"МУ 2.3.2.3388-16. 2.3.2. Гигиена. Гигиена питания. Продовольственное сырье и пищевые продукты. Медико-биологическая оценка безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения с комбинированными признаками. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 26.07.2016)

1. Разработаны ФГБУН "ФИЦ питания и биотехнологии" (Н.В. Тышко, Э.О. Садыкова, А.К. Голомидова, И.В. Гмошинский, А.А. Кочеткова, В.А. Саркисян, В.А. Тутельян); Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (А.Ю. Попова, И.В. Брагина); Российской академией наук (Г.Г. Онищенко); Институтом биоинженерии, ФГУ "ФИЦ Биотехнологии" РАН (К.Г. Скрябин, И.В. Яковлева, Б.Б. Кузнецов); МГУ им. М.В. Ломоносова (М.П. Кирпичников).

2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 3 августа 2016 г.

3. Введены впервые.

Появление генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения (ГМО) второго поколения, в том числе ГМО с комбинированными признаками, привело к необходимости формирования новых подходов к оценке безопасности и процедуры государственной регистрации таких ГМО в Российской Федерации. Анализ мирового опыта в данной области свидетельствует о необходимости дифференцирования набора исследований в зависимости от метода получения ГМО с комбинированными признаками: 1-й метод - "трансформационный" - новый ген (гены) методом генной инженерии вводят в геном уже существующего и зарегистрированного ранее ГМО; 2-й метод - "молекулярный" - геном растения-донора методом генной инженерии трансформируют с помощью вектора, содержащего два или более генов, отвечающих за новые признаки, или с помощью множественных векторов; 3-й метод - "гибридизационный" - два уже существующих ГМО используют в качестве родительских форм для получения гибрида методами традиционной селекции. Линии, полученные с помощью трансформационного и молекулярного методов, считаются новыми ГМО и подлежат регистрационным испытаниям в полном объеме. Линии, полученные с помощью гибридизации, рассматриваются в разных юрисдикциях по-разному: в США, Канаде, Австралии и Новой Зеландии - как продукт обычной селекции, не требующий регистрации при условии, что исходные ГМ-линии уже зарегистрированы; в странах Европейского Союза требуется регистрация каждого нового ГМО, полученного с использованием уже зарегистрированных родительских ГМ линий, однако, с точки зрения безопасности рассматриваются только возможные эффекты взаимодействия двух белков (генов), обеспечивающих проявление новых признаков. При регистрации ГМО с комбинированными признаками, полученных гибридизацией трех и более родительских линий (ГМО высокого порядка), автоматически считаются зарегистрированными все возможные комбинации, сформировавшиеся в результате генетической сегрегации таких ГМО (расщепления признаков в поколениях F1 и выше, в соответствии с законами Менделя). Например, при регистрации ГМО, полученного гибридизацией шести родительских линий, должны быть зарегистрированы все 63 возможных гибрида поколения F1, содержащие рекомбинантную ДНК. Подобный подход применяется в Европейском Союзе, Аргентине, Бразилии, Филиппинах, Парагвае, Уругвае и Японии.

На основании анализа отечественного и международного опыта были разработаны требования к оценке безопасности ГМО с комбинированными признаками, соответствующие принципам регулирования использования ГМО для пищевых целей.

1.1. Методические указания устанавливают требования к проведению оценки безопасности ГМО с комбинированными признаками.

1.2. Требования, изложенные в настоящих Методических указаниях, применяются на этапе государственной регистрации ГМО с комбинированными признаками, впервые поступающих на продовольственный рынок Российской Федерации.

1.3. Методические указания разработаны с целью обеспечения единой, научно обоснованной системы оценки безопасности ГМО с комбинированными признаками и учитывают новые методические подходы, как используемые в России, так и рекомендованные международными организациями.

2.1. Перечень и объем исследований при оценке безопасности ГМО с комбинированными признаками определяются с учетом следующих факторов:

- метода получения ГМО (трансформационный метод, молекулярный метод, гибридизационный метод);

- наличия государственной регистрации исходных ГМ-линий на территории Таможенного Союза - для ГМО, полученных гибридизационным методом.

2.2. В случае если ГМО с комбинированными признаками получен трансформационным или молекулярным методом, оценка его безопасности проводится в соответствии с разделами III - VII данных Методических указаний и включает в себя следующие этапы:

- экспертный анализ и оценку данных, представленных заявителем, содержащих сравнение химического состава ГМО и его традиционного аналога (композиционная эквивалентность), результаты токсикологических, аллергологических и других исследований, результаты пострегистрационного мониторинга в стране-заявителе и других странах;

- экспертную оценку методов обнаружения, идентификации и количественного определения ГМО;

- медико-генетическую оценку ГМО;

- оценку функционально-технологических свойств ГМО;

- медико-биологическую оценку безопасности ГМО.

