течение 30 мин. всякой двигательной реакции свидетельствует о гибели личинок.

5.3.2. Для определения жизнеспособности личинок нематод из рыбы (моллюсков), подвергнутых ранее замораживанию или холодному копчению, гельминтов инкубируют в термостате при t = 37 °C в физиологическом растворе или 0,5% растворе трипсина. Личинок инкубируют в течение трех дней, ежедневно проверяя их жизнеспособность.

5.3.3. Для определения жизнеспособности личинок гельминтов можно использовать метод переваривания рыбной продукции в искусственном желудочном соке (п. 3.2.11.4).

Необходимые реактивы и оборудование:

1. Люминесцентная лампа.

2. Столик с прозрачной верхней крышкой (размером не менее 40 х 40 см).

3. Защитные (синие) очки.

4. Большие предметные стекла (6 - 8 х 12 - 15 см, толщиной 2 - 4 мм).

5. Скальпель.

6. Пинцеты (хирургические и глазные).

7. Препаровальные иглы разной толщины.

5.4.1. Метод основан на способности живых и мертвых тканей многих животных флюоресцировать под воздействием ультрафиолетового света. Метод применим в основном к личинкам нематод.

5.4.2. Куски мышц рыбы (или кальмаров) или филе толщиной не более 2 см облучают ультрафиолетовым светом сначала с одной, а потом с другой стороны. При просмотре исследователь должен пользоваться защитными (синими) очками. Особенно интенсивно флюоресцируют мертвые гельминты в рыбопродукции, подвергнутой замораживанию. Характер свечения у разных видов неодинаков: личинки Anisakis имеют голубовато-белую флюоресценцию (бледную у живых и яркую у мертвых); личинки p. Conltracaecum - от бледной (у живых) до ярко желтой (у мертвых).

Необходимые реактивы и оборудование:

1. Химические реактивы: физиологический раствор; р-р метиленового синего (метиленовый синий - 0,05 г, натрий едкий - 0,5 г, молочная кислота - 15 мл); нейтральный красный (нейтраль-рот) в разведении 1:1000 (0,1 г нейтрального красного разводят в 100 мл дистиллированной воды); 0,3% р-р розоловой кислоты (аурина) (0,3 г розоловой кислоты растворяют в 100 мл 70° спирта); KOH (0,1 N раствор).

2. Предметные стекла.

3. Покровные стекла.

4. Чашки Петри.

5. Часовые стекла.

6. Пинцеты глазные.

7. Препаровальные иглы разной толщины.

8. Фильтровальная бумага.

9. Бинокулярный микроскоп типа МБС.

10. Лупа.

11. Осветитель для бинокуляра любой марки.

12. Световой микроскоп типа Биолам, Бимам.

13. Осветитель к микроскопу любой марки.

5.5.1. В зависимости от используемого красителя окрашиваются либо живые, либо мертвые гельминты.

5.5.2. Личинок нематод, цестод и скребней помещают в чашку Петри (или часовое стекло) с раствором метиленового синего. Мертвые личинки окрашиваются в синий цвет. Хорошо прокрашиваются нервные волокна и ядра клеток.

5.5.3. Живые плероцеркоиды окрашиваются водным раствором нейтраль-рота в течение 5 - 20 мин., приобретая стойкую розовую окраску. Для контроля личинок извлекают из краски, помещают в чистый физиологический раствор и в нем просматривают степень окрашивания. Мертвые личинки не получают стойкой окраски.

5.5.4. Для определения жизнеспособности метацеркарий трематод используют окрашивание раствором розоловой кислоты (аурина).

Кусочки мышц с личинками освобождают от жира. На ткань наносят 2 капли розоловой кислоты, а через 2 мин. - 0,1 N раствор KOH, равномерно распределяя его по ткани. Избыток жидкости с препарата снимают фильтровальной бумагой. Накрывают покровным стеклом и микроскопируют.

Ткань рыбы окрашивается в розовый цвет, живые личинки совершенно не окрашиваются, а мертвые становятся розовыми.

