"МУК 4.1.2783-10. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств метрафенона в воде, почве, зеленой массе, зерне и соломе зерновых культур, ягодах и соке винограда методом ВЭЖХ. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 24.11.2010)

1. Разработаны сотрудниками ГНУ Всероссийского НИИ защиты растений.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 14.10.2010 N 2).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 24 ноября 2010 г.

4. Введены в действие с момента утверждения.

5. Введены впервые.

Свидетельство об аттестации методики N 01.5.04.683 от 25.06.2010.

Настоящий документ устанавливает методику определения остаточных количеств метрафенона в воде в диапазоне концентраций 0,001 - 0,01 мг/кг, в почве, зеленой массе и зерне зерновых культур, ягодах и соке винограда в диапазоне концентраций 0,01 - 0,1 мг/кг, в соломе зерновых культур 0,02 - 0,2 мг/кг.

Действующее вещество: метрафенон.

Структурная формула (не приводится).

3'-Бром-2,3,4,6'-тетраметокси-2',6-диметилбензофенон (IUPAC).

Молекулярная масса: 409,3.

Химически чистое вещество представляет собой белый кристаллический порошок.

Температура плавления 99,2 - 100,8 °С.

Давление пара 0,153 мРа (20 °С); 0,256 мРа (25 °С).

Растворимость в воде (мг/куб. дм, 20 °С): 0,552 (pH 5); 0,492 (pH 7); 0,457 (pH 9).

Растворимость в органических растворителях (г/куб. дм, 20 °С): ацетон - 403, ацетонитрил - 165, дихлорметан - 1950, этилацетат - 261, н-гексан - 4,8, метанол - 26,1, толуол - 363.

Область применения: фунгицид превентивного действия с антиспорулянтной активностью и целебными свойствами. Используется для контроля глазковой пятнистости, вызываемой Pseudocercosporella herpotrichoides, и ложной мучнистой росы, вызываемой Erysiphe graminis, на посевах ячменя, озимой и яровой пшеницы.

В России для метрафенона гигиенические нормативы не установлены.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Методика основана на определении метрафенона методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его экстракции из образцов смесью органического растворителя с водой и очистки экстракта посредством двухстадийной твердофазной экстракции на патронах, заполненных гексадецилсиликагелем и обычным силикагелем.

Идентификация метрафенона проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов квалификации не ниже указанной.

Допускается использование другого вспомогательного оборудования с техническими характеристиками не хуже указанных.

4.1. При проведении работы необходимо соблюдать требования техники безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005, ГОСТ 12.1.007). Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны".

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Перед началом анализа колонку (Acquity ВЕН С18) кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 - 0,2 куб. см/мин.) до стабилизации нулевой линии.

7.2.1. Приготовление подвижной фазы: в мерную колбу вместимостью 1 куб. дм помещают 650 куб. см ацетонитрила и доводят объем до метки водой для ВЭЖХ.

7.3.1. Основной раствор с концентрацией 1,0 мг/куб. см: точную навеску метрафенона (50 +/- 0,5 мг) помещают в мерную колбу вместимостью 50 куб. см, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки тем же растворителем.

Градуировочные растворы с концентрациями 0,1; 0,2; 0,4; 0,8 и 1,0 мкг/куб. см готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы.

7.3.2. Раствор N 1 с концентрацией 1,0 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 100 куб. см вносят 0,1 куб. см основного раствора и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.3. Раствор N 2 с концентрацией 0,8 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см вносят 8,0 куб. см раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.4. Раствор N 3 с концентрацией 0,4 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 4,0 куб. см раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.5. Раствор N 4 с концентрацией 0,2 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 2,0 куб. см раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.6. Раствор N 5 с концентрацией 0,1 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 1,0 куб. см раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в течение 1 недели, градуировочные растворы - в течение суток.

7.4.1. Приготовление элюента 1: в мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 50 куб. см гексана и доводят объем до метки ацетоном.

