"МУК 4.1.3291-15. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств касугамицина в воде, почве, зеленой массе, соломе и зерне риса методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 28.07.2015)

1. Разработаны сотрудниками ФГБНУ "Всероссийского НИИ защиты растений" (И.А. Цибульская, Т.Д. Черменская, А.С. Комарова, В.В. Человечкова).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22 мая 2015 г. N 1).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 28 июля 2015 г.

4. Введены впервые.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения остаточных количеств касугамицина в диапазоне концентраций в воде 0,001 - 0,01 мг/дм³, в почве - 0,05 - 0,5 мг/кг, в зеленой массе и соломе - 1,0 - 10,0 мг/кг, в зерне риса 0,1 - 1,0 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Касугамицин.

[5-амино-2-метил-6-(2,3,4,5,6-пентагидроксициклогексилокси)тетрагидропиран-3-ил]амино--иминоуксусная кислота (IUPAC).

C₁₄H₂₅N₃O₉.

Молекулярная масса 379,4.

Химически чистое вещество представляет собой бесцветное кристаллическое вещество.

Температура плавления: 202 - 204 °C.

Давление пара при 25 °C: < 1,3 x 10^-2 мПа.

Растворимость (в г/дм³ при 25 °C): вода - 228; метанол - 0,003; в ацетоне и ксилоле < 0,001.

Стабилен при комнатной температуре. Стабилен в слабых кислотах и нестабилен в сильных кислотах и щелочах. DT₅₀ (50 °C) 47 дней (pH 5), 14 дней (pH 9).

Острая пероральная токсичность LD₅₀ для крыс более 5 000 мг/кг, острая дермальная токсичность LD₅₀ для кроликов превышает 2 000 мг/кг. Не оказывает раздражающего действия на кожу и слизистую оболочку глаз кролика, не обладает мутагенными и тератогенными свойствами, не влияет на репродукцию крыс.

Системный фунгицид и бактерицид, получаемый ферментацией Streptomyces kasugaensis. Используется для контроля грибных и бактериальных заболеваний на рисе, овощных и плодовых культурах.

Не фитотоксичен для риса, томатов, сахарной свеклы, картофеля и др.

В России для касугамицина гигиенические нормативы не установлены.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Методика основана на определении касугамицина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием УФ-детектора после его извлечения из образцов подкисленным метанолом, для почвы - раствором щелочи и последующей очистки на патроне для твердофазной экстракции.

Идентификация касугамицина проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Перед началом анализа аналитическую колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 - 0,2 см³/мин) до стабилизации нулевой линии.

Патрон N 1 или N 2 для твердофазной экстракции промывают последовательно 3 см³ метанола и 3 см³ воды, после чего они готовы к работе.

7.3.1. 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты: (0,5 +/- 0,01) г 98%-й ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм³, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.3.2. Для приготовления 0,005 М гидроксида натрия в мерную колбу объемом 1 дм³ помещают 0,2 г натрия гидроокиси и доводят объем бидистиллированной водой до метки.

7.3.3. Для приготовления 0,01%-го раствора соляной кислоты в метаноле в мерную колбу объемом 1 дм³ помещают 0,1 см³ концентрированной соляной кислоты и доводят объем метанолом до метки.

7.3.4. Для приготовления 0,001%-го раствора соляной кислоты в метаноле в мерную колбу объемом 100 см³ помещают 10 см³ 0,01%-го раствора соляной кислоты в метаноле и доводят объем метанолом до метки.

7.3.5. Для приготовления 1 N соляной кислоты в мерную колбу объемом 10 см³ помещают 1,7 см³ концентрированной соляной кислоты и доводят объем водой до метки.

7.4.1. Основной раствор с концентрацией 1,0 мг/см³: точную навеску касугамицина (50 +/- 0,5) мг помещают в мерную колбу вместимостью 50 см³, растворяют в метаноле и доводят объем до метки тем же растворителем.

Градуировочные растворы с концентрациями касугамицина 0,2; 0,4; 0,8; 1,5; 2,0 мкг/см³ готовят методом последовательного разбавления по объему, используя в виде растворителя подвижную фазу.

7.4.2. Раствор N 1 с концентрацией 2,0 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 0,2 см³ основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.

7.4.3. Раствор N 2 с концентрацией 1,5 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,15 см³ основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.

7.4.4. Раствор N 3 с концентрацией 0,8 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 4 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.5. Раствор N 4 с концентрацией 0,4 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 2 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.6. Раствор N 5 с концентрацией 0,2 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в течение 1 месяца, градуировочные растворы - в течение суток.

При изучении полноты определения касугамицина в воде, почве, зеленой массе, соломе и зерне риса используют растворы вещества в подвижной фазе, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему растворителем.

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация касугамицина в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм³ градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации касугамицина в градуировочном растворе. Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

где S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

где C - аттестованное значение массовой концентрации касугамицина в градуировочном растворе,

C_K - результат контрольного измерения массовой концентрации касугамицина в градуировочном растворе,

- норматив контроля градуировочного коэффициента, % ( при P = 0,95).