Необходимые реактивы и оборудование:

1. Химические реактивы: физиологический раствор.

2. Лабораторные животные (золотистые хомяки, белые мыши и крысы).

3. Предметные стекла.

4. Покровные стекла.

5. Большие предметные стекла (6 - 8 х 12 - 15 см, толщиной 2 - 4 мм).

6. Шприцы на 2 мл с канюлями.

7. Скальпели.

8. Чашки Петри.

9. Часовые стекла.

10. Пинцеты разных размеров (хирургические, анатомические).

11. Скальпели разных размеров.

12. Корнцанги.

13. Ножницы разных размеров.

14. Препаровальные иглы разной толщины.

15. Бинокулярный микроскоп типа МБС.

16. Лупа.

17. Осветитель для бинокуляра любой марки.

18. Световой микроскоп типа Биолам, Бимам.

19. Осветитель к микроскопу любой марки.

5.6.1. В некоторых случаях для окончательного заключения о виде гельминта, жизнеспособности и инвазионности личинок необходима биологическая проба - заражение лабораторных животных. Метод основан на способности большинства видов гельминтов, паразитирующих у человека, приживаться и у других млекопитающих. Наиболее удобным лабораторным животным для этой цели является золотистый хомяк. В некоторых случаях необходимо использовать других животных (котят, белых мышей и крыс).

5.6.2. Кусочки внутренних органов или мышц дополнительных (или резервуарных) хозяев с личинками скармливают лабораторным животным. Через определенное для каждого вида гельминта время (см. ниже) в фекалиях животного обнаруживают яйца паразита. Затем животное усыпляют (умерщвляют) и вскрывают методом неполного гельминтологического вскрытия. Обнаруженных гельминтов определяют до вида.

5.6.3. Цестоды.

5.6.3.1. Для дифиллоботриид в качестве лабораторных животных можно использовать золотистых хомяков, которым скармливают по 5 - 10 плероцеркоидов.

5.6.3.2. Яйца цестод могут быть обнаружены в фекалиях лабораторного животного через 2 - 3 недели для Diphyllobothrium latum и Diphyllobothrium luxi (D. klebanovskii), через 1 - 2 недели для Diphyllobothrium dendriticum. При заражении золотистых хомяков спарганумами Spirometra erinacei-europaei они остаются на личиночной стадии и яйца не выделяются.

5.6.3.3. При вскрытии животных половозрелые лентецы p. Diphyllobothrium могут быть обнаружены в тонком кишечнике, спарганумы спирометры - в полости тела, внутренних органах, подкожной клетчатке, мышцах. Для получения половозрелой спирометры можно заразить собаку или кошку. В этом случае яйца гельминта можно обнаружить через 12 - 15 дней у собак и через 10 - 14 - у кошек.

5.6.4. Трематоды.

5.6.4.1. Opisthorchis felineus, Metorchis bilis, Clonorchis sinensis, Nanophyetus salmincola приживаются у золотистых хомяков. В сомнительных случаях дифференциальной диагностики между Opisthorchis felineus и Pseudamphistomum truncatum заражают молочных котят, так как Pseudamphistomum truncatum не приживаются у хомяков. Metagonimus yokogawai, Metagonimus katsuradai, Rossicotrema donicum, Apophallus muehlingi также развиваются только у котят и щенят домашней собаки. Для заражения возбудителями парагонимоза наиболее часто используют лабораторных мышей и крыс.

5.6.4.2. Существуют два основных способа заражения животных метацеркариями.

Первый - заражение личинками, содержащимися в мышечной ткани рыбы (или ракообразных). Для этого исследуют рыбу компрессорным способом (п. 3.2.11.3)замечают местоположение цист и, глядя в микроскоп МБС (увеличение: окуляр 8х, объектив 2х), верхнее стекло осторожно сдвигают в сторону и препаровальными иглами выбирают кусочки ткани вместе с метацеркариями (стараясь их не повредить). Таким образом, набирают по 30 личинок и скармливают опытным животным (золотистым хомякам массой 40 - 70 г, молочным котятам и щенятам, белым крысам массой 70 - 90 г, белым мышам массой 18 - 25 г).