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика -концентрация метрафенона в растворе) в хроматограф вводят по 10 куб. мм градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации метрафенона в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

где S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

7.6.1. Подготовка патронов Диапак С16. Непосредственно перед употреблением через патрон последовательно пропускают по 2 куб. см ацетонитрила и воды.

7.6.2. Подготовка патронов, заполненных силикагелем. Непосредственно перед употреблением через патрон последовательно пропускают 2,5 куб. см гексана.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.1979).

Пробы ягод винограда хранятся до анализа в морозильной камере при температуре -18 °С. Пробы сока хранят в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в течение 3 суток, при температуре -18 °С - в течение месяца (в пластиковых бутылях).

Для длительного хранения пробы почвы, зерна и соломы подсушиваются при комнатной температуре в отсутствии прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в течение года. Пробы зерна и соломы подсушивают до критической влажности и хранят в воздушно-сухом состоянии. Перед анализом сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм, пробы зерна и соломы измельчают на лабораторной мельнице.

50 куб. см воды пропускают через патрон Диапак С16. Фильтрат отбрасывают. Метрафенон элюируют 3 куб. см ацетона. Элюат выпаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при температуре бани не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 0,5 куб. см подвижной фазы. 10 куб. мм полученного раствора вводят в хроматограф.

20 г образца помещают в коническую колбу вместимостью 250 куб. см и экстрагируют 50 куб. см смеси ацетона с водой в соотношении 4:1 в ультразвуковой бане в течение 15 мин. Массу фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр "красная лента". Экстракцию повторяют дважды с тем же объемом экстрагента. Объединенный экстракт упаривают на вакуумном ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 40 °С до полного удаления ацетона. Водный остаток пропускают через два патрона Диапак С16, соединенных последовательно. Фильтрат отбрасывают. Патрон промывают 2 куб. см воды. Фильтрат отбрасывают. Метрафенон элюируют 3 куб. см ацетона. Элюат упаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 2,0 куб. см гексана и вносят в патрон с силикагелем. Фильтрат отбрасывают. Патрон промывают 2 куб. см гексана. Фильтрат отбрасывают. Метрафенон элюируют 2 куб. см элюента 1. Элюат упаривают досуха. Остаток растворяют в 2 куб. см подвижной фазы и 10 куб. мм полученного раствора вводят в хроматограф.

Сок фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр "красная лента". 20 куб. см сока пропускают через патрон Диапак С16. Фильтрат отбрасывают. Патрон промывают 2 куб. см воды. Фильтрат отбрасывают. Метрафенон элюируют 3 куб. см ацетона. Далее определение проводят по п. 9.2.

20 г зерна или измельченной зеленой массы или 5 г соломы помещают в коническую колбу вместимостью 250 куб. см и экстрагируют 50 куб. см смеси ацетона и воды в соотношении 4:1 в ультразвуковой бане в течение 15 мин. Массу фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр "красная лента". Экстракцию повторяют дважды с тем же объемом экстрагента. Объединенный экстракт упаривают на вакуумном ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 40 °С до полного удаления ацетона. Водный остаток пропускают через 2 патрона Диапак С16, соединенных последовательно. Фильтрат отбрасывают. Патроны промывают 2 куб. см воды. Фильтрат отбрасывают. Метрафенон элюируют 4 куб. см ацетонитрила. Элюат выпаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 2,0 куб. см гексана и вносят в патрон с силикагелем. Фильтрат отбрасывают. Дальнейшее определение проводят по п. 9.2. Перед хроматографическим анализом сухой остаток образцов зерна и зеленой массы растворяют в 2 куб. см, а соломы - в 1 куб. см подвижной фазы. По 10 куб. мм полученных растворов вводят в хроматограф.

Ультраэффективный жидкостной хроматограф "ACQUITY" фирмы Waters с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка ACQUITY UPLC ВЕН С18 (2,1 х 100) мм, 1,7 мкм (Waters). Температура колонки (30 +/- 1) °С. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и воды в соотношении 65:35. Скорость потока элюента: 0,2 куб. см/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора 220 нм. