"МУК 4.1.3290-15. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств крезоксим-метила в семенах и масле подсолнечника методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 28.07.2015)

1. Разработаны сотрудниками ФГБНУ "Всероссийский НИИ защиты растений" (В.И. Долженко, А.С. Комарова В.В. Человечкова), ООО "Инновационный центр защиты растений" (И.А. Цибульская, Т.Д. Черменская).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22 мая 2015 г. N 1).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 28 июля 2015 г.

4. Введены впервые.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения остаточных количеств крезоксим-метила в семенах и масле подсолнечника в диапазоне 0,01 - 0,1 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

(E)-метил-2-метоксиимино-2-{2-(o-толилокси-метил)фенил}ацетат (IUPAC).

C₁₈H₁₉NO₄.

Молекулярная масса 313,4.

Химически чистое вещество представляет собой белое кристаллическое вещество со слабым запахом.

Температура плавления: 97,2 - 101,7 °C.

Давление пара при 20 °C: 2,3 x 10^-3 мПа.

Растворимость (в г/дм³ при 20 °C): вода - 0,002; гептан - 1,7; толуол - 111, дихлорметан - 939, метанол - 14,9; ацетон - 217, этилацетат - 123.

Стабильность к гидролизу при 20 °C: DT₅₀ 34 дня (pH 7), 7 часов (pH 9). В биологически активных почвах в аэробных условиях крезоксим-метил быстро разрушается: DT₉₀ менее 3 дней.

Острая пероральная токсичность LD₅₀ для крыс более 5 000 мг/кг, острая дермальная токсичность LD₅₀ для крыс превышает 2 000 мг/кг. Не оказывает раздражающего действия на кожу и слизистую оболочку глаз кролика, не обладает мутагенными и сенсибилизирующими свойствами. Не токсичен для пчел, дождевых червей, полезных насекомых и птиц.

Синтетический фунгицид из класса стробилуринов, являющихся продуцентами гриба Strobilurus tenacellus. Вещество эффективно против широкого круга грибных патогенов хлебных злаков, овощных, кормовых, технических и плодовых культур. Обладает защитным, лечебным и искореняющим действием.

В России для крезоксим-метила в подсолнечнике гигиенические нормативы не установлены.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Метод основан на определении крезоксим-метила методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием УФ-детектора после его экстракции из образцов ацетонитрилом, очистки в системе несмешивающихся растворителей и очистки на патронах для твердофазной экстракции.

Идентификация крезоксим-метила проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Перед началом анализа аналитическую колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 - 0,2 см³/мин) до стабилизации нулевой линии.

Два патрона соединяют последовательно и промывают 5 см³ смеси N 1, затем 5 см³ гексана.

7.3.1. 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты: (0,5 +/- 0,01) г 98%-й ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм³, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.3.2. Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 45:55 по объему, используя мерные цилиндры.

7.3.3. Для приготовления ацетонитрила, насыщенного гексаном, в делительной воронке смешивают ацетонитрил и гексан в соотношении 5:1, встряхивают в течение 2 мин, после разделения слоев нижний ацетонитрильный слой готов к использованию.

7.4.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/см³: точную навеску крезоксим-метила (50 +/- 0,5 мг) помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

Градуировочные растворы с концентрациями крезоксим-метила 0,1; 0,2; 0,5; 1,0; 2,0 мкг/см³ готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы.

7.4.2.1. Раствор N 1 с концентрацией 2,0 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 0,4 см³ основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.

7.4.2.2. Раствор N 2 с концентрацией 1,0 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 0,2 см³ основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.

7.4.2.3. Раствор N 3 с концентрацией 0,5 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 5,0 см³ раствора N 2 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.4. Раствор N 4 с концентрацией 0,2 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 2,0 см³ раствора N 2 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.5. Раствор N 5 с концентрацией 0,1 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1,0 см³ раствора N 2 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в течение 1 месяца, градуировочные растворы - в течение суток.

При изучении полноты определения крезоксим-метила в семенах и масле подсолнечника используют ацетонитрильные растворы вещества, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика - концентрация крезоксим-метила в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм³ градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации крезоксим-метила в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

C - аттестованное значение массовой концентрации крезоксим-метила в градуировочном растворе,

C_K - результат контрольного измерения массовой концентрации крезоксим-метила в градуировочном растворе,

- норматив контроля градуировочного коэффициента, %. ( при P = 0,95).

В круглодонную колбу емкостью 10 см³ отбирают 1 см³ стандартного раствора крезоксим-метила с концентрацией 1 мкг/см³. Отдувают растворитель током воздуха. Остаток растворяют в 1 см³ гексана и переносят на подготовленные патроны. Колбу обмывают 1 см³ гексана и смыв тоже вносят на патроны. Промывают патроны 10 см³ гексана, элюат отбрасывают. Затем элюируют крезоксим-метил смесью N 1 со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 2 см³, упаривают досуха, растворяют в 1 см³ подвижной фазы и анализируют по п. 9.3.

Фракции, содержащие крезоксим-метил, объединяют и вновь анализируют. Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюата.

Примечание. Проверку хроматографического поведения крезоксим-метила следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии патронов и растворителей.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79), а также отбор проб семян подсолнечника для анализа проводят в соответствии с ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб".

Семена хранят при комнатной температуре в полотняных мешочках, перед анализом доводят до стандартной влажности и измельчают. Растительное масло хранят в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в герметично закрытой стеклянной таре в течение 6 месяцев.

Для исследовательских целей допускается получение масла в день анализа в лаборатории из проб измельченных семян с помощью лабораторного пресса.

Навеску масла или измельченных семян (5 г) помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см³ и добавляют 40 см³ ацетонитрила. Пробирку плотно закрывают, встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 10 мин, центрифугируют при скорости 4 000 об./мин в течение 10 мин, фильтруют через фильтр быстрой фильтрации в круглодонную колбу. К остатку в пробирке добавляют 30 см³ ацетонитрила и проводят повторную экстракцию. Объединенные экстракты упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °C. Остаток переносят в делительную воронку тремя порциями по 10 см³ ацетонитрила, насыщенного гексаном, и дважды промывают гексаном по 10 см³. Ацетонитрильный слой собирают в круглодонную колбу и упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °C. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. 9.2.

Остаток в колбе, полученный при упаривании экстрактов (п. 9.1.), количественно переносят двумя порциями по 1 см³ гексана на подготовленные патроны (п. 7.2). Промывают патроны 10 см³ гексана. Крезоксим-метил элюируют 5 см³ смеси N 1. Элюат количественно переносят в круглодонную колбу емкостью 25 см³ и упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 0,5 см³ подвижной фазы и анализируют на содержание крезоксим-метила по п. 9.3.

Ультраэффективный жидкостный хроматограф с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитой фазой, включающей гидрофильную карбаматную группу в цепи C18, (2,1 x 100) мм, 1,7 мкм. Температура колонки (30 +/- 1) °C. Подвижная фаза: ацетонитрил и 0,005 М ортофосфорная кислота в соотношении 45:55. Скорость потока элюента: 0,2 см³/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора 230 нм. Объем вводимой пробы 10 мм³. Время удерживания крезоксим-метила (5,3 +/- 0,1) мин.

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание крезоксим-метила в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

S_x - площадь пика крезоксим-метила на хроматограмме испытуемого образца, (AU);

K - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см³;

P - навеска анализируемого образца, г.

Содержание остаточных количеств крезоксим-метила в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор крезоксим-метила с концентрацией 1,0 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости, .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг.

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае если содержание компонента меньше нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

- характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг; при этом:

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

X', X, C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.