"МУК 4.2.3309-15. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Методы идентификации и количественного определения новых линий ГМО 2-го поколения в пищевых продуктах. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 02.11.2015)

1. Разработаны ФГБНУ "НИИ питания" (В.А. Тутельян, Н.В. Тышко, Э.О. Садыкова, А.К. Голомидова); Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (А.Ю. Попова, И.В. Брагина); Российской академией наук (Г.Г. Онищенко); Институтом биоинженерии, ФИЦ Биотехнологии РАН (К.Г. Скрябин, Б.Б. Кузнецов, М.С. Сухачева, И.В. Яковлева); МГУ им. М.В. Ломоносова (М.П. Кирпичников).

2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека - Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 2 ноября 2015 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) определяют методы идентификации и количественного определения генно-инженерно-модифицированных организмов (далее - ГМО) растительного происхождения в пищевых продуктах и носят рекомендательный характер.

1.2. В настоящих МУК представлены методы, направленные на идентификацию и количественное определение рекомбинантной ДНК, характерной для уникальных трансформационных событий, для осуществления окончательной идентификации новых линий ГМО растительного происхождения.

1.3. Настоящие МУК предназначены для использования лабораториями Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также другими испытательными лабораториями, аккредитованными в установленном порядке на проведение исследований продовольственного сырья и пищевых продуктов.

2.1. Метод количественного определения сои линии FG72.

Метод основан на ПЦР в реальном времени с определением гена, кодирующего синтез лектина (lectin1), присущего для всех линий сои, и области ДНК, специфичной для трансформационного события FG72 на границе генома сои и элемента генетической конструкции.

Для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава ГМ сои FG72 (кат. номер AOCS 0610-A3) - 99,9% и ее традиционный аналог (кат. номер AOCS 0707-A6).

Праймеры для идентификации рекомбинантной ДНК сои FG72:

MAE071 5' - AGA TTT GAT CGG GCT GCA GG-3'

SHA097 5' - GCA CGT ATT GAT GAC CGC ATT A-3'

TM325 FAM-5' - AAT GTG GTT CAT CCG TCT T-3'-MGBNFQ

Праймеры для идентификации ДНК сои (lectin1):

KVM164 5' - CTTTCTCGCACCAATTGACA-3'

KVM165 5' - TCA AAC TCA ACA GCG ACG AC-3'

TM021 VIC -5' - CCA CAA ACA CAT GCA GGT TAT CTT GG-3'-TAMRA

Реакционная смесь для определения рекомбинантной ДНК сои FG72

Реакционная смесь для определения ДНК сои (lectin1)

Условия амплификации

2.2. Метод количественного определения сои линии SYHT0H2.

Метод основан на ПЦР в реальном времени с определением гена, кодирующего синтез лектина (lectin1), присущего для всех линий сои, и области ДНК, специфичной для трансформационного события SYHT0H2 на границе генома сои и элемента генетической конструкции.

Для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава ГМ сои SYHT0H2 (кат. номер AOCS 0411-D) - 99,9% и ее традиционный аналог (кат. номер AOCS 0411-B).

Праймеры для идентификации рекомбинантной ДНК сои SYHT0H2:

FE08316 forward primer 5'-GGGAATTGGGTACCATGCC-3'

FE08317 reverse primer5'-TGTGTGCCATTGGTTTAGGGT-3'

FE08318 probeFAM-5'-CCAGCATGGCCGTATCCGCAA-3'-BHQ

Праймеры для идентификации ДНК сои (lectin1):

Реакционная смесь для определения рекомбинантной ДНК сои SYHT0H2

Реакционная смесь для определения ДНК сои (lectin1)

Условия амплификации

3.1. Метод количественного определения кукурузы линии MON89034.

Метод основан на ПЦР в реальном времени с определением гена hmgA, присущего для всех линий кукурузы, и области ДНК, специфичной для трансформационного события MON89034 на границе генома кукурузы и элемента генетической конструкции.

Для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава ГМ кукурузы MON89034 (кат. номер AOCS 0906-E) - 99,4% и ее традиционный аналог (кат. номер AOCS 0906-A).

Праймеры для идентификации рекомбинантной ДНК кукурузы MON89034:

MON 89034 primer 1 5'-TTCTCCATATTGACCATCATACTCATT-3'

MON 89034 primer 2 5'-CGGTATCTATAATACCGTGGTTTTTAAA-3'

MON 89034 (Probe) FAM-5'-ATCCCCGGAAATTATGTT3'-MGBNFQ

Праймеры для идентификации ДНК кукурузы (hmgA):

hmg primer 1 5'-TTG GAC TAG AAA TCT CGT GCT GA-3'

hmg primer 2 5'-GCT ACA TAG GGA GCC TTG TCC T-3'

hmg (Probe) FAM-5'-CAATCCACACAAACGCACGCGTA-3'-TAMRA

Реакционная смесь для определения рекомбинантной ДНК кукурузы MON89034

Реакционная смесь для определения ДНК кукурузы

Условия амплификации

3.2. Метод количественного определения кукурузы линии 5307.

Метод основан на ПЦР в реальном времени с определением гена, кодирующего синтез алкогольдегидрогеназы 1 (adhl 1), присущей для всех линий кукурузы, и области ДНК, специфичной для трансформационного события 5307 на границе генома кукурузы и элемента генетической конструкции.

Для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава ГМ кукурузы 5307 (кат. номер AOCS 0411-D) - 99,88% и ее традиционный аналог (кат. номер AOCS 0411-C).

