"МУК 4.1.3515-17. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств ацетамиприда в зерне гороха, капусте, моркови и луке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 29.12.2017)

1. Разработаны сотрудниками ФГБНУ "Всероссийский НИИ защиты растений" (И.А. Цибульская, Т.Д. Черменская) и ООО "Инновационный центр защиты растений" (Е.Ю. Алексеев).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 24 ноября 2017 г. N 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 29 декабря 2017 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство об аттестации методики измерений N 88-16207-036-RA.RU.310657-2017.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации ацетамиприда в зерне гороха, капусте, моркови и луке в диапазоне концентраций 0,025 - 0,25 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

(E)-N1-[(6-хлор-3-пиридил)метил]-N2-циано-N1-метилацетамидин (IUPAC).

Структурная формула:

Молекулярная масса: 222,7.

Брутто формула: C₁₀H₁₁ClN₄.

Химически чистое вещество представляет собой бесцветные кристаллы.

Температура плавления: 98,9 °C. Давление пара: < 1 x 10^-3 МРа (25 °C).

Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода: K_ow log P = 0,80 (25 °C).

Растворимость в воде 4 250 мг/дм³ при 25 °C. Растворимость в органических растворителях: хорошо растворим в ацетоне, метаноле, этаноле, дихлорметане, хлороформе, ацетонитриле и тетрагидрофуране. Стабилен в буферных при pH 4, 5, 7. Медленно разлагается при pH 9 и 45 °C. Устойчив к воздействию света. Слабое основание, pK_a 0,7.

Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность LD₅₀ 146 - 217 мг/кг (крысы). При подкожном введении LD₅₀ для крыс > 2 000 мг/кг. Ингаляционная токсичность LC₅₀ > 0,29 мг на 1 дм³ воздуха (крысы). Практически не раздражает кожу и слизистую глаз у кроликов.

Область применения. Системный инсектицид - агонист никотиновых ацетилхолиновых рецепторов, влияющий на синапсы центральной нервной системы насекомых.

Используется для подавления развития тлей, трипсов и чешуекрылых посредством обработки почвы и листьев растений на широком спектре овощных и плодовых культур при нормах расхода 75 - 700 г/га.

Гигиенические нормативы для ацетамиприда в России: МДУ (мг/кг) - зерно хлебных злаков, картофель - 0,5; рапс (зерно, масло) - 0,1; огурцы, томаты - 0,3; плодовые семечковые - 0,8*; сахарная свекла - 0,1; ВМДУ плодовые семечковые - 0,8*.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Метод основан на определении ацетамиприда методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового (УФ) детектора после извлечения из образцов ацетонитрилом в присутствии цитратного буфера, насыщенного сульфатом магния, и обеспечивающего разделение водной и органической фаз; очистке ацетонитрильного экстракта с помощью дисперсионной твердофазной экстракции при одновременном удалении воды безводным сульфатом магния и на патронах для твердофазной экстракции.

Идентификация ацетамиприда проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается использование вспомогательных устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см²), необходимо соблюдать Федеральные нормы и правила в области промышленной безопасности "Правила промышленной безопасности опасных производственных объектов, на которых используется оборудование, работающее под избыточным давлением" (утв. Приказом Ростехнадзора от 25.03.2014 N 116). Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Перед началом анализа аналитическую колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 - 0,2 см³/мин) до стабилизации нулевой линии.

Патрон промывают 2,5 см³ этилацетата, затем 3 см³ элюента N 1.

7.3.1. 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты: (0,5 +/- 0,01) г 98% ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм³, растворяют в деионизированной воде и доводят объем до метки.

7.4.1. Основной раствор ацетамиприда с концентрацией 0,5 мг/см³: точную навеску ацетамиприда (50 +/- 0,5 мг) помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

7.4.2. Приготовление градуировочных растворов. Градуировочные растворы с концентрациями ацетамиприда 0,02, 0,05, 0,1, 0,2 и 0,5 мкг/см³ готовят методом последовательного разбавления по объему, используя ацетонитрил.

7.4.2.1. Раствор N 1 с концентрацией 1,0 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 0,2 см³ основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.

7.4.2.2. Раствор N 2 с концентрацией 0,5 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 5,0 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.3. Раствор N 3 с концентрацией 0,2 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 2,0 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.4. Раствор N 3 с концентрацией 0,1 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1,0 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.5. Раствор N 4 с концентрацией 0,05 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1,0 см³ раствора N 2 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.6. Раствор N 5 с концентрацией 0,02 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1,0 см³ раствора N 3 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор ацетамиприда можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в течение 6 месяцев, градуировочные растворы - в течение недели.

