"МУК 4.1.3405-16. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств флукарбазона натрия в семенах и масле подсолнечника методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 29.12.2016)

1. Разработаны сотрудниками ФГБНУ "Всероссийский НИИ защиты растений" и ООО "Инновационный центр защиты растений" (В.И. Долженко, И.А. Цибульская, А.С. Комарова, Т.Д. Черменская, В.Ф. Павлова).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22 декабря 2016 г. N 2).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 29 декабря 2016 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации N 01.5.04.234/01.00043/2016.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации флукарбазона натрия в семенах и масле подсолнечника в диапазоне концентраций 0,5 - 5,0 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Флукарбазон натрия

4,5-дигидро-3-метокси-4-метил-5-оксо-N-(2-трифторметоксифенилсульфонил)1H-1,2,4-триазол-1карбоксамид, натриевая соль (ИЮПАК).

Брутто формула: C₁₂H₁₀F₃N₄NaO₆S.

Молекулярная масса: 418,29.

Бесцветный порошок без запаха. Температура плавления 200 °C (с разложением).

Растворимость в органических растворителях (при 20 °C, в г/дм³): ацетонитрил - 6,4; диметилсульфоксид > 250; ацетон - 1,3; дихлорметан - 0,72; полиэтиленгликоль - 48; этилацетат - 0,14, пропанол - 0,27. Растворимость в воде при 20 °C (в г/дм³): 44 (pH 4 - 9).

Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода K_ow logP = -2,85.

Давление паров 1 x 10^-9 мПа (при 20 °C).

Период полураспада в почве: DT₅₀ (20 °C, аэробные условия) 2,1 день.

ЛД₅₀ орально для крыс > 5 000 мг/кг. Не токсичен для пчел.

Область применения: гербицид для борьбы с травянистыми и некоторыми широколистными сорняками.

Механизм действия - ингибирование ацетолактатсинтеза.

Гигиенические нормативы для флукарбазона натрия в России: МДУ в зерне хлебных злаков - 0,2 мг/кг, для подсолнечника не установлен.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Метод основан на определении флукарбазона натрия по свободной кислоте флукарбазону методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового (УФ) детектора после извлечения из образцов раствором калия фосфорнокислого 2-замещенного, последующей очистки в системе несмешивающихся растворителей и очистке на патроне для твердофазной экстракции.

Идентификация флукарбазона натрия проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-15.

4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см²), необходимо соблюдать Федеральные нормы и правила в области промышленной безопасности "Правила промышленной безопасности опасных производственных объектов, на которых используется оборудование, работающее под избыточным давлением" (утв. Приказом Ростехнадзора от 25.03.2014 N 116). Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Перед началом анализа аналитическую колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 - 0,2 см³/мин) до стабилизации нулевой линии.

Патрон для твердофазной экстракции последовательно промывают 2 см³ метанола, затем 4 см³ хлористого метилена.

7.2.1. 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты: (0,5 +/- 0,01) г 98%-й ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм³, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.2.2. Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 30:70 по объему, используя мерные цилиндры.

7.2.3. 0,1 М раствор калия фосфорнокислого 2-замещенного: 22,8 г калия фосфорнокислого 2-замещенного, 3-водного помещают в мерную колбу объемом 1 дм³, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.2.4. 2 М раствор ортофосфорной кислоты: 224 г 98%-й ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм³, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают точную навеску флукарбазона 94,7 мг, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в течение месяца.

Градуировочные растворы, соответствующие концентрациями флукарбазона натрия 0,25; 0,5; 1,0; 2,5 и 5,0 мкг/см³, готовят методом последовательного разбавления по объему, используя подвижную фазу.

7.3.2.1. Раствор N 1 флукарбазона, соответствующий концентрации флукарбазона натрия 5,0 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 0,5 см³ основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.

7.3.2.2. Раствор N 2 флукарбазона, соответствующий концентрации флукарбазона натрия 2,5 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 5 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.2.3. Раствор N 3 флукарбазона, соответствующий концентрации флукарбазона натрия 1,0 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 2 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.2.4. Раствор N 4 флукарбазона, соответствующий концентрации флукарбазона натрия 0,5 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.2.5. Раствор N 5 флукарбазона, соответствующий концентрации флукарбазона натрия 0,25 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,5 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Градуировочные растворы можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в течение двух недель.

7.3.3.1. Исходный раствор флукарбазона натрия для внесения с концентрацией 100 мкг/см³: точную навеску флукарбазона натрия 10,5 мг (содержание действующего вещества 95,5%) помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, растворяют в воде и доводят объем до метки водой.

7.3.3.2. Раствор N 1 флукарбазона натрия для внесения с концентрацией 10,0 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 10 см³ исходного раствора флукарбазона натрия для внесения и доводят до метки водой.

