"Методические указания по идентификации гамма-ГХЦГ, его изомеров (альфа-, бета- и дельта-ГХЦГ) и метаболитов (полихлорированных фенолов) в биологических жидкостях (крови), органах, тканях и субклеточных фракциях печени теплокровных животных методом тонкослойной хроматографии"
(утв. Минздравом СССР 03.01.1985 N 3194-85)

--------------------------------

<*> Разработаны В.Ф. Демченко, Е.И. Давидюк, М.А. Клисенко (ВНИИГИНТОКС).

Краткая характеристика препаратов приведена в таблице 9.

Принцип метода. Методика основана на тонкослойном хроматографическом определении -гексахлорциклогексана, его -, - и -изомеров и метаболитов при совместном присутствии в биологическом материале теплокровных.

Метрологическая характеристика метода приведена в таблице 10. Пределы обнаружения изомеров и метаболитов гексахлорциклогексана указаны в таблице 11.

Избирательность метода. Метод избирателен в присутствии ГХБ, ГХПК, ГПХ, 2,4'- и 4,4'-ДДТ, ДДД, ДДЭ и некоторых других ХОП.

Реактивы и растворы. Ацетон ч. н-Гексан ч. Спирт этиловый ректиф. 2-Феноксиэтанол ч. Аммиак водный 25-процентный ч. Пероксид водорода ч. Сульфат натрия безводный ч. (прокаленный). Хлорид натрия х.ч. Нитрат серебра х.ч.

Проявляющие реагенты. N 1: к раствору 0,5 г нитрата серебра в 5 мл дистиллированной воды добавляют 7 - 10 мл 25-процентного водного аммиака. Полученную смесь разбавляют ацетоном до 100 мл и перемешивают. Хранят в склянке темного стекла.

N 2: к раствору 0,1 г нитрата серебра в 1 мл дистиллированной воды добавляют 10 мл 2-феноксиэтанола, 190 мл ацетона, 1 - 2 капли пероксида водорода, тщательно перемешивают. Хранят в склянке темного стекла.

Стандартные растворы препаратов в н-гексане с концентрацией 100 и 10 мкг/мл хранят в холодильнике в посуде с пришлифованными пробками.

Отбор и хранение проб. Пробы отбирают в лабораторных условиях и сразу же помещают в испарительную камеру холодильника (хранят на льду не дольше 5 сут.).

Ход анализа. Экстракция. Существуют два способа экстракции препарата из проб крови.

1. Цельную кровь (1 - 5 мл) помещают в мерную пробирку на шлифе, приливают 3 - 5 мл н-гексана, перемешивают и далее экстрагируют на аппарате для встряхивания со средней интенсивностью в течение 5 - 7 мин.

После разделения слоев гексановый экстракт (верхний слой) отделяют с помощью пипетки, соединенной с резиновой грушей, и фильтруют через слой безводного сульфата натрия, помещенного в коническую воронку с подложкой из обезжиренной ваты. Экстракцию повторяют, экстракты объединяют.

Если образуется устойчивая эмульсия и фазы разделить трудно, в пробирку вносят несколько капель этанола или 0,1 - 0,2 г (на кончике скальпеля) хлорида натрия.

2. Пробу крови (1 - 5 мл) тщательно растирают с избыточным количеством безводного сульфата натрия (до сыпучего состояния). Помещают в плоскодонную колбу на шлифе и экстрагируют н-гексаном, взятым в 1,5-кратном по отношению к гомогенату объеме. Экстракт осторожно декантируют, дополнительно фильтруя через слой безводного сульфата натрия.

Пробу субклеточной фракции экстрагируют н-гексаном (см. способ 1 для крови). При образовании устойчивой эмульсии следует провести центрифугирование смеси при 3000 - 5000 об./мин. в течение 3 - 5 мин.

Гексановый экстракт отделяют и фильтруют через слой безводного сульфата натрия. Экстракцию повторяют, экстракты объединяют.

Навеску органов и тканей (печени, почек, сердца и др.) тщательно измельчают ножницами, затем помещают в тефлоновую пробирку, заливают н-гексаном (5 мл растворителя на 1 г пробы) и гомогенизируют на микроизмельчителе тканей при 3000 - 5000 об./мин. в течение 5 мин. Экстракт декантируют через слой безводного сульфата натрия в приемную колбу. Экстракцию повторяют, экстракты объединяют.

Концентрирование экстрактов проводят в вакууме на ротационном испарителе при температуре водяной бани 35 - 38 °C, затем в токе азота особой чистоты до объема 0,1 - 0,2 мл.

После хроматографирования (длина пробега растворителя 15 - 17 см) пластинку проветривают в горизонтальном положении, а затем обрабатывают одним из проявляющих реагентов с помощью пульверизатора, подключенного к воздушному компрессору.

Количественную оценку содержания изомеров ГХЦГ и полихлорированных фенолов в пробе проводят визуально или денситометрически на приборе типа "Оптон".

Оставшуюся часть экстракта при необходимости также подвергают хроматографированию после экспресс-очистки концентрированной серной кислотой.

К экстракту, количественно перенесенному в центрифужную пробирку, прибавляют 2 - 3 капли концентрированной серной кислоты, после чего содержимое встряхивают. После разделения фаз (через 5 - 7 мин.) экстракт наносят с помощью микропипетки на хроматографическую пластинку и далее поступают так же, как описано выше. В этом случае обнаруживаются все перечисленные компоненты, кроме 4-хлорфенола.

Обработка результатов анализа. Содержание -ГХЦГ, его изомеров и метаболитов в анализируемом объекте (X, мг/кг, мг/л) рассчитывают по формуле:

P - масса (объем) пробы, г (мл).

--------------------------------

<*> Без применения очистки экстракта серной кислотой.

Требования безопасности. Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями и токсичными веществами. Не допускать попадания полихлорированных фенолов на кожу!