Второй способ заключается во введении через рот личинок, полученных в результате переваривания рыбы (или ракообразных) в искусственном желудочном соке (см. п. 3.2.11.4).

Метацеркарий отмывают в физиологическом растворе, подсчитывают и вводят в желудок животным с помощью шприца со специальной канюлей. Описторхид вводят в количестве 50 личинок на одну особь, а парагонимид - в количестве 20 экземпляров на особь.

5.6.4.3. Выделение яиц Opisthorchis felineus, Pseudamphistomum truncatum, Metorchis bilis, Clonorchis sinensis начинается через 20 - 25 суток после заражения. При вскрытии животных через 3 - 5 недель после заражения половозрелых трематод обнаруживают в желчных протоках печени, желчном пузыре и селезенке.

5.6.4.4. Выделение яиц Metagonimus yokogawai, Metagonimus katsuradai, Nanophyetus salmincola, Rossicotrema donicum, Apophallus muehlingi начинается на 11 - 16 сутки после заражения. При вскрытии животных гельминтов обнаруживают в тонком кишечнике.

5.6.4.5. Вскрытие животных после заражения метацеркариями парагонимид производят через 40 - 60 дней. В первую очередь исследуют легкие. Затем последовательно изучают все органы и ткани, в которых могут быть обнаружены личинки, в случае развития ларвального парагонимоза или парагонимоза с атипичной локализацией.

5.6.5. Нематоды. Лабораторным животным (лучше котятам и щенятам) скармливают (или вводят с помощью пинцета) кусочки рыбы с личинками в количестве 20 - 25 экземпляров. Через 3 - 6 дней животных убивают с последующим гельминтологическим обследованием желудка и кишечника.

Необходимые реактивы и оборудование:

1. Химические реактивы: этанол 96° (для получения 70° спирта к 100 мл 96° спирта добавить 37 мл воды, а для 80° - 20 мл воды); формалин (40% раствор формальдегида); физиологический раствор или раствор Рингера (хлористый натрий - 0,65 г, хлористый калий - 0,025 г, карбонат натрия - 0,02 г, двухлористый кальций - 0,03 г, бидистиллированная вода - 100 мл. Соли растворяют в указанном порядке. Кипятить нельзя); дистиллированная вода.

2. Предметные стекла.

3. Большие предметные стекла (6 - 8 х 12 - 15 см, толщиной 2 - 4 мм).

4. Чашки Петри.

5. Пробирки.

6. Весы с набором разновесов или весы электронные.

7. Шпатели (лопаточки) металлические, стеклянные, деревянные.

8. Воронки стеклянные разных размеров.

9. Мерные цилиндры (0,5 - 0,25 л).

10. Банки стеклянные с притертой пробкой для хранения реактивов (0,1, 0,25, 0,5 л).

11. Банки стеклянные (или колбы) для дистиллированной воды (1 - 2 л).

12. Набор стеклянных мерных пипеток (от 1 до 10 мл).

13. Пипетки стеклянные (пастеровские).

14. Резиновые груши.

15. Бюксы разных размеров.

16. Пенициллиновые пузырьки.

17. Пинцеты.

18. Препаровальные иглы разной толщины.

19. Фильтровальная бумага.

20. Спиртовка.

21. Спиртовой термометр для воды.

22. Вата, марля.

23. Бинокулярный микроскоп типа МБС.

24. Лупа.

25. Осветители для бинокуляра любой марки.

6.1. Для фиксации желательно брать живых личинок гельминтов. Перед фиксацией паразитов следует осторожно отделить от окружающих тканей (метацеркарий трематод и мелких личинок нематод предпочтительнее с помощью метода переваривания в искусственном желудочном соке - п. 3.2.11.4). Перед погружением в фиксирующую жидкость для отделения личинок от крови, слизи и других загрязнений, а также при необходимости их расправления личинок цестод и скребней следует поместить в воду, а личинок трематод и нематод в физиологический раствор или раствор Рингера на 15 - 30 мин.