Этот раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения флукарбазона.

Растворы внесения можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в течение двух недель.

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика флукарбазона - концентрация флукарбазона натрия в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм³ градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации флукарбазона натрия в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

C - аттестованное значение массовой концентрации флукарбазона натрия в градуировочном растворе;

C_K - результат контрольного измерения массовой концентрации флукарбазона натрия в градуировочном растворе;

- норматив контроля градуировочного коэффициента, %. ( при P = 0,95).

В круглодонную колбу емкостью 10 см³ отбирают 1 см³ стандартного раствора флукарбазона N 3. Отдувают растворитель током воздуха. Остаток растворяют в 1 см³ хлористого метилена и переносят на подготовленный патрон. Колбу дважды порциями по 1 см³ обмывают хлористым метиленом и смывы тоже вносят на патроны. Промывают патроны 6 см³ смеси N 1, элюат отбрасывают. Затем элюируют флукарбазон 8 см³ смеси N 2 со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 2 см³, упаривают досуха, растворяют в 1 см³ подвижной фазы и анализируют по п. 9.4.

Фракции, содержащие флукарбазон, объединяют и вновь анализируют. Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюата.

Примечание. Проверку хроматографического поведения веществ на патронах для ТФЭ следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии патронов и растворителей.

Отбор проб проводится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79), а также отбор проб семян подсолнечника для анализа проводят в соответствии с ГОСТ 0852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб".

Семена хранят при комнатной температуре в полотняных мешочках, перед анализом доводят до стандартной влажности и измельчают. Растительное масло хранят в холодильнике при температуре (0 - 4) °C в герметично закрытой стеклянной таре в течение 6 месяцев.

Навеску измельченных семян 10 г помещают в коническую плоскодонную колбу, добавляют 50 см³ 0,1 М раствора калия фосфорнокислого 2-замещенного и экстрагируют в ультразвуковой ванне 10 мин. Растворитель декантируют и экстракцию повторяют еще с 50 см³ 0,1 М раствора калия фосфорнокислого 2-замещенного. Объединенный экстракт фильтруют через вату, подкисляют 2 М раствором фосфорной кислотой до pH 3, переносят в делительную воронку и дважды порциями по 30 см³ экстрагируют хлористым метиленом. Объединенный органический экстракт пропускают через слой безводного сульфата натрия, собирают в круглодонную колбу и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C. Сухой остаток подвергают очистке по п. 9.3.

К навеске масла 10 г добавляют 50 см³ гексана, переносят в делительную воронку и дважды порциями по 20 см³ экстрагируют 0,1 М раствором калия фосфорнокислого 2-замещенного. Объединенный водный экстракт промывают 20 см³ гексана, подкисляют 2 М раствором фосфорной кислотой до pH 3 и дважды порциями по 30 см³ экстрагируют хлористым метиленом. Объединенный органический экстракт пропускают через слой безводного сульфата натрия, собирают в круглодонную колбу и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C. Сухой остаток подвергают очистке по п. 9.3.

Остаток в колбе, полученный при упаривании экстрактов (п. 9.1 - 9.2), количественно переносят тремя 1 см³ порциями хлористого метилена на подготовленный патрон (п. 7.1.2). Промывают патроны 6 см³ смеси N 1. Флукарбазон элюируют 5 см³ смеси N 2. Элюат переносят в круглодонную колбу емкостью 25 см³ и упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 1 см³ подвижной фазы и анализируют на содержание флукарбазона натрия по п. 9.4.

Ультраэффективный жидкостный хроматограф с УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18, (100 x 2,1) мм, 1,7 мкм. Температура колонки (30 +/- 1) °C. Подвижная фаза: ацетонитрил и 0,005 М ортофосфорная кислота в соотношении 30:70. Скорость потока элюента: 0,2 см³/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора 220 нм. Объем вводимой пробы 10 мм³.

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание флукарбазона натрия в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

S_x - площадь пика флукарбазона на хроматограмме испытуемого образца, (AU);

K - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см³;

P - навеска анализируемого образца, г.

Содержание остаточных количеств флукарбазона натрия в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор флукарбазона натрия с концентрацией 5,0 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

Примечание. Расчет содержания вещества в пробах может быть проведен с помощью компьютерной программы обработки хроматографических данных, включенной в аналитическую систему.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости .

При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае если содержание компонента меньше нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения" (например: менее 0,5 мг/кг, где 0,5 мг/кг - предел обнаружения флукарбазона натрия в семенах подсолнечника).

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки должна удовлетворять условию:

- характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры K_к рассчитывают по формуле:

, , - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля K рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (K_к) с нормативом контроля (K).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предел воспроизводимости (R):

X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.