"МУК 4.2.3262-15. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Обнаружение патогенных микроорганизмов в пищевых продуктах и объектах окружающей среды методом фермент-связанного флуоресцентного анализа с применением автоматического анализатора. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 21.05.2015)

1. Разработаны: ФБУЗ "Федеральный центр гигиены и эпидемиологии" Роспотребнадзора (А.И. Верещагин, М.В. Зароченцев, М.А. Ярославцева), ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии в г. Санкт-Петербурге" (Т.А. Гречанинова, Н.С. Григорьева), ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии в г. Москве" (Н.Я. Салова, Л.А. Лунина) при участии ООО "биоМерье Рус" (Т.Н. Душкина).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 30 мая 2013 г. N 1).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека - Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 21 мая 2015 г.

4. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок обнаружения патогенных микроорганизмов в пищевых продуктах и объектах окружающей среды методом фермент-связанного флуоресцентного анализа с применением автоматического анализатора.

1.2. Методические указания предназначены для специалистов лабораторий Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также иных организаций и учреждений, занимающихся вопросами оценки качества и безопасности пищевых продуктов, объектов окружающей среды, аккредитованных (лицензированных) на проведение соответствующих исследований в установленном порядке.

1.3. Методические указания носят рекомендательный характер.

Качественное автоматизированное определение микроорганизмов в пищевых продуктах и объектах внешней среды основано на технологии фермент-связанного флуоресцентного анализа.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование вспомогательных устройств с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов и питательных сред с аналогичными или лучшими характеристиками.

Исследования пищевых продуктов и объектов окружающей среды методом наиболее вероятного числа с применением автоматического экспресс-анализатора проводят в соответствии с СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней".

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

Отбор проб проводят с учетом требований нормативно-технической документации на конкретный вид продукта (образца из внешней среды) в асептических условиях с использованием стерильного оборудования. Подготовку проб осуществляют с применением аппаратуры и материалов, указанных в международных, межгосударственных и национальных стандартах.

Тесты Salmonella предназначены для качественного определения бактерий рода Salmonella в продуктах питания и образцах внешней среды путем автоматической иммуноконцентрации сальмонелл после предварительного неселективного обогащения с последующим автоматизированным определением сальмонелл.

Реактивы, необходимые для анализа, находятся в лунках стрипа. Все этапы анализа выполняются прибором автоматически. Реакционная смесь циркулирует в наконечнике и переносится из лунки в лунку. Часть бульона обогащения (инкубированного в бульоне обогащения образца) вносится в стрип. Антигены Salmonella связываются с антителами, нанесенными на внутреннюю поверхность наконечника. Несвязанные компоненты удаляются на этапе отмывки. Далее к реакционной смеси добавляются антитела, связанные со щелочной фосфатазой, и антигены Salmonella, связанные с антителами на внутренней поверхности наконечника, связываются с ними. Несвязанные компоненты удаляются на этапе отмывки.

На этапе определения осуществляется циркуляция реакционной смеси в лунке, содержащей субстрат (4-метил-умбеллиферилфосфат). Фермент в реакционной смеси катализирует гидролиз субстрата до флуоресцирующего продукта (4-метил-умбеллиферона), флуоресценция которого измеряется при 450 нм. На конечном этапе прибор автоматически анализирует полученные значения, сравнивает их с внутренними контрольными значениями (порогами) и выдает результат (положительный/отрицательный).

Метод качественного определения бактерий рода Salmonella в продуктах питания и образцах внешней среды с использованием анализатора за 24 ч.

Навеску продукта (образца из внешней среды), в массе (объеме) которой предусматривается отсутствие бактерий рода Salmonella в соответствии с нормативно-технической документацией на анализируемый продукт (образец из внешней среды), стерильно вносят в забуференную пептонную воду.

Соотношение массы (объема) продукта (образца из внешней среды) и забуференной пептонной воды - 1:9 по объему.

Стерильно и без промедления вносят добавку в соотношении 1 мл на 255 мл забуференной пептонной воды.

Посевы термостатируют при температуре (41,5 +/- 1) °C в течение 18 - 24 ч.

По окончании инкубации переносят 2 - 3 мл в пробирку. Нагревают (5 +/- 1) мин при 95 - 100 °C, охлаждают, перемешивают и вносят 0,5 мл в лунку для образца на стрипе.

Начинают анализ, как это описано в руководстве пользователя. Полностью автоматизированный анализ завершают приблизительно через 45 мин. После окончания анализа результаты распечатываются автоматически.

