"МУК 4.1.3323-15. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств метобромурона и 4-бромфенилмочевины в семенах подсолнечника, бобах сои и растительном масле методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 28.12.2015)

1. Разработаны сотрудниками ФГБНУ "Всероссийский НИИ защиты растений" (В.И. Долженко, А.С. Комарова, В.В. Человечкова) и ООО "Инновационный центр защиты растений" (И.А. Цибульская, Т.Д. Черменская).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 17 декабря 2015 г. N 2).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 28 декабря 2015 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации N 01.5.04.198/01.00043/2015.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения остаточных количеств метобромурона и 4-бромфенилмочевины в семенах подсолнечника, бобах сои и растительном масле в диапазоне концентраций 0,05 - 0,5 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

3-(4-бромфенил)-1-метокси-1-метилмочевина (ИЮПАК)

C₉H₁₁BrN₂O₂

Молекулярная масса: 259,1.

Химически чистое вещество представляет собой бесцветные кристаллы.

Температура плавления: 95 - 96 °C.

Давление пара при 25 °C: 0,4 МПа.

Растворимость в воде: 330 мг/дм³ (при 20 °C).

Растворимость в органических растворителях (г/дм³ при 20 °C): гептан < 10; дихлорметан, ацетон, метанол, этилацетат > 250.

Стабильность к гидролизу: стабилен, при 20 °C: DT₅₀ = 170 дней (pH 7).

Период полураспада в почве: DT₅₀ = 34 дня.

Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность LD₅₀ для млекопитающих (для крыс) > 10 000 мг/кг. Оказывает раздражающее действие на кожу, слизистую глаз и дыхательные пути.

Область применения препарата. Предвсходовый гербицид для борьбы с широколиственными сорняками и однолетними травами, адсорбируется корнями и листьями.

Механизм действия. Ингибирование фотосинтеза.

4-Бромфенилмочевина (ИЮПАК).

Основной метаболит метобромурона в почве и растениях.

C₇H₇BrN₂O

Молекулярная масса: 215,0.

Химически чистое вещество представляет собой бесцветные кристаллы.

Температура плавления: 225 - 227 °C.

В России для метобромурона и 4-бромфенилмочевины гигиенические нормативы не установлены.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 и 2, для соответствующих диапазонов концентраций.

Методика основана на определении метобромурона и 4-бромфенилмочевины методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием УФ-детектора после их извлечения из образцов ацетонитрилом и очистке на патроне для твердофазной экстракции.

Идентификация проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Перед началом анализа аналитическую колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 - 0,2 см³/мин) до стабилизации нулевой линии.

7.2.1. 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты: (0,5 +/- 0,01) г 98%-й ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм³, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки. Раствор хранят при комнатной температуре не более 1 месяца.

7.3.1.1. Основной раствор метобромурона с концентрацией 1,0 мг/см³: точную навеску метобромурона (50 +/- 0,5) мг помещают в мерную колбу вместимостью 50 см³, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки тем же растворителем.

Градуировочные растворы с концентрациями 0,05; 0,1; 0,2; 0,5; 1,0 мкг/см³ готовят методом последовательного разбавления по объему, используя в качестве растворителя подвижную фазу N 1.

7.3.1.2. Раствор N 1 с концентрацией 1,0 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 0,1 см³ основного раствора метобромурона и доводят до метки подвижной фазой N 1.

7.3.1.3. Раствор N 2 с концентрацией 0,5 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 5,0 см³ раствора метобромурона N 1 и доводят до метки подвижной фазой N 1.

7.3.1.4. Раствор N 3 с концентрацией 0,2 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 2,0 см³ раствора метобромурона N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой N 1.

7.3.1.5. Раствор N 4 с концентрацией 0,1 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1,0 см³ раствора метобромурона N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой N 1.

7.3.1.6. Раствор N 5 с концентрацией 0,05 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 5 см³ раствора метобромурона N 4 и доводят объем до метки подвижной фазой N 1.

7.3.2.1. Основной раствор 4-бромфенилмочевины с концентрацией 1,0 мг/см³: точную навеску 4-бромфенилмочевины (50 +/- 0,5) мг помещают в мерную колбу вместимостью 50 см³, растворяют в метаноле и доводят объем до метки тем же растворителем.

Градуировочные растворы с концентрациями 0,05; 0,1; 0,2; 0,5; 1,0 мкг/см³ готовят методом последовательного разбавления по объему, используя в качестве растворителя подвижную фазу N 2.

7.3.2.2. Раствор N 1 с концентрацией 1,0 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 0,1 см³ основного раствора 4-бромфенилмочевины и доводят до метки подвижной фазой N 2.

7.3.2.3. Раствор N 2 с концентрацией 0,5 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 5,0 см³ раствора 4-бромфенилмочевины N 1 и доводят до метки подвижной фазой N 2.

7.3.2.4. Раствор N 3 с концентрацией 0,2 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 2,0 см³ раствора 4-бромфенилмочевины N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой N 2.

7.3.2.5. Раствор N 4 с концентрацией 0,1 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1,0 см³ раствора 4-бромфенилмочевины N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой N 2.

7.3.2.6. Раствор N 5 с концентрацией 0,05 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 5 см³ раствора 4-бромфенилмочевины N 4 и доводят объем до метки подвижной фазой N 2.

Основные растворы можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в течение 3 месяцев, градуировочные растворы - в течение недели.

При изучении полноты определения метобромурона и 4-бромфенилмочевины в матрицах используют растворы в ацетонитриле и метаноле соответственно.

