"МУК 4.1.3231-14. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Измерение массовых концентраций N-нитрозоаминов (N-нитрозодиметиламин, N-нитрозодиэтиламин) в моче методом капиллярной газовой хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 19.12.2014)

1. Сборник подготовлен творческим коллективом авторов в составе: д.б.н., проф. А.Г. Малышева (руководитель), к.б.н. А.А. Ермаков, В.А. Шохин (ФГБУ "Научно-исследовательский институт экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина" Минздрава России).

2. Методические указания рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Методические указания утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой.

4. Введены впервые.

Включенные в сборник 10 методических указаний по определению химических соединений в биологических средах предназначены для использования в химико-аналитических исследованиях при проведении биомониторинга состояния здоровья населения, для практического использования в рамках социально-гигиенического мониторинга на территориях с высокой антропогенной нагрузкой, а также могут быть использованы для диагностических целей в рамках осуществления государственного санитарного надзора, контроля, экспертизы, расследований. Методические указания предназначены для специалистов химико-аналитических лабораторий системы Роспотребнадзора, научно-исследовательских институтов, работающих в области экологии человека, гигиены окружающей среды и защиты прав потребителей.

Методические указания, включенные в сборник, разработаны и подготовлены в соответствии с требованиями ГОСТ Р 8.563-96 "Государственная система обеспечения единства измерений. Методики выполнения измерений", ГОСТ Р 1.5-92 "ГСС. Общие требования к построению, изложению, оформлению и содержанию стандартов", МИ 2335-95 "Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа", МИ 2336-95 "Характеристики погрешности результатов количественного химического анализа. Алгоритм оценивания".

Все методики измерения прошли метрологическую аттестацию в соответствии с правилами ПР 50.2.002-94 "ГСИ. Порядок осуществления государственного метрологического надзора за выпуском, состоянием и применением средств измерений, аттестованными методиками выполнения измерений, эталонами и соблюдением метрологических правил и норм".

В методических указаниях, включенных в сборник, приведены методы определения 15 органических соединений и 15 тяжелых металлов и элементов в биологических средах, в том числе 9 веществ и 15 элементов - в крови, 3 вещества и 12 элементов - в моче и 5 веществ - в молоке. Определение токсичных веществ и элементов основано на использовании современных высокочувствительных методов физико-химического анализа - капиллярной газовой хроматографии и газохроматографическом анализе равновесного пара, высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой.

Методические указания одобрены и рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека и утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека - Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации.

Свидетельство о метрологической аттестации N 88-16374-241-01.00076-2012 от 26.11.2013.

1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода капиллярной газовой хроматографии для измерения массовой концентрации N-нитрозоаминов (N-нитрозодиметиламин, N-нитрозодиэтиламин) в пробах мочи в диапазоне концентраций для N-нитрозодиметиламина от 0,02 до 0,6 мг/дм³ и для N-нитрозодиэтиламина от 0,01 до 0,6 мг/дм³.

1.2. Методические указания по измерению массовой концентрации N-нитрозоаминов (N-нитрозодиметиламин, N-нитрозодиэтиламин) в пробах мочи предназначены для использования в санитарно-гигиенических, экологических, лечебных и научных организациях, осуществляющих деятельность в области профпатологии и экологии человека.

1.3. Методические указания носят рекомендательный характер.

N-нитрозоамины малоустойчивые вещества, стабильны только при температурах ниже 0 °C, являются жидкими или твердыми веществами желтого цвета.

N-нитрозоамины являются высокотоксичными соединениями. При попадании в организм поражают печень, вызывают кровоизлияния. Большая часть N-нитрозосоединений обладает сильным канцерогенным действием даже при однократном действии, проявляют мутагенные свойства.

При соблюдении всех регламентированных условий и проведения анализа в точном соответствии с данной методикой значения погрешности (и ее составляющих) результатов измерений не превышают значений, приведенных в табл. 1.

Значения показателя точности используют:

- при оформлении результатов измерений, выдаваемых лабораторией;

- при оценке деятельности лабораторий на качество проведения измерений;

- при оценке возможности использования результатов измерений при реализации методики измерений в конкретной лаборатории.