2.3. В случае если ГМО с комбинированными признаками получен гибридизационным методом и исходные ГМ-линии имеют свидетельства о государственной регистрации на территории Таможенного Союза, оценка его безопасности проводится в соответствии с разделами III - IV данных Методических указаний и включает в себя следующие этапы:

- экспертный анализ и оценку данных, представленных заявителем или представленных на этапе регистрации исходных ГМ-линий (для ГМО, полученных гибридизационным методом, в случае, если все исходные ГМ-линии имеют свидетельства о государственной регистрации на территории Таможенного Союза), включающих: сравнение химического состава исходных ГМ-линий с химическим составом их традиционных аналогов (композиционная эквивалентность), результаты токсикологических, аллергологических и других исследований, результаты пострегистрационного мониторинга, осуществляемого в странах, где ГМО с комбинированными признаками был зарегистрирован ранее, в случае, если в процессе мониторинга были получены данные о незаданных эффектах генетической модификации;

- экспертная оценка методов обнаружения, идентификации и количественного определения ГМО;

- подтверждение соответствия показателей качества и безопасности ГМО (содержание токсичных элементов, микотоксинов, радионуклидов, пестицидов и др.) требованиям Технических регламентов Таможенного Союза (ТР ТС 021/2011 "О безопасности пищевой продукции" и/или соответствующих Технических регламентов, устанавливающих обязательные требования к отдельным видам пищевой продукции);

- заключение о результатах оценки безопасности ГМО с комбинированными признаками, оформленное в виде отчета в соответствии с требованиями Межгосударственного стандарта ГОСТ 7.32-2001. При формировании отчета должны быть соблюдены требования к конфиденциальности информации, предоставленной на этапе регистрации исходных ГМ-линий.

2.4. Регистрация ГМО с комбинированными признаками, полученного методом гибридизации трех и более линий, уже зарегистрированных на территории Таможенного союза, означает регистрацию и всех возможных комбинаций этих линий, сформировавшихся в результате генетической сегрегации (расщепления признаков в поколениях F1 и выше, в соответствии с законами Менделя).

2.5. В случае если ГМО с комбинированными признаками получен гибридизационным методом и одна или несколько исходных ГМ-линий не имеют свидетельства о государственной регистрации на территории Таможенного Союза, оценка безопасности такого ГМО проводится в полном объеме, в соответствии с п. 2.2 данных Методических указаний.

2.6. Для проведения исследований, предусмотренных п. 2.2 и 2.3 настоящих Методических указаний, заявитель представляет в аккредитованную лабораторию образцы ГМО и их традиционных аналогов в количестве, достаточном для выполнения полного объема исследований.

3.1. Общая характеристика ГМО с комбинированными признаками включает экспертный анализ данных, представленных заявителем или представленных на этапе регистрации исходных ГМ-линий (для ГМО, полученных гибридизационным методом, в случае, если все исходные ГМ-линии имеют свидетельства о государственной регистрации на территории Таможенного Союза), включающих:

- информацию, позволяющую идентифицировать ГМО (вид, сорт, событие, исходные ГМ-линии, характеристика отличий от немодифицированного организма);

- информацию об исходном организме (таксономическая характеристика, описание способа размножения и распространения, данные о токсических, аллергенных и других неблагоприятных свойствах);

- информацию об организмах-донорах вносимых генов (таксономическая характеристика, история использования);

- информацию о методах генетических модификаций и способах получения ГМО и исходных ГМ-линий (описание методов модификаций, структур векторов, структур вставок);

- информацию о ГМО и исходных ГМ-линиях (описание свойств, приобретенных растениями в результате модификаций, описание структур встроенных генетических конструкций и мест их локализации, характеристику экспрессии встроенных генов (экспрессия в процессе онтогенеза растения, экспрессия в структурных компонентах растения и др.);

- информацию о потенциально возможном взаимодействии встроенных генетических элементов и белков-продуктов генов (при наличии такой информации), а также результатах их взаимодействия.

3.1.1. Для ГМО, полученных молекулярным, трансформационным или гибридизационным (если одна или несколько исходных ГМ-линий не имеют свидетельства о государственной регистрации на территории Таможенного Союза) методами, дополнительно должны быть проанализированы данные о генетической и фенотипической стабильности (должны быть представлены данные, полученные в результате исследований нескольких поколений ГМО).