6.2. Объем фиксатора должен превышать объем фиксируемого материала в 20 - 40 раз.

6.3. Личинок цестод, трематод, скребней и паразитов не установленной систематической принадлежности фиксируют в 70° спирте. Для того, чтобы хоботок у скребней и сколекс у цестод оставался в вывернутом состоянии, применяют способ осторожного, но достаточно сильного сдавливания червей между стеклами, подпуская пипеткой спирт 80° крепости. Избыток фиксирующей жидкости оттягивают фильтровальной бумагой со стороны, противоположной пипетке. Выдерживают 15 - 20 мин. Затем стекло осторожно приподнимают, и личинку переносят в 70° спирт.

Фиксированные в спирте, формалине и других фиксаторах метацеркарии трематод плохо сохраняют первоначальную структуру и не могут быть определены до вида. В связи с этим, допускается хранение пластинок из мышечной ткани с метацеркариями трематод в течение 7 - 10 дней при температуре 1 - 4 °C.

6.4. Личинок круглых червей рекомендуется фиксировать и хранить в жидкости Барбагалло (4% раствор формалина в физиологическом растворе). Чтобы тело личинки при фиксации не скручивалось, рекомендуется фиксация горячей (до 70 °C) жидкостью Барбагалло.

6.5. Хранят паразитов в пробирках с фиксатором, заткнутых плотным ватным тампоном. Пробирки вкладываются в банку с притертой пробкой, заполненную таким же фиксатором. Внутрь пробирки вкладывается этикетка, написанная карандашом Т, 2Т (или любым другим средством, нерастворимым в реактивах), обращенная надписью к стеклу. На этикетке указывается вид паразита, N исследований по журналу, дата, вид рыбы (рыбопродукта), из которых выделены паразиты, место отлова (или предприятие-производитель).

Небольшие гельминты достаточно долго хранятся в фиксаторе в пенициллиновых пузырьках с полиэтиленовой пробкой.

7.1. Результаты исследований вносятся в лабораторный журнал. В протоколе каждого вскрытия отмечаются следующие сведения:

номер вскрытия (или образца);

дата (доставки и исследования);

место отлова рыбы, моллюсков, ракообразных и т.д.: административная территория (конкретный биотоп), водоем (океан, море, река и т.п. и конкретное место вылова) или место изготовления продукции (предприятие-изготовитель);

место (фирма, предприятие) отбора проб;

какой организацией доставлена продукция, N направления;

видовое (родовое) название исследуемого экземпляра;

вид рыбной продукции (свежая, мороженая, филе, фарш, консервы и т.д.);

размер и масса (возраст) и количество пробы;

порядковый номер исследуемого экземпляра;

методы паразитологического исследования;

вид обнаруженных личинок и их число;

место локализации личинок (органы и ткани);

жизнеспособность личинок.

7.2. После проведения исследования необходимого числа (массы) экземпляров (см. СанПиН 3.2.569-96, п. 6.2, п. п. 15.12, 15.13) регистрируются следующие показатели:

зараженность или экстенсивность инвазии - число зараженных экземпляров рыб (продукции) в пробе, выраженная в процентах;

интенсивность инвазии - амплитуда интенсивности - минимальное и максимальное число паразитов в одной зараженной особи или рыбопродукте, средняя интенсивность инвазии - число личинок, приходящееся в среднем на одну зараженную рыбу (рыбопродукт);

индекс обилия - число паразитов, в среднем приходящееся на одну исследованную рыбу или рыбопродукт (не только зараженные) данного вида; вычисляется путем деления общего числа выявленных личинок данного вида на количество обследованных рыб;

среднее число паразитов на 1 кг массы (находится делением общего числа паразитов в выборке на общую массу выборки).

Чтобы облегчить подсчет выявленных при инспектировании паразитов, цифры зараженности каждой особи (интенсивность) записываются в виде рабочей таблицы, как показано в следующем примере:

Цифры правой вертикальной колонки получаются перемножением цифр соответствующего горизонтального ряда двух предшествующих колонок. Записывается также общая масса выборки: для нашего примера примем 30 кг.