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация метобромурона или 4-бромфенилмочевины в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм³ градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии для каждого из веществ:

S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

C - аттестованное значение массовой концентрации метобромурона или 4-бромфенилмочевины в градуировочном растворе,

C_к - результат контрольного измерения массовой концентрации метобромурона или 4-бромфенилмочевины в градуировочном растворе,

- норматив контроля градуировочного коэффициента, % ( при P = 0,95).

Патрон промывают последовательно 3 см³ этилацетата и 3 см³ гексана, после чего он готов к работе.

В круглодонную колбу емкостью 10 см³ отбирают по 1 см³ стандартных растворов метобромурона и 4-бромфенилмочевины в ацетонитриле с концентрацией 1 мкг/см³ и 0,1 г растительного масла (наличие масла необходимо, так как без него 4-бромфенилмочевина не растворится в гексане). Растворитель удаляют в вакууме. Остаток растворяют в 1 см³ гексана и переносят на подготовленный патрон (п. 7.5). Колбу ополаскивают 1 см³ гексана и также наносят на патрон. Последовательно промывают патрон 10 см³ гексана и 3 см³ смеси N 1, элюат отбрасывают. Метобромурон элюируют 6 см³ смеси N 2 со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 2 см³, упаривают досуха, растворяют в 1 см³ подвижной фазы N 1 и анализируют по п. 9.3. Далее промывают патрон 5 см³ смеси N 3, элюат отбрасывают. 4-Бромфенилмочевину элюируют 8 см³ этилацетата со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 2 см³, упаривают досуха, растворяют в 1 см³ подвижной фазы N 2 и анализируют по п. 9.4.

Фракции, содержащие метобромурон, объединяют и вновь анализируют. Фракции, содержащие 4-бромфенилмочевину, тоже объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень веществ в элюате, определяют полноту смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюата.

Примечание. Проверку хроматографического поведения метобромурона и 4-бромфенилмочевины следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии патронов и растворителей.

Отбор проб семян подсолнечника и бобов сои производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79), а также в соответствии с ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб". Пробы семян подсолнечника и бобов сои хранят при комнатной температуре в полотняных мешочках, перед анализом доводят до стандартной влажности и измельчают. Растительное масло хранят в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в герметично закрытой стеклянной таре в течение 6 месяцев.

Для исследовательских целей допускается получение масла в день анализа в лаборатории из проб измельченных семян или бобов с помощью лабораторного пресса.

Пробу измельченных семян подсолнечника, бобов сои или растительного масла (10 г) помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку объемом 50 см³, добавляют 30 см³ ацетонитрила, помещают в перемешивающее устройство на 10 мин, затем центрифугируют в течение 10 мин при скорости 4 000 об./мин. Ацетонитрильный экстракт декантируют, в пробирку добавляют 20 см³ ацетонитрила и экстракцию повторяют. От объединенных органических экстрактов отбирают аликвоту, соответствующую 1 г пробы, переносят в круглодонную колбу вместимостью 25 см³ и упаривают растворитель на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C. Сухой остаток подвергают очистке по п. 9.2.

Сухой остаток, полученный в п. 9.1, растворяют в 1 см³ гексана и количественно переносят на подготовленный патрон (п. 7.5). Колбу ополаскивают 1 см³ гексана и также наносят на патрон. Патрон последовательно промывают 10 см³ гексана и 3 см³ смеси N 1, элюат отбрасывают. Метобромурон элюируют 5 см³ смеси N 2. Элюат собирают в круглодонную колбу емкостью 25 см³ и упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 1 см³ подвижной фазы N 1 и анализируют по п. 9.3.

Далее патрон промывают 5 см³ смеси N 3, элюат отбрасывают. 4-Бромфенилмочевину элюируют 5 см³ этилацетата. Элюат собирают в круглодонную колбу емкостью 25 см³ и упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 1 см³ подвижной фазы N 2 и анализируют по п. 9.4.

Ультраэффективный жидкостный хроматограф с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитой фазой, включающей гидрофильную карбаматную группу в цепи C18 (100 x 2,1) мм, 1,7 мкм. Температура колонки (30 +/- 1) °C. Подвижная фаза N 1: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 45 : 55, по объему. Скорость потока элюента - 0,2 см³/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора - 245 нм. Объем вводимой пробы - 10 мм³. Время удерживания метобромурона - (4,1 +/- 0,1) мин.

Ультраэффективный жидкостный хроматограф с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитой фазой, включающей гидрофильную карбаматную группу в цепи C18 (100 x 2,1) мм, 1,7 мкм. Температура колонки (30 +/- 1) °C. Подвижная фаза N 2: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 20 : 80, по объему. Скорость потока элюента - 0,2 см³/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора - 245 нм. Объем вводимой пробы - 10 мм³. Время удерживания 4-бромфенилмочевины - (9,4 +/- 0,1) мин.

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание метобромурона или 4-бромфенилмочевины в пробе (X_i, мг/кг) вычисляют по формуле:

S_xi - площадь пика аналита на хроматограмме испытуемого образца, мм² (AU);

K_i - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см³;

P - навеска анализируемого образца, г (аликвота, равная 1 г).

Поскольку содержание метаболита не нормируется, общее содержание действующего вещества в сумме с метаболитом - в эквиваленте действующего вещества с учетом коэффициента, определяемого по соотношению молекулярных масс соединений (k = 259/215), рассчитывается по формуле:

Содержание остаточных количеств вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартные растворы с концентрацией 1,0 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: "содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения" (например: менее 0,05 мг/кг <*>, где <*> - 0,05 мг/кг - предел обнаружения метобромурона в растительном масле).

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6-02 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

- характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг; при этом:

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

X', X, C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (3) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (3) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предел воспроизводимости (R):

X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.