3.2. Оценка композиционной эквивалентности проводится на основании информации о результатах сравнения химического состава ГМО с химическим составом его традиционного аналога, представленной заявителем. Для ГМО, полученных гибридизационным методом (если все исходные ГМ-линии имеют свидетельства о государственной регистрации на территории Таможенного Союза), оценка композиционной эквивалентности производится на основании информации о результатах сравнения химического состава исходных ГМ-линий с химическим составом их традиционных аналогов, представленной на этапе регистрации исходных ГМ-линий.

3.2.1. Оценка композиционной эквивалентности проводится по следующим параметрам:

- содержание белка;

- аминокислотный состав;

- содержание жира;

- жирнокислотный состав;

- содержание углеводов;

- содержание макро- и микроэлементов;

- содержание биологически активных веществ;

- содержание аллергенов, характерных для исходного вида (сорта);

- содержание антропогенных и природных контаминантов (токсичных элементов, микотоксинов, пестицидов, радионуклидов, вредных примесей и др.);

- содержание антинутриентов и других веществ, характерных для растительных организмов исходного вида (сорта).

3.2.2. Перечень показателей варьируется в зависимости от свойств изучаемого растительного организма.

3.2.3. Оценка композиционной эквивалентности ГМО и его традиционного аналога проводится с учетом биологических колебаний значений показателей, характерных для растений данного вида, и справочных данных о химическом составе исходного вида (сорта) растения.

3.2.4. В случае если целью генетической модификации является изменение нутриентного состава растения или его частей (листьев, плодов и др.), этот фактор необходимо учитывать при оценке композиционной эквивалентности.

3.3. Анализ результатов токсикологических исследований проводится на основании сведений, представленных заявителем или представленных на этапе регистрации исходных ГМ-линий (для ГМО, полученных гибридизационным методом, в случае, если все исходные ГМ-линии имеют свидетельства о государственной регистрации на территории Таможенного Союза), включающих:

- результаты оценки безопасности белков, определяющих проявление заданных признаков ГМО (молекулярная и биохимическая характеристика белков; наличие или отсутствие гомологии с токсинами белковой природы, а также с белками, обладающими фармакологической или иной биологической активностью (при использовании баз данных PIR, EMBL, SwissProt, GenBank и др.); изучение стабильности белков при обработке, хранении, технологической переработке; влияние температуры и pH, возможные модификации и/или образование стабильных белковых фрагментов в результате различных воздействий; устойчивость белков к обработке протеолитическими ферментами в эксперименте in vitro; исследования острой пероральной токсичности белков в эксперименте на грызунах и др.);

- результаты оценки безопасности нативного продукта (данные 90-дневных исследований на грызунах, данные исследований на молодых быстро растущих животных (цыплятах-бройлерах, ягнятах и др.) в случае, если такие исследования проводились;

- результаты других токсикологических исследований.

3.4. Анализ результатов аллергологических исследований проводится на основании сведений, представленных заявителем или представленных на этапе регистрации исходных ГМ-линий (для ГМО, полученных гибридизационным методом, в случае, если все исходные ГМ-линии имеют свидетельства о государственной регистрации на территории Таможенного Союза), включающих:

- результаты оценки аллергенных свойств белков, определяющих проявление заданных признаков ГМО (сравнение с известными аллергенами с использованием баз данных, содержащих информацию о трехмерной структуре и функции известных аллергенов и родственных им белков); определение потенциальной аллергенности белков в иммунохимических исследованиях in vitro с использованием IgE, выделенных из сыворотки крови пациентов, страдающих аллергией; определение устойчивости к воздействию протеолитических ферментов (пепсина и др.); скрининговые исследования с использованием сывороток крови пациентов, страдающих аллергией; дополнительные исследования (в том числе in vivo);

- результаты аллергологических исследований нативного продукта (сравнение набора аллергенов исследуемого ГМО с набором аллергенов его традиционного аналога и др.) в случае, если такие исследования проводились;

- результаты других аллергологических исследований.

3.5. Анализ результатов других исследований (в случае, если такие исследования были выполнены) проводится на основании сведений, представленных заявителем, или представленных на этапе регистрации исходных ГМ-линий, включая результаты применения новейших аналитических методов, таких как профильные технологии и др.

3.6. Анализ результатов пострегистрационного мониторинга, осуществляемого в странах, где ГМО был зарегистрирован ранее, проводится в случае, если в процессе мониторинга были получены данные о незаданных эффектах генетической модификации.