Из сделанных записей определяются следующие показатели. Экстенсивность инвазии: (15 : 32 х 100) = 46,9%. Амплитуда интенсивности: от 0 до 23. Индекс обилия: (67 : 32) = 2,1 паразитов. Среднее число паразитов на 1 кг массы: (67 : 30) = 2,2. Последний показатель определяют и при обнаружении паразитов, не представляющих опасности для здоровья человека и сравнивают его с "допустимым средним числом паразитов на 1 кг массы" (К) (табл. 3 СанПиН 3.2.569-96, прилож. 3).

7.3. Результаты исследования оформляются в виде протокола.

8.1. Аппаратура и инструментарий

Весы лабораторные с набором разновесов (или весы электронные)

Иглы препаровальные разной толщины

Источник постоянного тока (батарейка с напряжением 1,5 В)

Корнцанги

Кюветы эмалированные

Ножницы медицинские

Лампа люминесцентная

Лупа

Микроскоп бинокулярный типа МБС

Микроскоп биологический типа Биолам, Бимам

Молоток деревянный

Окуляр-микрометр для светового микроскопа

Окуляр-микрометр для бинокулярного микроскопа

Объект-микрометр

Осветители к микроскопу типа ОИ-7, ОИ-9, ОИ-18, ОИ-19 или других марок

Очки защитные (синие)

Пинцеты медицинские

Сантиметр или линейка

Ситечки с ячеей 1 х 1 мм

Скальпель хирургический

Столик с прозрачной верхней крышкой (размером не менее 40 х 40 см)

Термостат

Холодильник бытовой электрический (или получаемый по импорту)

Шпатели (лопаточки) металлические, пластмассовые, деревянные

Электроплитка

8.2. Лабораторная посуда и материалы

Банки стеклянные с притертой пробкой для хранения реактивов (0,1, 0,25, 0,5 л)

Бумага фильтровальная

Бюксы разных размеров

Вата медицинская гигроскопическая

Воронки стеклянные разных размеров

Груши резиновые

Животные лабораторные (золотистые хомяки, белые мыши и крысы)

Кастрюли эмалированные

Карандаш по стеклу

Колбы номинальной вместимостью 200, 400, 1000, 1600 куб. см

Марля медицинская

Пипетки стеклянные (пастеровские)

Пипетки вместимостью 1 - 10 куб. см

Пробирки

Проволока

Пузырьки пенициллиновые

Спиртовка лабораторная стеклянная

Стекла предметные для микропрепаратов

Стекла предметные (6 - 8 х 12 - 15 см, толщиной 3 - 5 мм)

Стекла покровные для микропрепаратов

Стекла часовые

Термометр жидкостный (не ртутный)

Цилиндры мерные (0,5 - 0,25 л)

Чашки биологические (Петри)

Шприцы на 2 мл с канюлями

Химические стаканы

8.3. Реактивы

Глицерин

Вода дистиллированная

Желчь сухая или желчь нативная сельскохозяйственных животных

Калия гидроокись

Калий хлористый

Кальций двухлористый

Кислота соляная

Натрия гидроокись

Натрий хлористый

Натрий углекислый

Нейтральный красный (нейтраль-рот)

Метиленовый синий

Молочная кислота

Пепсин

Раствор физиологический

Розоловая кислота (аурин)

Спирт этиловый ректификованный

Трипсин

Формалин

Хлороформ

Эфир

1. Беэр С.А., Белякова Ю.В., Сидоров Е.Г. Методы изучения промежуточных хозяев возбудителя описторхоза. - Алма-Ата, 1987. - 85 с.

2. Быховская-Павловская И.Е. Паразитологическое исследование рыб. - Л., 1985. - 120 с.

3. Валовая М.А., Кавтарадзе Д.Н. Микротехника. Правила. Приемы. Искусство. Эксперимент. - М., 1993. - 240 с.

4. Карасев А.Б., Митенев В.К., Довгалев А.С., Сергиев В.П. Гельминты Баренцева моря, опасные для здоровья человека. - Мурманск, 1997. - 32 с.

