"МУК 4.1.3510-17. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств азоксистробина и его метаболита Z-азоксистробина в ботве и корнеплодах сахарной свеклы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 29.12.2017)

1. Разработаны сотрудниками ФГБНУ "Всероссийский НИИ защиты растений" (И.А. Цибульская, Т.Д. Черменская, А.А. Далинова).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 24 ноября 2017 г. N 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 29 декабря 2017 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство об аттестации методики измерений N 01.5.04.237/01.00043/2016.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации азоксистробина и его метаболита Z-азоксистробина в ботве и корнеплодах сахарной свеклы в диапазоне концентраций 0,05 - 0,5 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Метил (E)-2-{2-[6-(2-цианофенокси)пиримидин-4-илокси]фенил}-3-метоксиакрилат (IUPAC).

Структурная формула:

Молекулярная масса: 403,4.

Брутто формула: C₂₂H₁₇N₃O₅.

Бесцветное кристаллическое вещество без цвета и запаха.

Температура плавления: 116 °C. Давление паров: 1,1 x 10^-7 МПа (20 °C). Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода K_owlogP = 2,5 (20 °C).

Растворимость в воде (20 °C): - 6 мг/дм³. Растворимость (г/дм³, 20 °C): в гексане - 0,057, в толуоле - 55, ацетонитриле - 340, метаноле - 20, октаноле - 20, ацетоне - 86. Гидролитически стабилен при комнатной температуре при pH 3 - 10. Фотолиз азоксистробина протекает с образованием Z-изомера.

Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность для крыс ЛД₅₀ > 5 000 мг/кг, острая дермальная токсичность ЛД₅₀ > 2 000 мг/кг, ингаляционная токсичность ЛК₅₀ > 0,7 мг/м³. Малотоксичен для пчел и шмелей.

Область применения. Фунгицид системного и контактного действия, имеет длительный защитный эффект, высокоэффективен против возбудителей ложной и мучнистой настоящей росы, пятнистости листьев зерновых, ржавчины и корневых гнилей на рисе, томате, картофеле и др.

Метил (Z)-2-{2-[6-(2-цианофенокси)пиримидин-4-илокси]фенил}-3-метоксиакрилат (IUPAC).

Структурная формула:

Молекулярная масса: 403,4.

Брутто формула: C₂₂H₁₇N₃O₅.

Кристаллическое вещество желтого цвета, физико-химические свойства близки к свойствам азоксистробина.

Гигиенические нормативы для азоксистробина в России: МДУ в овощах со съедобными клубнями и корнями (кроме картофеля) - 1,0 мг/кг.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Метод основан на определении азоксистробина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового (УФ) детектора после извлечения из образцов ацетонитрилом в присутствии цитратного буфера, насыщенного сульфатом магния, и обеспечивающего разделение водной и органической фаз; очистке ацетонитрильного экстракта с помощью дисперсионной твердофазной экстракции и на патроне для твердофазной экстракции.

Идентификация азоксистробина проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается использование вспомогательных устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-15.

4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см²), необходимо соблюдать Федеральные нормы и правила в области промышленной безопасности "Правила промышленной безопасности опасных производственных объектов, на которых используется оборудование, работающее под избыточным давлением" (утв. Приказом Ростехнадзора от 25.03.2014 N 116). Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Перед началом анализа аналитическую колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 - 0,2 см³/мин) до стабилизации нулевой линии.

Патрон промывают 2,5 см³ элюента N 2, затем 3 см³ элюента N 1.

7.3.1. 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты: (0,5 +/- 0,01) г 98% ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм³, растворяют в деионизованной воде и доводят объем до метки.

7.4.1. Основной раствор азоксистробина с концентрацией 0,5 мг/см³: точную навеску азоксистробина (50 +/- 0,5 мг) помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

7.4.2. Основной раствор Z-азоксистробина с концентрацией 0,5 мг/см³: точную навеску Z-азоксистробина (50 +/- 0,5 мг) помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

7.4.3. Приготовление градуировочных растворов. Градуировочные растворы с концентрациями азоксистробина и Z-азоксистробина 0,05 + 0,05; 0,1 + 0,1; 0,2 + 0,2; 0,5 + 0,5 мкг/см³ соответственно, готовят методом последовательного разбавления по объему, используя подвижную фазу.

7.4.3.1. Раствор N 1 с концентрацией 0,5 + 0,5 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 0,1 см³ основного раствора азоксистробина и 0,1 см³ основного раствора Z-азоксистробина и доводят до метки подвижной фазой.