Праймеры для идентификации рекомбинантной ДНК кукурузы 5307:

5307i3' forward primer5'-CAT GGC CGT ATC CGC AAT GTG-3'

5307i3' reverse primer5'-TGC ACC CTT TGC CAG TGG-3'

5307i3'-s2 probe FAM-5'-ACC ACA ATA TAC CCT CTT CCC TGG GCC AG-3'-TAMRA

Праймеры для идентификации ДНК кукурузы (adhl 1):

Реакционная смесь для определения рекомбинантной ДНК кукурузы 5307

Реакционная смесь для определения ДНК кукурузы

Условия амплификации

3.3. Метод количественного определения кукурузы линии TC 1507.

Метод основан на ПЦР в реальном времени с определением гена hmgA, присущего для всех линий кукурузы, и области ДНК, специфичной для трансформационного события TC 1507 на границе генома кукурузы и элемента генетической конструкции.

Для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава ГМ кукурузы TC 1507 ERM-BF418a (< 0,1% (m/m); ERM-BF418b (1,0% (m/m); ERM-BF418c (9,9% (m/m); ERM-BF418d (98,6% (m/m).

Праймеры для идентификации рекомбинантной ДНК кукурузы TC 1507:

1) MaiY-F15'-TAGTCTTCGGCCAGAATGG-3'

2) MaiY-R35'-CTTTGCCAAGATCAAGCG-3'

3) MaiY-S1FAM-5'-TAACTCAAGGCCCTCACT CCG-3'-TAMRA

Праймеры для идентификации ДНК кукурузы (hmgA):

4) MaiJ-F25'-TTGGACTAGAAATCTCGTGCTGA-3'

5) mhmg-rev5'-GCT ACA TAG GGA GCC TTG TCC T-3'

6) Mhmg-probeFAM-5'-CAATCCACACAAACGCACGCGTA-3'-TAMRA

Реакционная смесь для определения рекомбинантной ДНК кукурузы TC 1507

Реакционная смесь для определения ДНК кукурузы

Условия амплификации

4.1. Образец приготовления стандартов для построения калибровочной прямой на примере кукурузы MON89034.

4.1.1. Для построения калибровочной прямой необходимо приготовить образцы с 5,0; 1,0 и 0,1%-м содержанием ГМ кукурузы MON89034. Для этого следует использовать стандартные образцы состава ГМ кукурузы MON89034 (кат. номер AOCS 0906-E), содержание ГМ кукурузы 99,4%, и ее традиционного аналога (кат. номер AOCS 0906-A).

4.1.2. Приготовление 5%-го образца: смешать 5,03 г муки ГМ кукурузы и 94,97 г муки ее традиционного аналога. Приготовление 1%-го образца: смешать 2,0 г 5%-й смеси ГМ кукурузы MON89034 и 8,0 г муки ее традиционного аналога. Приготовление 0,1%-го образца: смешать 1,0 г 1,0%-й ГМ кукурузы MON89034 и 9,0 г муки ее традиционного аналога.

4.1.3. Из полученных смесей выделить ДНК (выделение ДНК - глава IV МУК 4.2.2304-07), полученные растворы ДНК будут содержать ГМ ДНК в количестве 5,0; 1,0 и 0,1% соответственно.

4.2. Расчет количества рекомбинантной ДНК на основании калибровочной прямой.

4.2.1. Образец расчета количества рекомбинантной ДНК на примере ГМ сои FG72.

Определить пороговый цикл для каждой ПЦР (Ct) по кривой амплификации. Рассчитать разность между Ct, специфичным для трансформационного события FG72 (линии сои FG72), и Ct, специфичным для гена lec. Относительное количество рекомбинантной ДНК в пробе определяется по формуле:

- разность между значениями Ct для трансформационного события FG72 или SYHT0H2 и гена lec в исследуемом образце;

- разность между значениями Ct для трансформационного события FG72 или SYHT0H2 и гена lec в стандартном образце;

cref - концентрация стандартного образца.

Предел детекции метода составляет 0,01%.

4.2.2. Образец расчета количества рекомбинантной ДНК на примере ГМ кукурузы MON89034.

Определить пороговый цикл для каждой ПЦР (Ct) по кривой амплификации. Рассчитать разность между Ct, специфичным для трансформационного события MON89034 (линии кукурузы MON89034), и Ct, специфичным для гена hmgA. Относительное количество рекомбинантной ДНК в пробе определяется по формуле, представленной в п. 4.2.1.

Предел детекции метода составляет 0,01%.

Протокол исследований должен содержать следующие пункты.

Название организации, проводившей анализ, адрес, контактный телефон.

Аттестат аккредитации, N ____.

Наименование исследуемого образца.

Название организации заявителя.

Нормативная документация, в соответствии с которой проводилась оценка результатов (ТР ТС), ссылка на раздел нормативной документации, в соответствии с которым проводилось измерение.

Сведения об используемых средствах измерения и испытательном оборудовании.

Фактические и нормативные значения измеряемых показателей.

Протокол должен быть заверен печатью организации, проводившей анализ.

Пример.

Выводы.

"В исследованном образце продукции не выявлено присутствие рекомбинантной ДНК сои линии 40-3-2",

или

"В исследованном образце продукции выявлено присутствие рекомбинантной ДНК сои линии 40-3-2 в количестве 10% в расчете на общую ДНК сои в образце".

Соя линии 40-3-2 разрешена для использования в пищевой промышленности и для реализации населению на территории Евразийского экономического союза.

Испытания (исследования) провели: должность и Ф.И.О. оператора, подписи.

Также необходимо указать, что результаты испытаний (исследований), представленные в данном Протоколе, относятся только к представленной пробе (образцу).