3.7. Анализ научных данных о ГМО с комбинированными признаками, представленных в научной литературе за весь период его использования; анализ научных данных об исходных ГМ-линиях за период, прошедший после их первичной регистрации.

4.1. Основным методом, используемым для обнаружения, идентификации и количественного определения ГМО, является полимеразная цепная реакция (ПЦР) и ее модификации. Также для обнаружения ГМО в пищевых продуктах и продовольственном сырье, не подвергавшихся технологической переработке, могут быть использованы иммунологические методы детекции специфичных для ГМО белков.

4.2. Экспертная оценка методов идентификации ГМО с комбинированными признаками направлена на подтверждение их адекватности инструментальной и методической базе, используемой в учреждениях Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека для контроля за обращением ГМО и маркировкой пищевых продуктов, содержащих ГМО.

4.3. Экспертная оценка методов обнаружения, идентификации и количественного определения ГМО с комбинированными признаками в пищевых продуктах проводится на основании сведений, представленных заявителем, включающих:

- метод идентификации одного или нескольких трансформационных событий (событие-специфичные тест-системы);

- метод количественного определения одного или нескольких трансформационных событий (событие-специфичные тест-системы);

- протоколы проведения анализов;

- описание праймеров, ДНК-зондов и других необходимых реактивов;

- стандартные образцы состава и свойств.

4.4. Экспертная оценка методов обнаружения, идентификации и количественного определения ГМО, полученных гибридизационным методом (если все исходные ГМ-линии имеют свидетельства о государственной регистрации на территории Таможенного Союза) производится только в случае, если методы обнаружения, идентификации и количественного определения зарегистрированных исходных ГМ-линий с момента их регистрации были модифицированы, усовершенствованы или разработаны вновь.

4.4.1. Идентификация ГМО с комбинированными признаками, полученных гибридизационным методом, сложна по сравнению с идентификацией ГМО, полученных молекулярным и трансформационным методами, поскольку вставки рекомбинантной ДНК и их локализация в геноме гибридизационного события идентичны исходным ГМ-линиям. Результаты ПЦР-анализа таких ГМО укажут на присутствие в образце родительских линий ГМО, как если бы образец содержал их смесь, что делает возможной идентификацию ГМО, полученных гибридизационным методом, только на основании экспертизы документации.

5.1. Медико-генетическая оценка ГМО с комбинированными признаками включает проверку присутствия всех заявленных генетических конструкций методом ПЦР.

5.2. Медико-генетические исследования проводятся на основании сведений, представленных заявителем, включающих:

- описание молекулярной структуры всех заявленных генетических конструкций (нуклеотидная последовательность);

- метод идентификации и количественного определения одного или нескольких трансформационных событий;

- протокол проведения анализа;

- описание праймеров, ДНК-зондов и других необходимых реактивов;

- стандартные образцы состава и свойств.

5.3. Заключение о результатах медико-генетической оценки ГМО с комбинированными признаками оформляется в виде отчета в соответствии с требованиями Межгосударственного стандарта ГОСТ 7.32-2001.

6.1. Перечень и объем исследований по разделу VI определяются экспертными (учеными) советами соответствующих аккредитованных испытательных центров Российской Федерации на основании анализа представленных материалов, индивидуально для каждого вида исследуемых продуктов.

6.2. Проводится сравнение функционально-технологических свойств ГМО со свойствами его традиционного аналога. Для ГМО, полученного гибридизационным методом, проводится сравнение его функционально-технологических свойств со свойствами традиционных аналогов исходных ГМ-линий.

6.3. Изучаемые функционально-технологические свойства (в соответствии со стандартами на конкретный вид исследуемых продуктов):

- сравнительная органолептическая оценка;

- сравнительная характеристика реологических свойств исследуемого продукта и/или его отдельных фракций;

- сравнительная оценка физико-химических свойств исследуемого продукта и/или его отдельных фракций.

6.4. Заключение о результатах оценки функционально-технологических свойств ГМО с комбинированными признаками оформляется в виде отчета в соответствии с требованиями Межгосударственного стандарта ГОСТ 7.32-2001.

7.1. Перечень и объем исследований по разделу VII определяются экспертными (учеными) советами соответствующих аккредитованных испытательных центров Российской Федерации на основании анализа представленных материалов.