При изучении полноты определения ацетамиприда используют ацетонитрильные растворы веществ, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика - концентрация ацетамиприда в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм³ градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации ацетамиприда в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (К) в уравнении линейной регрессии:

где S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

где C - аттестованное значение массовой концентрации ацетамиприда в градуировочном растворе;

C_К - результат контрольного измерения массовой концентрации ацетамиприда в градуировочном растворе;

- норматив контроля градуировочного коэффициента, %. ( при P = 0,95).

В круглодонную колбу емкостью 10 см³ отбирают 1 см³ стандартного раствора ацетамиприда с концентрацией 0,5 мкг/см³. Отдувают растворитель током воздуха. Остаток растворяют в 1 см³ элюента N 1 и переносят на подготовленный патрон. Промывают патрон 3 см³ элюента N 1, элюат отбрасывают. Затем элюируют ацетамиприд 10 см³ этилацетата со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 2 см³, упаривают досуха, растворяют в 1 см³ подвижной фазы и анализируют по п. 9.3.

Фракции, содержащие ацетамиприд, объединяют и вновь анализируют. Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюата.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79). Отбор проб зерна гороха проводят в соответствии с ГОСТ 6201-68 "Горох шлифованный. Технические условия". Пробы гороха хранят в бумажной или тканевой упаковке при комнатной температуре. Пробы капусты отбирают в соответствии с ГОСТ 1724-85 "Капуста белокочанная свежая, заготовляемая и поставляемая. Технические условия (с Изменениями N 1 - 4)"; моркови - в соответствии с ГОСТ 1721-85 "Морковь столовая свежая, заготовляемая и поставляемая. Технические условия"; лука - в соответствии с ГОСТ 1723-86 "Лук репчатый свежий заготовляемый и поставляемый. Технические условия". Пробы капусты, моркови и лука хранят до анализа в герметичной таре в морозильной камере при температуре не выше -18 °C.

Навеску измельченной матрицы 10 г помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см³, последовательно добавляют 10 см³ ацетонитрила, 4 г безводного сульфата магния, 1 г хлористого натрия, 1 г цитрата натрия двуводного и 0,5 г динатрия цитрата сесквигидрата. В случае зерна гороха, добавляют 10 мл воды. Пробирку плотно закрывают и помещают в перемешивающее устройство на 10 мин, затем центрифугируют в течение 10 мин при скорости 4 000 об./мин. От верхнего ацетонитрильного слоя отбирают 5 см³, переносят в центрифужную пробирку вместимостью 15 см³, содержащую 150 мг смеси первичных и вторичных аминов и 900 мг безводного сульфата магния. Пробирку плотно закрывают и помещают в перемешивающее устройство на 10 мин, затем центрифугируют в течение 10 мин при скорости 4 000 об./мин. От верхнего ацетонитрильного слоя отбирают 1 см³ и упаривают растворитель в токе воздуха при температуре не выше 40 °C. Сухой остаток чистят на патроне для твердофазной экстракции по п. 9.2.

Остаток в колбе, полученный при упаривании экстрактов (п. 9.1), растворяют в 1 см³ элюента N 1 и переносят на подготовленный патрон (п. 7.2). Промывают патрон 5 см³ элюента N 1. Ацетамиприд элюируют 8 см³ этилацетата. Элюат упаривают досуха в токе воздуха при температуре не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 1 см³ подвижной фазы и анализируют по п. 9.3.

Ультраэффективный жидкостной хроматограф с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18, (100 x 2,1) мм, 1,7 мкм. Температура колонки: (30 +/- 1) °C. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 20:80. Скорость потока элюента: 0,2 см³/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора: 245 нм. Объем вводимой пробы: 10 мм³.

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание ацетамиприда в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

где f - полнота извлечения ацетамиприда, приведенная в табл. 2, %;

S_х - площадь пика ацетамиприда на хроматограмме испытуемого образца, (AU);

K - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V - объем экстракта первичный, см³, равен 10 см³;

P - навеска анализируемого образца, г.

Содержание остаточных количеств ацетамиприда в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор ацетамиприда с концентрацией 0,5 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости .

При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае если содержание компонента меньше нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения" (например: менее 0,025 мг/кг*, где * 0,025 мг/кг - предел определения ацетамиприда в капусте).

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6-02 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода "добавок".

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг; при этом:

где - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

где X', X, C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

где X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.