Прибор автоматически анализирует полученные значения, сравнивает их с внутренними контрольными значениями (порогами). При пределах значения теста меньше 0,25 результат интерпретируется как отрицательный (Negative); при значении больше или равном 0,25 - как положительный (Positive). Результат теста со значением меньше порогового свидетельствует о том, что образец не содержит антигенов Salmonella либо их титр ниже порога определения. Результат со значением больше порогового или равным пороговому свидетельствует о том, что в образце содержатся антигены Salmonella.

Все положительные результаты теста требуют подтверждения.

Для подтверждения положительного результата возможно:

- использование селективного/хромогенного агара для получения типичных колоний;

- использование идентификации на стрипе API типичной колонии, выделенной на агаризованной среде.

Метод качественного определения бактерий рода Salmonella в продуктах питания и образцах внешней среды с использованием анализатора за 48 ч.

Навеску продукта (образца из внешней среды), в массе (объеме) которой предусматривается отсутствие бактерий рода Salmonella в соответствии с нормативно-технической документацией на анализируемый продукт (образец из внешней среды), стерильно вносят в забуференную пептонную воду.

Соотношение массы (объема) продукта (образца из внешней среды) и забуференной пептонной воды - 1:9 по объему.

Посевы термостатируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение 16 - 20 ч.

После инкубации переносят 0,1 мл предварительно обогащенной суспензии в 10 мл бульона RVS. Инкубируют 6 - 8 ч при (41,5 +/- 1) °C.

По окончании инкубации переносят 1 мл бульона RVS в 10 мл бульона M. Инкубируют повторно бульон RVS при (41,5 +/- 1) °C 16 - 20 ч. Бульон M инкубируют при (41,5 +/- 1) °C 16 - 20 ч. По окончании инкубации гомогенизируют бульон M. Нагревают (15 +/- 1) мин при (95 - 100) °C, охлаждают, перемешивают и вносят 0,5 мл в лунку для образца на стрипе. Бульоны M и RVS хранят при 2 - 8 °C до окончания анализа (для подтверждающего теста).

Начинают анализ, как это описано в руководстве пользователя. Полностью автоматизированный анализ завершается приблизительно через 45 мин. После окончания анализа результаты распечатываются автоматически.

Прибор автоматически анализирует полученные значения, сравнивает их с внутренними контрольными значениями (порогами). При пределах значения теста меньше 0,23 результат интерпретируется как отрицательный (Negative); при значении больше или равном 0,23 - как положительный (Positive). Результат теста со значением меньше порогового свидетельствует о том, что образец не содержит антигенов Salmonella либо их титр ниже порога определения. Результат со значением больше порогового или равным пороговому свидетельствует о том, что в образце содержатся антигены Salmonella.

Все положительные результаты теста требуют подтверждения. Варианты подтверждения положительного результата по п. 6.1.1.2.

Тест L. monocytogenes Xpress предназначен для иммуноферментного определения антигенов листерий в продуктах питания и образцах внешней среды. На внутреннюю поверхность наконечника, используемого как пипетирующее устройство и носитель твердой фазы, нанесены антитела к L. monocytogenes. Реактивы, необходимые для анализа, находятся в лунках стрипа. Все этапы анализа выполняются автоматически. Реакционная смесь переносится из лунки в лунку и перемешивается наконечником. Некоторую часть бульона обогащения вносят в стрип. Присутствующие в бульоне обогащения антигены Listeria monocytogenes связываются с антителами к ним, нанесенным на внутреннюю стенку наконечника. Несвязанные компоненты удаляются отмывкой. Наконечник переносит реакционную смесь в лунку с антителами к антигенам L. monocytogenes, мечеными биотином (конъюгатом). Эти антитела связываются с антигенами L. monocytogenes, которые связаны с антителами на стенке наконечника. Наличие биотина определяется после инкубации со стрептавидином, меченым щелочной фосфатазой. Несвязанные компоненты удаляются на дальнейших этапах отмывки. На конечном этапе определения реакционная смесь циркулирует в лунке с субстратом (4-метил-умбеллиферилфосфат). Фермент конъюгата катализирует гидролиз субстрата до флуоресцирующего продукта (4-метил-умбеллиферона), флуоресценция которого измеряется при 450 нм. В конце анализа прибор автоматически анализирует результат и рассчитывает тестовое значение. Оно интерпретируется до окончательного результата (положительный или отрицательный) при сравнении с набором стандартных значений, хранящихся в памяти прибора (пороговых значений).