Выполнение измерений массовой концентрации N-нитрозоаминов (N-нитрозодиметиламин, N-нитрозодиэтиламин) в пробе мочи проводят методом капиллярной газовой хроматографии с термоионным детектором. Извлечение и концентрирование N-нитрозоаминов (N-нитрозодиметиламин, N-нитрозодиэтиламин) из проб мочи проводят методом анализа равновесной паровой фазы путем нагревания объекта.

Определению не мешают углеводороды, спирты. Длительность измерений - 30 мин.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией.

Примечание. Допускается использование других вспомогательных устройств и материалов аналогичного назначения, технические характеристики которых не уступают указанным.

6.1. При выполнении работ необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76.

6.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией и соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83.

6.3. При выполнении измерений с использованием газового хроматографа соблюдают правила электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-09 и инструкцией по эксплуатации прибора.

6.4. При работе с сосудами, работающими под давлением, необходимо соблюдать правила их устройства и безопасной эксплуатации в соответствии с ПБ 03-576-03.

6.5. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать допустимых значений по ГОСТ 12.1.005-88, ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07.

6.6. Организуют обучение работающих безопасности труда по ГОСТ 12.0.004-90.

6.7. При работе с биологическими средами соблюдают санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.2322-08.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие квалификацию не ниже инженера-химика и опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения работ на газовом хроматографе.

При выполнении измерений в лаборатории соблюдают следующие условия:

Выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

При подготовке к выполнению измерений проводят следующие работы:

- подготовка стеклянной посуды;

- подготовка хроматографической системы;

- приготовление растворов для градуировки;

- построение градуировочной характеристики;

- отбор проб.

В термостойкий стакан вместимостью 1 дм³ помещают 25 г калия двухромовокислого, осторожно приливают по палочке частями, тщательно перемешивая, 1 дм³ концентрированной серной кислоты.

Используемую посуду необходимо замочить в свежеприготовленном 3%-м растворе калия двухромовокислого в серной кислоте, промыть проточной водопроводной водой, ополоснуть дистиллированной водой и высушить в сушильном шкафу при температуре 105 °C.

Подготовку хроматографа к работе осуществляют в соответствии с инструкцией по эксплуатации хроматографа.

Хроматографическую колонку перед эксплуатацией устанавливают в хроматограф и, не подключая к детектору, кондиционируют в токе газа-носителя (азота) с расходом 4 см³/мин при температуре 240 °C в течение 2 ч. После охлаждения колонку подключают к детектору и проверяют стабильность нулевой линии при рабочей температуре термостата колонок. При отсутствии мешающих влияний колонка готова к работе.

Устанавливают режим работы газового хроматографа в соответствии со следующими условиями:

- температурный режим термостата колонки: 50 °C, подъем со скоростью 10 °C/мин до 200 °C;

Записывают нулевую линию при установленных режимных параметрах. При отсутствии флуктуаций приступают к работе.

В мерную пробирку объемом 10 см³ дозатором добавляют бидистиллированную воду в объеме 10 см³, вводят микрошприцем по 2 мм³ N-нитрозоаминов (N-нитрозодиметиламин, N-нитрозодиэтиламин) и тщательно перемешивают. Весовое содержание компонентов в исходном растворе составляет (с учетом плотности и содержания основного вещества): N-нитрозодиметиламин - 0,2 мг/см³, N-нитрозодиэтиламин - 0,19 мг/см³. Срок хранения раствора 12 ч.

Градуировочные растворы N-нитрозоаминов готовят в мерных пробирках объемом 10 см³. Для этого в каждую пробирку дозатором вносят по 10 см³ бидистиллированной воды и добавляют исходный раствор для градуировки в соответствии с табл. 2, добавляют 8 г сульфата натрия кристаллизационного и тщательно перемешивают.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади хроматографического пика (Гц·с) от массовой концентрации N-нитрозоаминов (мг/дм³) в моче, устанавливают по 7 сериям измерений по 5 концентрациям каждого вещества в каждой серии для каждого диапазона в соответствии с табл. 2.

Во флакон из-под пенициллина помещают по 5 см³ образца мочи (N-нитрозоамины в исходной пробе мочи отсутствуют), добавляют градуировочный раствор (табл. 2) и 8 г сульфата натрия кристаллизационного, флакон закрывают резиновой пробкой, зажимают алюминиевым колпачком и ставят в термостат дозатора равновесного пара (ДРП). По истечении 20 мин термостатирования вещества, находящиеся в равновесной паровой фазе, переносятся из флакона в дозирующую петлю крана-дозатора и затем через испаритель попадают в хроматографическую колонку.