7.2. Гигиенические исследования ГМО с комбинированными признаками включают определение показателей качества и безопасности:

7.2.1. Перечень показателей безопасности формируется на основании требований Технических регламентов Таможенного Союза (ТР ТС 021/2011 "О безопасности пищевой продукции" и/или соответствующих Технических регламентов, устанавливающих обязательные требования к отдельным видам пищевой продукции).

Изучаемые показатели:

- содержание токсичных элементов;

- содержание микотоксинов;

- содержание пестицидов;

- содержание радионуклидов;

- содержание вредных примесей;

- микробиологические показатели;

- другие показатели (в случае необходимости).

7.2.2. Перечень показателей качества формируется на основании свойств соответствующего растительного организма, а также анализа представленных заявителем материалов. В случае если заявителем представлены исчерпывающие данные по оценке композиционной эквивалентности ГМО (содержание белка, аминокислотный состав, содержание жира, жирнокислотный состав, углеводный состав, содержание витаминов, макро- и микроэлементов, специфических компонентов, биологически активных веществ, антинутриентов и других веществ, характерных для растений данного вида), исследования могут быть ограничены определением влажности, золы, содержания белка, жира, углеводов, пищевых волокон.

7.2.3. В случае если генетическая модификация направлена на изменение химического состава ГМО с комбинированными признаками, должны быть проведены исследования, подтверждающие заявленные изменения.

7.3. Изучение репродуктивной токсичности и токсичности ГМО с комбинированными признаками проводится в эксперименте на крысах линии Вистар. Токсикологические исследования включают изучение репродуктивной функции крыс поколения F₀, пре- и постнатальное развитие потомства поколения F₁, а также оценку физиолого-биохимических показателей крыс поколения F₀ (на основании данных о динамике массы тела, об абсолютной и относительной массе внутренних органов; данных гематологических, морфологических и биохимических исследований, состояния антиоксидантного статуса и функционального состояния систем, осуществляющих защиту организма от воздействия токсичных соединений экзо- и эндогенного происхождения).

7.3.1. Схема проведения эксперимента.

7.3.2. На протяжении эксперимента животные получают полусинтетический казеиновый рацион (ПКР). Исследуемый ГМО и его традиционный аналог включают в состав корма в максимально возможном количестве, не нарушающем баланс основных пищевых веществ. Замена ингредиентов рациона должна быть проведена с учетом содержания белков, жиров и углеводов во вводимом продукте при соблюдении принципа изокалорийности.

Продуктовый набор и химический состав базового ПКР представлены в табл. 1 - 2.

7.3.2.1. В случае исследования ГМО, полученного гибридизационным методом, в рационе лабораторных животных в качестве традиционного аналога используется смесь традиционных аналогов исходных ГМ-линий.

7.3.3. Исследуемые показатели.

7.3.3.1. Интегральные показатели.

7.3.3.2. Репродуктивную функцию оценивают по генеративной и эндокринной функции гонад родительских животных поколения F₀, пренатальному и постнатальному развитию потомства поколения F₁.

Показатели, характеризующие генеративную функцию.

Показатели, характеризующие пренатальное развитие потомства.

Показатели, характеризующие постнатальное развитие потомства.

7.3.3.2.1. Раздел отчета по результатам оценки репродуктивной функции крыс должен включать цифровые данные в форме таблиц, содержащих основные сведения, необходимые для суждения о наличии или отсутствии у исследуемого ГМО неблагоприятного действия на репродуктивную функцию и развитие потомства.

7.3.3.3. Физиолого-биохимические показатели состояния здоровья крыс поколения F₀ оценивают на основании данных о динамике массы тела, об абсолютной и относительной массе внутренних органов; данных гематологических, морфологических и биохимических исследований, состояния антиоксидантного статуса и функционального состояния систем, осуществляющих защиту организма от воздействия токсичных соединений экзо- и эндогенного происхождения.

7.3.3.3.1. Общий клинический анализ крови.

7.3.3.3.2. Общий биохимический анализ сыворотки крови

7.3.3.3.3. Общий и биохимический анализ мочи.

7.3.3.3.4. Системные биомаркеры.

Система антиоксидантной защиты.

Система ферментов метаболизма ксенобиотиков.

Стабильность мембран лизосом.

Интенсивность процессов апоптоза.

7.3.3.3.5. Морфологические исследования

7.3.3.3.6. Другие исследования.