Метод качественного определения бактерий вида L. monocytogenes в продуктах питания и образцах окружающей среды с использованием анализатора за 24 ч.

Навеску продукта (образца из внешней среды), в массе (объеме) которой предусматривается отсутствие бактерий вида L. monocytogenes в соответствии с нормативно-технической документацией на анализируемый продукт (образец из внешней среды), стерильно вносят в бульон LMX.

Соотношение массы (объема) продукта (образца из внешней среды) и бульона LMX - 25:225 по объему.

Стерильно и без промедления вносят добавку в соотношении 0,5 мл на 25 г образца.

Посевы термостатируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение 26 - 30 ч.

По окончании инкубации гомогенизируют бульон LMX. Нагревают (5 +/- 1) мин при 95 - 100 °C, охлаждают, перемешивают и вносят 0,25 мл в лунку для образца на стрипе.

Начинают анализ, как это описано в руководстве пользователя. Полностью автоматизированный анализ завершается приблизительно через 80 мин. После окончания анализа результаты распечатываются автоматически.

Прибор автоматически анализирует полученные значения, сравнивает их с внутренними контрольными значениями (порогами). При пределах значения теста меньше 0,05 результат интерпретируется как отрицательный (Negative); при значении больше или равном 0,05 - как положительный (Positive). Результат теста со значением меньше порогового свидетельствует о том, что образец не содержит антигенов L. monocytogenes либо их титр ниже порога определения. Результат со значением больше порогового или равным пороговому свидетельствует о том, что в образце содержатся антигены L. monocytogenes.

Все положительные результаты теста требуют подтверждения.

Для подтверждения положительного результата возможно:

- использование хромогенного агара без идентификации типичных колоний. Наличия типичных колоний Listeria monocytogenes при высеве из бульона LMX достаточно для подтверждения положительного результата;

- использование идентификации на стрипе API типичной колонии, выделенной на агаре типа Оттавиани-Агости. При этом предварительного выделения чистой культуры не требуется, если используемая колония полностью изолирована.

Метод качественного определения бактерий вида L. monocytogenes в продуктах питания и образцах внешней среды с использованием анализатора за 48 ч.

Навеску продукта (образца из внешней среды), в массе (объеме) которой предусматривается отсутствие бактерий вида L. monocytogenes в соответствии с нормативно-технической документацией на анализируемый продукт (образец из внешней среды), стерильно вносят в бульон Фразера в половинной концентрации.

Соотношение массы (объема) продукта (образца из внешней среды) и бульона Фразера в половинной концентрации - 25:225 по объему.

Посевы термостатируют при температуре (30 +/- 1) °C в течение (25 +/- 1) ч.

По окончании инкубации перемешивают и переносят 0,1 мл в 10 мл бульона Фразера. Инкубируют (25 +/- 1) ч при (37 +/- 1) °C. Вносят 0,5 мл в лунку для образца на стрипе.

Начинают анализ, как это описано в руководстве пользователя. Полностью автоматизированный анализ завершается приблизительно через 70 мин. После окончания анализа результаты распечатываются автоматически.

Прибор автоматически анализирует полученные значения, сравнивает их с внутренними контрольными значениями (порогами). При пределах значения теста меньше 0,05 результат интерпретируется как отрицательный (Negative); при значении больше или равном 0,05 - как положительный (Positive). Результат теста со значением меньше порогового свидетельствует о том, что образец не содержит антигенов L. monocytogenes либо их титр ниже порога определения. Результат со значением больше порогового или равным пороговому свидетельствует о том, что в образце содержатся антигены L. monocytogenes.

Все положительные результаты теста требуют подтверждения. Варианты подтверждения положительного результата по п. 6.2.1.2.

Метод одновременного качественного определения и дифференциации бактерий вида L. monocytogenes и Listeria spp. в пищевых продуктах и образцах внешней среды с использованием анализатора за 48 ч.

Тест Listeria Duo предназначен для одновременного качественного определения и дифференциации Listeria monocytogenes и Listeria spp. в пищевых продуктах и образцах внешней среды. На внутреннюю поверхность наконечника, используемого как пипетирующее устройство и носитель твердой фазы, нанесены антитела к L. monocytogenes и Listeria. Реактивы, необходимые для анализа, находятся в лунках стрипа. Все этапы анализа выполняются автоматически. Реакционная смесь последовательно переносится из лунки в лунку наконечником. Определенный объем бульона обогащения вносится в стрип. Присутствующие в нем антигены связываются с антителами на внутренней поверхности наконечника. Несвязанные компоненты удаляются при отмывке.