Процедуру повторяют аналогично для каждого градуировочного раствора. На полученной хроматограмме вычисляют площади пиков определяемого компонента и по средним результатам из 5 серий строят градуировочную характеристику.

Градуировку проводят 1 раз в месяц и при смене реактивов.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят 1 раз в квартал в анализируемой серии измерений. Образцами для контроля стабильности являются градуировочные растворы, выбранные таким образом, чтобы массовая концентрация N-нитрозоаминов соответствовала нижней, верхней границам и середине диапазона построения градуировочной характеристики. Градуировка признается стабильной при выполнении условия:

где C - заданная массовая концентрация N-нитрозоаминов в градуировочном растворе;

C_m - результат измерения массовой концентрации N-нитрозоаминов в образце для градуировки.

При невыполнении условия стабильности градуировочной характеристики эксперимент повторяют с другим градуировочным раствором. При повторном невыполнении условия стабильности градуировочной характеристики выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики.

Отбор проб мочи объемом не менее 10 см³ производят в чистый сухой флакон. Анализ мочи необходимо проводить сразу или хранить в холодильнике не более 12 ч после отбора пробы.

В два флакона из-под пенициллина помещают по 5 см³ мочи и добавляют по 8 г сульфата натрия кристаллизационного, флакон закрывают резиновой пробкой, зажимают алюминиевым колпачком и ставят в термостат дозатора равновесного пара (ДРП). По истечении 20 мин термостатирования вещества, находящиеся в равновесной паровой фазе, переносятся из флакона в дозирующую петлю крана-дозатора и затем через испаритель попадают в хроматографическую колонку. Процедуру повторяют аналогично для второго образца и проводят выполнение измерений двух параллельных проб мочи. Условия выполнения измерений аналогичны условиям при установлении градуировочной характеристики (п. 9.2.2).

11.1. На хроматограмме рассчитывают площадь пика и по градуировочной характеристике определяют массовую концентрацию N-нитрозоаминов в моче.

11.2. За окончательный результат измерения принимают среднее арифметическое значение двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости C₁, C₂ (параллельных определений), для которых выполняется условие:

где r - предел повторяемости. Значения предела повторяемости приведены в табл. 3.

При невыполнении условия (2) получают дополнительно еще два результата измерений. За результат измерений принимают среднее арифметическое четырех результатов измерений (C₁, C₂, C₃, C₄), полученных в условиях повторяемости, для которых выполняется условие:

где CR_0,95(4) - критический диапазон. Значения критического диапазона приведены в табл. 4;

C_max,4 - наибольший результат измерений, полученный в условиях повторяемости;

C_min,4 - наименьший результат измерений, полученный в условиях повторяемости.

При невыполнении условия (3) в качестве окончательного результата измерений принимают медиану четырех результатов измерений, полученных в условиях повторяемости (параллельных определений). Дополнительно выявляют и устраняют причины, приводящие к невыполнению условий (2) и (3).

Результат измерений представляют в виде , где

- результат измерений, полученный в соответствии с процедурами раздела 9.4, мг/дм³;

- характеристика погрешности, мг/дм³, при P = 0,95, значение рассчитывают по формуле: , где значение - относительное значение характеристики погрешности измерений массовой концентрации N-нитрозодиметиламина и N-нитрозодиэтиламина, % (табл. 1).

13.1. Достоверность измерений в пределах лаборатории обеспечивают путем проведения проверки приемлемости результатов измерений, получаемых в условиях повторяемости, промежуточной прецизионности, воспроизводимости, оперативного контроля процедуры измерений и контроля стабильности результатов измерений в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-6.

13.2. Проверка приемлемости результатов измерений, получаемых в условиях внутрилабораторной прецизионности.

Образцами для проверки приемлемости результатов измерений, получаемых в условиях внутрилабораторной прецизионности, являются образцы мочи с внесенными в них добавками аттестованных растворов N-нитрозоаминов, подготовленных в соответствии с п. 9.3.2.

Проверку приемлемости результатов измерений, получаемых в условиях внутрилабораторной прецизионности (в пределах одной лаборатории, разными операторами, в разное время), проводят по результатам измерений массовых концентраций N-нитрозоаминов в образцах мочи с одинаковым содержанием N-нитрозоаминов.