7.4. Иммунологические исследования ГМО проводятся в эксперименте на мышах линий CBA и C57B1/6 и включают изучение его иммуномодулирующих и сенсибилизирующих свойств по четырем тестам:

- действие на гуморальное звено иммунитета - в тесте определения уровня гемагглютининов к эритроцитам барана;

- действие на клеточное звено иммунитета - в реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) к эритроцитам барана;

- действие как сенсибилизирующего агента - в тесте чувствительности к гистамину;

- действие на естественную резистентность мышей к Salmonella typhimurium (сальмонеллы мышиного тифа).

В табл. 3 представлены сравнительные характеристики мышей линий CBA и C57B1/6.

7.4.1. Схема проведения эксперимента.

Исследования начинают через 21 день с момента перевода мышей на экспериментальные рационы. В течение эксперимента проводят наблюдения за поедаемостью корма и общим состоянием животных.

7.4.2. Исследуемые показатели.

7.4.2.1. Влияние ГМО на гуморальный иммунный ответ оценивают на основании титров антител после иммунизации эритроцитами барана мышей высокоотвечающей (CBA) и низкоотвечающей (C57BL/6) линий. Для иммунизации животных следует использовать минимальные дозы (5 x 10⁶) антигена.

Через 21 день эксперимента мышам контрольной (не менее 45 животных) и опытной (не менее 45 животных) групп обеих линий внутрибрюшинно вводят 0,5 мл эритроцитов барана (10 млн клеток/мл). Отбор крови для исследований проводят на 7-й, 10-й и 14-й день после введения эритроцитов барана. Сыворотку крови титруют общепринятым методом в реакции гемагглютинации [17]. Реакция основана на способности антител, содержащихся в сыворотке крови иммунизированных животных, склеивать (агглютинировать) эритроциты барана. В 96-луночных плоскодонных планшетах готовят двукратные разведения исследуемой сыворотки в объеме 0,5 мл, начиная с разведения 1:10. В контрольную лунку вносят 0,5 мл физиологического раствора. Ко всем лункам добавляют 0,5 мл 1% эритроцитов барана. Учет реакции ведется после инкубации планшетов в термостате в течение 2 ч при 37 °C. При положительном результате эритроциты оседают на дне лунки планшета в виде зонтика, при отрицательном - в виде пуговки. За титр принимают то последнее разведение исследуемой сыворотки, при которой еще наблюдается положительный результат. Контрольная лунка должна быть отрицательной. Полученные данные обрабатывают методами вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента. Результаты приводятся в виде M +/- m, где M - выборочное среднее измеряемых величин, m - стандартная ошибка.

7.4.2.2. Влияние ГМО на клеточный иммунный ответ оценивают на основании реакции гиперчувствительности замедленного типа. При выполнении теста антиген вводят двукратно: для сенсибилизации и для разрешения.

Через 21 день эксперимента мышам контрольной (не менее 15 животных) и опытной (не менее 15 животных) групп обеих линий подкожно в межлопаточную область вводят 0,5 мл эритроцитов барана (20 млн клеток/мл). Через пять дней всем мышам в подушечку одной задней лапы вводят разрешающую дозу эритроцитов барана - 0,02 мл (100 млн клеток/мышь); в контрлатеральную лапу - 0,02 мл 0,95%-го раствора хлорида натрия. Местную воспалительную реакцию оценивают через 18 - 20 часов путем определения массы опытной и контрольной лапок. Интенсивность местной реакции определяют по индексу реакции (ИР) [17].

7.4.2.3. Действие ГМО как сенсибилизирующего агента оценивают в тесте чувствительности к гистамину.

Через 21 день эксперимента мышам контрольной (не менее 15 животных) и опытной (не менее 15 животных) групп обеих линий внутрибрюшинно вводят гистамин гидрохлорид (2,5 мг/мышь в 0,5 мл физиологического раствора). Реакцию учитывают через 24 часа по проценту гибели мышей [34].

7.4.2.4. Влияние ГМО на естественную резистентность мышей к S. typhimurium оценивают на модели внутрибрюшинного заражения мышей десятикратно отличающимися дозами S. typhimurium штамм 415. Через 21 день эксперимента мышей контрольной (не менее 45 животных) и опытной (не менее 45 животных) групп обеих линий заражают тремя дозами культуры: 1 000, 100, 10 микробных клеток/мышь. После заражения за животными наблюдают в течение 21 дня. Вычисляют ЛД₅₀, а также процент гибели животных по каждой дозе, затем проводят сравнительный анализ результатов [18].