5. Котельников Г.А. Гельминтологические исследования окружающей среды. - М., 1991. - 144 с.

6. Курочкин Ю.В. Трематоды фауны СССР. Парагонимиды. - М., 1987. - 150 с.

7. Определитель паразитов пресноводных рыб / Под ред. О.Н. Бауера. - Л., 1987. - Т. 3. - 583 с.

8. Подъяпольская В.П., Капустин В.Ф. Глистные болезни человека. - М., 1958.

9. Скрябин К.И. Трематоды животных и человека. - М., 1952. - Т. 1, 4, 6.

10. Disease of marine animals. // Editor Otto Kinne. - Hamburg, 1983. - V. II. - 571 p.

11. Disease of marine animals. // Editor Otto Kinne. - Hamburg, 1990. - V. III. - 696 p.

12. Disease of marine animals. // Editor Otto Kinne. - Hamburg, 1984. - V. IV. - Part 1. - 541 p.

13. Disease of marine animals. // Editor Otto Kinne. - Hamburg, 1985. - V. IV. - Part 2. - 341 p.

14. СанПиН 15-6/44, 1990. Санитарные правила по санитарно-гельминтологической экспертизе рыбы и условиям обеззараживания ее от личинок дифиллоботриид и описторхисов.

15. СанПиН 2.3.2.560-96. Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов.

16. СанПиН 3.2.569-96. Профилактика паразитарных болезней на территории Российской Федерации. Приложение 3. Профилактика гельминтозов, передающихся через рыбу, ракообразных, моллюсков, земноводных, пресмыкающихся и продукты их переработки.

17. СанПиН 2.3.4.050-96. Производство и реализация рыбной продукции.

18. ГОСТ 0001.8.1.0057, 08.12.93. Правила сертификации рыбы, рыбопродуктов и продуктов моря на соответствие требованиям безопасности.

19. Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения СССР. Утв. МЗ СССР 20 октября 1981 г. N 2455-81.

20. Методика паразитологического исследования морской рыбы и рыбной продукции (морская рыба-сырец, рыба охлажденная и мороженая). Утв. Минрыбхозом СССР 29.12.88. - М., 1989.

21. Правила по сертификации ПР 50.3.002-95. Типовой порядок обращения с образцами, используемыми для проведения обязательной сертификации продукции.

22. Санитарные правила 1.2.731-99. Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами.

23. ГОСТ 7631-85. Рыба, морские млекопитающие, морские беспозвоночные и продукты их переработки. Правила приемки, органолептические методы оценки качества, методы отбора проб для лабораторных испытаний.

24. Изменение N 2 к ГОСТу 7631-85. Рыба, морские млекопитающие, морские беспозвоночные и продукты их переработки. Утверждено Постановлением Госстандарта СССР от 25.10.89 N 3195.

25. ГОСТ Р 8.563-96. Методики выполнения измерений.

26. ГОСТ 7636-85. Рыба, морские млекопитающие, морские беспозвоночные и продукты их переработки. Методы анализа.

27. Система аккредитации лабораторий Государственной санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации. Утверждены и введены в действие Постановлением Госкомсанэпиднадзора России и Госстандарта России от 02.07.93 N 6/13.

28. Правила проведения сертификации пищевых продуктов и продовольственного сырья. Утв. Постановлением Госстандарта России от 28.04.99 N 21.

При разработке Методических указаний использованы материалы: Т.В. Безгачиной, М.Г. Карпинского (Всероссийский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии); Г.Н. Родюк, О.А. Шухгалтер (Атлантический научно-исследовательский институт морского рыбного хозяйства и океанографии); Л.В. Ларцевой, Л.И. Бисеровой (Каспийский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства); Г.П. Вяловой, В.В. Стексовой (Сахалинский научно-исследовательский институт морского рыбного хозяйства и океанографии); Т.Н. Цыбиной (ФЦГСЭН); В.Н. Железняка (ЦГСЭН в Химкинском районе МО).