Результаты измерений признают приемлемыми при выполнении условия:

где C₁ и C₂ - результаты измерений массовых концентраций N-нитрозоаминов, полученные в условиях внутрилабораторной прецизионности, т.е. в одной лаборатории в разное время, разными операторами;

R_л - предел внутрилабораторной прецизионности, значения предела внутрилабораторной прецизионности при доверительной вероятности P = 0,95 приведены в табл. 4.

Если условие (4) не выполняется, процедуру повторяют. При повторном превышении предела повторяемости выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Оперативный контроль процедуры измерений с использованием метода добавок.

Оперативный контроль процедуры измерений с использованием метода добавок проводят путем сравнения результата отдельно взятой контрольной процедуры К_к с нормативом контроля К.

Результат контрольной процедуры К_к рассчитывают по формуле:

где - результат измерений массовой концентрации N-нитрозоамина в пробе с известной добавкой - среднее арифметическое двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, расхождение между которыми удовлетворяет условию (2);

- результат измерений массовой концентрации N-нитрозоамина в исходной пробе - среднее арифметическое двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, расхождение между которыми удовлетворяет условию (2);

C_д - величина добавки.

В качестве добавки используют растворы N-нитрозоамина, приготовленные по п. 9.3.2.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

где , - значения характеристики погрешности результатов измерений, установленные в лаборатории при реализации методики, соответствующие массовой концентрации N-нитрозоамина в пробе с известной добавкой и в исходной пробе соответственно.

Примечание. Допустимо характеристику погрешности результатов измерений при внедрении методики в лаборатории устанавливать на основе выражения: с последующим уточнением по мере накопления информации в процессе контроля стабильности результатов измерений.

Процедуру измерений признают удовлетворительной при выполнении условия:

При невыполнении условия (7) контрольную процедуру повторяют. При повторном невыполнении условия (7) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.4. Оперативный контроль процедуры измерений, а также реализуемые процедуры контроля стабильности результатов выполняемых измерений приводят в документах лаборатории, устанавливающих порядок и содержание работ по организации методов контроля стабильности результатов измерений в пределах лаборатории.

1. ГОСТ Р ИСО 5725-6-02 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике".

2. ГОСТ Р 51652-2000 "Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия".

3. ГОСТ 12.1.004-91 "ССБТ. Пожарная безопасность. Общие требования".

4. ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны".

5. ГОСТ 12.1.007-76 "ССБТ. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".

6. ГОСТ 12.1.019-09 "ССБТ. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты".

7. ГОСТ 12.4.009-83 "ССБТ. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание".

8. ГОСТ 1770-74 "Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия".

9. ГОСТ 3022-80 "Водород технический. Технические условия".

10. ГОСТ 4220-75 "Реактивы. Калий двухромовокислый. Технические условия".

11. ГОСТ 21458-75 "Сульфат натрия кристаллизационный. Технические условия".

12. ГОСТ 7328-01 "Гири. Общие технические условия".

13. ГОСТ 9293-74 "Азот газообразный и жидкий. Технические условия".

14. ГОСТ 12026-76 "Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия".

15. ГОСТ 15150-69 "Машины, приборы и другие технические изделия. Исполнение для различных климатических районов, категории. Условия эксплуатации, хранения и транспортирования в части воздействия климатических факторов внешней среды".

16. ГОСТ 24104-2001 "Весы лабораторные. Общие технические требования".

17. ГОСТ 28311-89 "Дозаторы медицинские лабораторные. Общие технические требования и методы испытаний".

18. ГОСТ 28498-90 "Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний".

19. ГОСТ 29227-91 "Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования".

20. ГОСТ 52501-05 "Вода для лабораторного анализа. Технические условия".

21. СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней".

22. ТУ 25-11.1592-81 "Бидистиллятор стеклянный БС".

23. ТУ 25-11.1630-84 "Шкаф вытяжной химический".

Примечание. При использовании настоящей методики измерений целесообразно проверить действие ссылочных стандартов на территории Российской Федерации по соответствующему указателю стандартов, составленному на 1 января текущего года, и по соответствующим информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный документ заменен (изменен), то при пользовании настоящей методикой измерений следует руководствоваться замененным (измененным) стандартом. Если ссылочный документ отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.