7.5. Аллергологические исследования ГМО с комбинированными признаками проводятся в эксперименте на лабораторных животных: потенциальную аллергенность оценивают, определяя тяжесть протекания системной анафилаксии и уровень циркулирующих сенсибилизирующих антител (субклассов IgG1 + IgG4) у крыс, получающих в составе рациона исследуемый ГМО (группа "опыт") и его традиционный аналог (группа "контроль"). В случае исследования ГМО, полученных гибридизационным методом, в рационе лабораторных животных в качестве традиционного аналога используется смесь традиционных аналогов исходных ГМ-линий. Метод основан на количественной сравнительной оценке тяжести реакции системной анафилаксии, возникающей при внутрибрюшинной (в/б) сенсибилизации взрослых крыс пищевым антигеном - овальбумином куриного яйца (OBA) с последующим внутривенным (в/в) введением сенсибилизированным животным разрешающей дозы того же белка [35].

7.5.1. Схема проведения эксперимента

7.5.2. Исследуемые показатели.

На 1-й, 3-й, 5-й день опыта крыс в/б сенсибилизируют OBA, а на 21-й день эксперимента вводят дополнительную ("бустерную") дозу антигена, уменьшенную в 10 раз в сравнении с первоначальной. Кормление рационами продолжают до утра 29-го дня эксперимента и затем вводят раствор OBA в/в, после чего оценивают на протяжении 24 ч тяжесть развивающейся реакции анафилаксии по показателям числа летальных реакций, общего числа судорожных реакций и величины анафилактического индекса [36]. Непосредственно перед введением разрешающей дозы у крыс отбирают 0,1 - 0,2 мл крови из хвостовой вены для определения уровня специфических антител.

Иммуноферментное определение уровней циркулирующих специфических антител к OBA проводят согласно [19]. Статистическую обработку результатов проводят согласно U-критерию Фишера для долевых показателей, непараметрическим критериям хи-квадрат и Манна-Уитни.

7.6. Генотоксикологические исследования ГМО с комбинированными признаками проводятся в эксперименте на лабораторных животных. Оценка потенциальной генотоксичности ГМО включает выявление повреждений ДНК и выявление мутагенной активности в эксперименте in vivo. Метод выявления мутагенной активности основан на учете хромосомных аберраций в метафазных клетках пролиферирующих тканей [20]. Регистрация повреждений ДНК предусматривает оценку целостности структуры ДНК методом щелочного гель-электрофореза изолированных клеток (метод ДНК-комет) [21].

7.6.1. Схема проведения эксперимента.

7.6.2. Исследуемые показатели:

- в основе метода выявления мутагенной активности лежит регистрация видимых структурных нарушений хромосом в клетках костного мозга на стадии метафазы. Анализируют 100 метафаз от каждого животного. Учитывают число одиночных и парных фрагментов, хроматидных и хромосомных обменов, ахроматических пробелов (гепов) и разрывов по центромере, число клеток с множественными повреждениями и клеток с полной деструкцией хромосом. Оценку результатов цитогенетического анализа проводят путем сопоставления долей клеток с хромосомными аберрациями в контрольной и опытной группах;

- регистрация повреждений ДНК предусматривает оценку целостности структуры ДНК методом щелочного гель-электрофореза изолированных клеток (метод ДНК-комет). Метод основан на регистрации различной подвижности ДНК и возможных фрагментов ДНК лизированных клеток, заключенных в агарозный гель, в постоянном электрическом поле. При этом ДНК мигрирует к аноду, формируя электрофоретический след, напоминающий "хвост кометы", параметры которого зависят от степени поврежденности исследуемой ДНК. Общая схема метода включает получение гель-слайдов (подложки), получение микропрепаратов, лизис, щелочную денатурацию, электрофорез, нейтрализацию/фиксацию, окрашивание и микроскопический анализ.

Микроскопический анализ проводят на эпифлуоресцентном микроскопе с соответствующими для конкретного красителя фильтрами при увеличении 200х - 400х. На каждый микропрепарат анализируют не менее 100 "ДНК-комет". Анализ "ДНК-комет" может проводиться визуально или с помощью программно-аппаратного комплекса.

7.7. Заключение о результатах медико-биологической оценки безопасности ГМО с комбинированными признаками оформляется в виде отчета в соответствии с требованиями Межгосударственного стандарта ГОСТ 7.32-2001.

1. Меньшиков В.В. (Ред.) Лабораторные методы исследования в клинике. М.: Медицина, 1987. 368 с.

2. Мальцев Г.Ю., Васильев А.В. // Вопр. мед. химии. 1994. N 2. С. 56 - 58.

3. Мальцев Г.Ю., Орлова Л.А. // Вопр. мед. химии. 1994. N 2. С. 59 - 61.