7.4.3.2. Раствор N 2 с концентрацией 0,2 + 0,2 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 4,0 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.3.3. Раствор N 3 с концентрацией 0,1 + 0,1 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 2,0 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.3.4. Раствор N 4 с концентрацией 0,05 + 0,05 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1 см³ раствора N 1 и доводят объем до подвижной фазой.

Основные растворы азоксистробина и Z-азоксистробина можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в течение 6 месяцев, градуировочные растворы - в течение недели.

При изучении полноты определения азоксистробина и Z-азоксистробина используют ацетонитрильные растворы веществ, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика - концентрация азоксистробина и его метаболита в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм³ градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации азоксистробина и его метаболита в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (К) в уравнении линейной регрессии:

где S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

где C - аттестованное значение массовой концентрации азоксистробина в градуировочном растворе;

C_к - результат контрольного измерения массовой концентрации азоксистробина в градуировочном растворе;

- норматив контроля градуировочного коэффициента, % ( при P = 0,95).

В круглодонную колбу емкостью 10 см³ отбирают 1 см³ стандартного раствора азоксистробина и его метаболита с концентрацией 0,5 + 0,5 мкг/см³. Отдувают растворитель током воздуха. Остаток растворяют в 1 см³ ацетона, добавляют 9 см³ гексана и переносят на подготовленный патрон. Промывают патрон 3 см³ элюента N 1, элюат отбрасывают. Затем элюируют азоксистробин и его метаболит 10 см³ элюента N 2 со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 2 см³, упаривают досуха, растворяют в 1 см³ подвижной фазы и анализируют по п. 9.3.

Фракции, содержащие азоксистробин и его метаболит объединяют и вновь анализируют. Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюата.

Отбор проб свеклы производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79), а также в соответствии с ГОСТ Р 52647-06 "Свекла сахарная. Технические условия". Для длительного хранения аналитические пробы свеклы (ботва и корнеплоды) помещают в морозильную камеру с температурой -18 °C и хранят до анализа в герметичной полиэтиленовой упаковке.

Навеску измельченной матрицы 10 г помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см³, последовательно добавляют 10 см³ ацетонитрила, 4 г безводного сульфата магния, 1 г хлористого натрия, 1 г цитрата натрия двуводного и 0,5 г динатрия цитрата сесквигидрата. Пробирку плотно закрывают и помещают в перемешивающее устройство на 10 мин, затем центрифугируют в течение 10 мин при скорости 4 000 об./мин. От верхнего ацетонитрильного слоя отбирают 5 см³, переносят в центрифужную пробирку вместимостью 15 см³, содержащую 150 мг смеси первичных и вторичных аминов и 900 мг безводного сульфата магния. Пробирку плотно закрывают и помещают в перемешивающее устройство на 10 мин, затем центрифугируют в течение 10 мин при скорости 4 000 об./мин. От верхнего ацетонитрильного слоя отбирают 1 см³, упаривают досуха в токе воздуха при температуре не более 40 °C. Сухой остаток чистят на патроне для твердофазной экстракции Диапак С (п. 9.2).

Остаток в колбе, полученный при упаривании экстрактов (п. 9.1), растворяют в 1 см³ ацетона, добавляют 9 см³ гексана и переносят на подготовленный патрон (п. 7.2). Промывают патрон 3 см³ элюента N 1. Азоксистробин и его метаболит элюируют 5 см³ элюента N 2. Элюат переносят в круглодонную колбу емкостью 25 см³ и упаривают досуха при температуре не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 1 см³ подвижной фазы и анализируют по п. 9.3.

Ультраэффективный жидкостной хроматограф с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами С18 (2,1 x 100) мм, 1,7 мкм. Температура колонки (30 +/- 1) °C. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 45:55. Скорость потока элюента: 0,2 см³/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора 245 нм. Объем вводимой пробы 10 мм³.

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание азоксистробина и его метаболита в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

где S_x - площадь пика азоксистробина или его метаболита на хроматограмме испытуемого образца (AU);

K - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см³;

P - навеска анализируемого образца, г.

Содержание остаточных количеств азоксистробина и его метаболита в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор азоксистробина с концентрацией 0,05 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости .

При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае если содержание компонента меньше нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения" (например: менее 0,05 мг/кг <*>, где <*> 0,05 мг/кг - предел обнаружения азоксистробина в корнеплодах свеклы).

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода "добавок".

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг; при этом:

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

где X', X, C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.