Определение Listeria monocytogenes. После этапа отмывки происходит образование комплекса связанных со щелочной фосфатазой антител к Listeria monocytogenes и антигена Listeria monocytogenes, связанного с антителами на стенке наконечника. Несвязанные компоненты удаляются на этапе отмывки. На этапе определения осуществляется циркуляция реакционной смеси в лунке, содержащей субстрат (4-метил-умбеллиферилфосфат). При этом фермент, содержащийся в реакционной смеси, катализирует гидролиз субстрата до флуоресцирующего продукта (4-метил-умбеллиферона), флуоресценция которого измеряется при 450 нм.

Определение Listeria. После первого считывания осуществляется циркуляция реакционной смеси в лунке, содержащей меченые щелочной фосфатазой антитела к Listeria, и происходит их связывание с антигенами Listeria, связанными с антителами на стенке наконечника. На этапе определения осуществляется циркуляция реакционной смеси в лунке, содержащей субстрат (4-метил-умбеллиферилфосфат). При этом фермент, содержащийся в реакционной смеси, катализирует гидролиз субстрата до флуоресцирующего продукта (4-метил-умбеллиферона), флуоресценция которого измеряется при 450 нм.

После окончания анализа прибор автоматически рассчитывает результат, сравнивает полученные значения с контрольными (пороговыми) значениями и интерпретирует результат как отрицательный или положительный.

Навеску продукта (образца из внешней среды), в массе (объеме) которой предусматривается отсутствие бактерий вида L. monocytogenes и Listeria spp. в соответствии с нормативно-технической документацией на анализируемый продукт (образец из внешней среды), стерильно вносят в бульон LX.

Соотношение массы (объема) продукта (образца из внешней среды) и бульона LX - 25:225 по объему.

Посевы термостатируют при температуре (30 +/- 1) °C в течение 22 - 26 ч.

По окончании инкубации перемешивают и переносят 1 мл в 10 мл бульона LX. Инкубируют (25 +/- 1) ч при (30 +/- 1) °C. Нагревают (5 +/- 1) мин при 95 - 100 °C, охлаждают, перемешивают и вносят 0,5 мл в лунку для образца на стрипе.

Начинают анализ, как это описано в руководстве пользователя. Полностью автоматизированный анализ завершается приблизительно через 2 ч. После окончания анализа результаты распечатываются автоматически.

Прибор автоматически анализирует полученные значения для каждого теста (Listeria monocytogenes и Listeria spp. в наборе, сравнивая их с внутренними контрольными значениями (порогами). При пределах значения теста Listeria monocytogenes меньше 0,05 результат интерпретируется как отрицательный (Negative), больше или равном 0,05 - как положительный (Positive). При пределах значения теста Listeria spp. меньше 0,10 результат интерпретируется как отрицательный (Negative), больше или равном 0,10 - как положительный (Positive). Значения, меньшие, чем пороговые, свидетельствуют о том, что образец не содержит антигенов Listeria monocytogenes или Listeria spp. либо их титры ниже порога определения. Значения, большие, чем пороговые или равные пороговым, свидетельствуют о том, что образец загрязнен Listeria monocytogenes или Listeria spp.

Все положительные результаты теста требуют подтверждения.

Варианты подтверждения положительного результата по п. 6.2.1.2.

Метод качественного определения антигенов штаммов E. coli серотипа O157 в пищевых продуктах с использованием анализатора за 24 ч.

Тесты E. coli O157 (ECO, ECPT) предназначены для скрининга энтерогеморрагических штаммов E. coli серотипа O157 в продуктах питания, образцах производственной среды. На внутреннюю стенку наконечника, используемого в качестве пипетирующего устройства, нанесены антитела к E. coli O157. Реактивы, необходимые для анализа, находятся в лунках стрипа. Все этапы анализа выполняются автоматически. Реакционная смесь циркулирует в наконечнике и переносится из лунки в лунку. Часть бульона обогащения вносится в стрип. Присутствующие в нем антигены E. coli O157 связываются с антителами на внутренней поверхности наконечника. Несвязанные компоненты удаляются на этапе отмывки. К смеси добавляются антитела, меченные щелочной фосфатазой (конъюгат), и антигены E. coli O157, связанные с антителами на внутренней поверхности наконечника, связываются с ними. Несвязанные компоненты конъюгата удаляются при отмывке. На этапе определения осуществляется циркуляция реакционной смеси в лунке, содержащей субстрат (4-метил-умбеллиферилфосфат). Фермент катализирует гидролиз субстрата до флуоресцирующего продукта (4-метил-умбеллиферона), флуоресценция которого измеряется при 450 нм. На конечном этапе прибор автоматически анализирует полученные значения, сравнивает их с внутренними контрольными значениями (порогами) и выдает результат (положительный, отрицательный).

