"МУК 4.1.3322-15. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств фенпироксимата в ботве и корнеплодах сахарной свеклы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 28.12.2015)

1. Разработаны сотрудниками ФГБНУ "Всероссийский НИИ защиты растений" (В.И. Долженко, А.С. Комарова, В.В. Человечкова) и ООО "Инновационный центр защиты растений" (И.А. Цибульская, Т.Д. Черменская, А.А. Далинова).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 17 декабря 2015 г. N 2).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 28 декабря 2015 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации N 01.5.04.197/01.00043/2015 от 08.06.2015.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения остаточных количеств фенпироксимата в диапазонах: в корнеплодах 0,05 - 0,5 мг/кг, в ботве 0,1 - 1,0 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

трет-Бутил(E)--(1,3-диметил-5-феноксипиразол-4-ил-метиленеаминоокси)-р-толуат (ИЮПАК).

Эмпирическая формула: C₂₄H₂₇N₃O₄.

Молекулярная масса: 421,5.

Химически чистое вещество представляет собой белый кристаллический порошок.

Температура плавления: 99,0 - 102 °C.

Давление пара при 25 °C: 0,0074 МПа.

Растворимость: в воде 0,02 мг/л (при 20 °C), в хлороформе 1179, дихлорметане 1 307, метаноле 15, ацетоне 150 (г/л, при 25 °C).

Стабильность: стабилен в кислых и щелочных средах.

Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность LD₅₀ для крыс 245 - 480 мг/кг, острая дермальная токсичность LD₅₀ для крыс превышает 2 000 мг/кг. Не ирритант. Ингаляционная токсичность LC₅₀ (4 часа) для крыс 0,33 - 0,36 мг/л воздуха. Класс опасности по ВОЗ II. Не токсичен для пчел.

Область применения препарата: активен в отношении многих видов фитофаговых клещей на плодовых и цитрусовых культурах, обладает ларвицидной, нимфацидной и имагоцидной активностью. Не фитотоксичен.

Гигиенические нормативы для фенпироксимата в России: МДУ - соя (бобы, масло), виноград, плодовые семечковые - 0,3 мг/кг.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Метод основан на определении фенпироксимата методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием УФ-детектора после его экстракции из образцов ботвы и корнеплодов свеклы ацетонитрилом.

Идентификация фенпироксимата проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Перед началом анализа аналитическую колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (1,0 см³/мин) до стабилизации нулевой линии.

7.2.1. 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты: (0,5 +/- 0,01) г 98%-й ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм³, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки. Раствор хранят при комнатной температуре не более 1 месяца.

7.2.2. Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 90:10 по объему, используя мерные цилиндры. Раствор хранят при комнатной температуре не более 1 месяца.

7.3.1. Основной раствор с концентрацией 0,1 мг/см³: точную навеску фенпироксимата (10 +/- 0,1) мг помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

Градуировочные растворы с концентрациями фенпироксимата 0,1; 0,2; 0,5; 1,0; 2,0 мкг/см³ готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 90:10).

7.3.2. Раствор N 1 с концентрацией 2,0 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 2,0 см³ основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.

7.3.3. Раствор N 2 с концентрацией 1,0 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 5 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.4. Раствор N 3 с концентрацией 0,5 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 2,5 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.5. Раствор N 4 с концентрацией 0,2 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.6. Раствор N 5 с концентрацией 0,1 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,5 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в течение 7 дней, градуировочные растворы использовать в день приготовления.

При изучении полноты определения фенпироксимата используют ацетонитрильные растворы вещества, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика - концентрация фенпироксимата в растворе) в хроматограф вводят по 20 мм³ градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации фенпироксимата в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

где S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

где C - аттестованное значение массовой концентрации фенпироксимата в градуировочном растворе,

C_к - результат контрольного измерения массовой концентрации фенпироксимата в градуировочном растворе,

- норматив контроля градуировочного коэффициента, %. ( при P = 0,95).

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79), а также в соответствии с ГОСТ 1722-85 "Свекла столовая свежая, заготовляемая и поставляемая". Для длительного хранения аналитические пробы свеклы (ботва и корнеплоды) помещают в морозильную камеру с температурой -18 °C и хранят в закрытой полиэтиленовой таре.

Навеску измельченных ботвы (5 г) или корнеплодов (10 г) помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см³, добавляют 20 см³ ацетонитрила, 4 г безводного сульфата магния и 1 г хлорида натрия, пробирку плотно закрывают и помещают в перемешивающее устройство на 10 мин, затем центрифугируют (скорость вращения центрифуги - 4 000 об./мин). Берут аликвоту 5 мл и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 1 см³ подвижной фазы и 20 мм³ вводят в хроматограф.

Высокоэффективный жидкостный хроматограф с УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитыми бифункциональными полярными группами C18, (250 x 4,6) мм, 5 мкм. Температура колонки (30 +/- 1) °C. Подвижная фаза: ацетонитрил и 0,005 М ортофосфорная кислота в соотношении 90:10. Скорость потока элюента: 1,0 см³/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора 260 нм. Объем вводимой пробы 20 мм³. Время удерживания фенпироксимата (6,3 +/- 0,1) мин.

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание фенпироксимата в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

где S_х - площадь пика фенпироксимата на хроматограмме испытуемого образца, мм² (AU);

K - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см³;

P - навеска анализируемого образца, 1,25 г для ботвы и 2,5 г для корнеплодов.

Содержание остаточных количеств фенпироксимата в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор фенпироксимата с концентрацией 5,0 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента меньше нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: "содержание вещества в пробе менее нижней границы определения" (например: менее 0,05 мг/кг*, где *0,05 мг/кг - предел обнаружения фенпироксимата в корнеплодах свеклы).

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6-02 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг; при этом:

где - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

где X', X, C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (3) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (3) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

где X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.