В круглодонную колбу емкостью 10 см³ отбирают 1 см³ стандартного раствора касугамицина с концентрацией 10 мкг/см³. Отдувают растворитель током воздуха. Остаток растворяют в 1 см³ воды и переносят на подготовленный патрон N 1 (п. 7.2). Колбу обмывают 1 см³ воды и смыв тоже переносят на патрон. Промывают патрон 10 см³ воды. Элюаты от нанесения и промывки собирают фракциями по 2 см³, упаривают досуха, растворяют в 1 см³ подвижной фазы и анализируют по п. 9.6.

Фракции, содержащие касугамицин, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюата.

В круглодонную колбу емкостью 10 см³ отбирают 1 см³ стандартного раствора касугамицина с концентрацией 10 мкг/см³. Отдувают растворитель током воздуха. Остаток растворяют в 5 см³ воды и переносят на подготовленный патрон N 2 (п. 7.2). Промывают патрон 5 см³ воды, элюат отбрасывают. Затем элюируют касугамицин 6 см³ 1 N соляной кислоты со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 2 см³, упаривают досуха, растворяют в 1 см³ подвижной фазы и анализируют по п. 9.6.

Фракции, содержащие касугамицин, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюата.

Примечание. Проверку хроматографического поведения касугамицина следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии патронов и растворителей.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79), а также в соответствии с ГОСТ Р 31861-12 "Вода. Общие требования к отбору проб"; ГОСТ 28168-89 "Почвы. Отбор проб"; ГОСТ 13586.3-83 "Зерно. Правила приемки и методы отбора проб" и ГОСТ 6293-90 "Рис. Требования при заготовке и поставке". Пробы зерна и соломы для определения остатков в урожае хранят в бумажной или тканевой упаковке при комнатной температуре. Перед анализом пробы зерна доводят до стандартной влажности и измельчают.

Для длительного хранения пробы почвы подсушиваются при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в течение года. Перед анализом сухую почву доводят до стандартной влажности, просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм.

Пробу воды (200 см³) количественно переносят на подготовленный патрон N 1 (п. 7.2). Промывают патрон 5 см³ воды. Элюат собирают в круглодонную колбу емкостью 250 см³ и упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 1 см³ подвижной фазы и анализируют на содержание касугамицина по п. 9.6.

10 г почвы помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см³ и добавляют 30 см³ 0,005 М раствора натрия гидроксида. Пробирку плотно закрывают, встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 10 мин, центрифугируют при скорости 4 000 об./мин в течение 10 мин. Аликвоту экстракта - 12 см³ далее очищают по п. 9.4.

Навеску измельченной пробы (10 г - зерно; 2 г - зеленая масса, солома) помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см³ и добавляют 40 см³ 0,01% соляной кислоты в метаноле. Пробирку плотно закрывают, встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 10 мин, центрифугируют при скорости 4 000 об./мин в течение 10 мин. Аликвоту (8 см³ - зерно; 4 см³ - зеленая масса, солома) помещают в круглодонную колбу и упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °C. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. 9.5.

Аликвоту экстракта почвы, полученную по п. 9.2, количественно переносят на подготовленный патрон (п. 7.2). Промывают патрон 5 см³ воды. Касугамицин элюируют 3 см³ 1 N соляной кислоты. Элюат количественно переносят в круглодонную колбу емкостью 25 см³ и упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 1 см³ подвижной фазы и анализируют на содержание касугамицина по п. 9.6.

Остаток в колбе, полученный при упаривании экстрактов (п. 9.3), количественно переносят двумя порциями воды по 1 см³ на подготовленный патрон N 1 (п. 7.2). Промывают патрон 5 см³ воды. Элюаты объединяют, количественно переносят в круглодонную колбу емкостью 25 см³ и упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 1 см³ подвижной фазы и анализируют на содержание касугамицина по п. 9.6.

Жидкостный хроматограф с быстросканирующим ультрафиолетовым детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки.

Аналитическая колонка, заполненная сорбентом для очень полярных и водорастворимых соединений, работающая в режиме гидрофильной жидкостной хроматографии, (50 x 2,1) мм, 1,7 мкм.

Температура колонки (30 +/- 1) °C.

Подвижная фаза: смесь ацетонитрила (A) и 0,005 М ортофосфорной кислоты (B) в градиентном режиме: от 100% к 40% компонента A за 5 мин.

Скорость потока элюента 0,2 см³/мин.

Рабочая длина волны УФ-детектора 220 нм.

Объем вводимой пробы 10 мм³.

Время удерживания касугамицина составляет (4,3 +/- 0,1) мин.

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание касугамицина в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

где S_х - площадь пика касугамицина на хроматограмме испытуемого образца, (AU);

K - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см³;

P - навеска (г) или объем (см³) анализируемой части образца (для воды 200 см³, для почвы 4 г, для зерна 2 г, для соломы и зеленой массы 0,2 г).

Содержание остаточных количеств касугамицина в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор касугамицина с концентрацией 10,0 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости, .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг.

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг; при этом:

где - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры K_к рассчитывают по формуле:

где X', X, C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля K рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (K_к) с нормативом контроля (K).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

где X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.