Навеску продукта, в массе (объеме) которой предусматривается отсутствие бактерий вида E. coli серотипа O157 в соответствии с нормативно-технической документацией на анализируемый продукт, высевают в бульон предварительного обогащения (для молочных продуктов - трипказо-соевый бульон (m-TSB) с акрифлавином; для прочих продуктов - трипказо-соевый бульон (m-TSB) с новобиоцином) в соотношении 1:10.

Посевы термостатируют при температуре (41,5 +/- 1) °C в течение (6 +/- 1) ч.

По окончании инкубации перемешивают и переносят 1 мл бульона предварительного обогащения в 9 мл бульона Мак-Конки с цефиксимом и теллуритом калия (CT-MAC).

Инкубируют (18 +/- 1) ч при (37 +/- 1) °C. По окончании инкубации гомогенизируют бульон CT-MAC. Нагревают (15 +/- 1) мин при 95 - 100 °C, охлаждают, перемешивают и вносят 0,5 мл в лунку для образца на стрипе.

Начинают анализ, как это описано в руководстве пользователя. Полностью автоматизированный анализ завершается приблизительно через 45 мин. После окончания анализа результаты распечатываются автоматически.

Прибор автоматически анализирует полученные значения, сравнивает их с внутренними контрольными значениями (порогами). При пределах значения теста меньше 0,10 результат интерпретируются как отрицательный (Negative), при значении больше или равном 0,10 - как положительный (Positive). Результат теста со значением меньше порогового свидетельствует о том, что образец не содержит антигена O157 или содержит антиген O157 в концентрации ниже порога определения. Результат теста со значением больше или равным пороговому свидетельствует о том, что в образце содержатся клетки E. coli O157.

Все положительные результаты теста требуют подтверждения.

Для подтверждения положительного результата возможно:

- использование хромогенного агара chromID^TM O157:H7 с цефиксимом и теллуритом (CT-O157 H7 ID) или агара SMAC CT (Мак-Конки с сорбитом и добавкой для селективного выделения Escherichia coli O157:H7) для высева и инкубации при (37 +/- 1) °C в течение 18 - 24 ч с последующей идентификацией колоний;

- использование идентификации на стрипе API типичной колонии;

- использование латексного теста на определение штаммов O157 непосредственно с изолированными колониями (без этапа получения чистой культуры).

Метод качественного определения антигенов энтерогеморрагических штаммов E. coli серотипа O157 в пищевых продуктах, почве, образцах производственной среды с использованием анализатора за 24 ч.

Навеску продукта (образца из внешней среды), в массе (объеме) которой предусматривается отсутствие бактерий вида E. coli серотипа O157 в соответствии с нормативно-технической документацией на анализируемый продукт (образец из внешней среды), стерильно вносят в забуференную пептонную воду (для образцов пищевых продуктов с содержанием антибиотиков в концентрации, указанной в руководстве пользователя, для образцов из внешней среды - нейтрализующий агент натрий тиосульфат), предварительно прогретую до (41,5 +/- 1) °C в соотношении 1:10.

Посевы термостатируют при температуре (41,5 +/- 1) °C в течение 6 - 24 ч.

По окончании инкубации перемешивают и переносят 1 - 2 мл бульона в пробирку. Нагревают (5 +/- 1) мин при 95 - 100 °C, охлаждают, перемешивают и вносят 0,5 мл в лунку для образца на стрипе.

Начинают анализ, как это описано в руководстве пользователя. Полностью автоматизированный анализ завершается приблизительно через 50 мин. После окончания анализа результаты распечатываются автоматически.

Прибор автоматически анализирует полученные значения, сравнивает их с внутренними контрольными значениями (порогами). При пределах значения теста меньше 0,04 результат интерпретируется как отрицательный (Negative), при значении больше или равном 0,04 - как положительный (Positive). Результат теста со значением меньше порогового свидетельствует о том, что образец не содержит клеток O157 или содержит клетки O157 в концентрации ниже порога определения. Результат теста со значением большим или равным пороговому свидетельствует о том, что в образце содержатся клетки E. coli O157. Все положительные результаты теста требуют подтверждения.

Варианты подтверждения положительного результата по п. 6.3.1.2.