4. Костюк В.А., Потапович А.И. // Вопр. мед. химии. 1987. N 3. С. 115 - 118.

5. Дингл Дж. Лизосомы. Методы исследования. М.: Мир, 1980. 344 с.

6. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. Руководство. М.: Медицина, 1990. 384 с.

7. Западнюк И.П. и др. Лабораторные животные. Разведение, содержание, использование в эксперименте. 3-е изд. Киев: Вища школа, 1983. 383 с.

8. Киселева А.Ф. и др. Морфофункциональные методы исследования в норме и при патологии. К.: Здоров'я, 1983. 163 с.

9. Лакин Г.Ф. Биометрия: Учеб. пособие для биол. спец. вузов. 4-е изд., перераб. и доп. М.: Высш. шк., 1990. 352 с.

10. Лойда З., Госсрау Р., Шиблер Т. Гистохимия ферментов. Лабораторные методы. М.: Мир, 1982. 272 с.

11. Луппа Х. Основы гистохимии. М.: Мир, 1980. 343 с.

12. Микроскопическая техника: Руководство / Под ред. Д.С Саркисова, Ю.Л. Перова М.: Медицина, 1996. 544 с.

13. Ноздрачев А.Д., Поляков Е.Л. Анатомия крысы. С.-Пб.: Лань, 2001. 464 с.

14. Пальцев М.А., Аничков Н.М. Патологическая анатомия. В 2-х т. М.: Медицина, 2000. 1944 с.

15. Полак Д., Норден С.В. Введение в иммуноцитохимию: современные методы и проблемы. М.: Мир, 1987. 74 с.

16. Струков А.И., Серов В.В. Патологическая анатомия. М.: Медицина, 1993. 688 с.

17. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств / Под ред. Миронова А.Н. Ч. 1. М.: Гриф и К, 2012. 944 с.

18. Ведомости фармакологического комитета. 1999. N 1. С. 31 - 36.

19. Гмошинский И.В., Кржечковская В.В., Пятницкий Н.Н. // Вопросы питания. 1994. N 1, 2. С. 30 - 33.

20. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. Хабриева Р.У. 2-е изд., перераб. и доп. М.: ОАО "Издательство "Медицина", 2005. 832 с.

21. Применение метода щелочного гель-электрофореза изолированных клеток для оценки генотоксических свойств природных и синтетических соединений: Методические рекомендации. М., 2006. 27 с.

22. Weingard K., Brown G., Hall R. et al. // Fundamental and applied toxicology. 1996. Vol. 29. P. 198 - 201.

23. Mills G.C. // J. Biol. Chem. 1959. Vol. 234. N 3. P. 502 - 506.

24. Niashikimi M., Rao N., Jagi K. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1972. Vol. 46. P. 849 - 854.

25. Oshino N., Chance B. // Arch. Biochem. Biophys. 1973. Vol. 154. N 1. P. 117 - 131.

26. Tillotson J.A., Sauberlich H.E. // J. Nutrition. 1971. Vol. 101. P. 1459 - 1466.

27. Ernster L., Nordenbrandt K. // In Methods in Enzymology. Oxidation and phosphorilation. Estabrook R.W., Pullman M.E., eds., Ac. Press N.Y. 1967. Vol. 10. P. 574 - 580.

28. Michara, M., Uchiyama, M., Fukuzawa, K. 1980. // Biochem. Med. Vol. 23, Issue 3, P. 302 - 311.

29. Burchell B., Weatherill P. // Methods Enzymol. 1981. Vol. 77. P. 169 - 176.

30. Burke M.D., Mayer R.T. // Chem.-Biol. Interact. 1983. Vol. 45. P. 243 - 258.

31. Habig W.H., Pabst M.J., Jacoby W.B. // J. Biol. Chem. 1974. Vol. 294. P. 7130 - 7139.

32. Omura T., Sato R. // Biol. Chem. 1964. Vol. 239. P. 2370 - 2378.

33. Umegaki K., Saito K., Kubota Y. et al. // Jpn. J. Pharmacol. 2002. Vol. 90. P. 345 - 351.

34. FAO/WHO Protein quality evaluation. Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultation Held in Bethesda, Md, USA, 4 - 8 December, 1989, FAO Rome. 2 p.

35. Stokes C.R., Miller B.G., Bourne F.J. Animal models of food sensitivity. Food allergy and intolerance. London. 1987. P. 286 - 300.

36. Weigle W., Cochrane C., Dixon F. // J. Immunology. 1960. Vol. 85. P. 469 - 477.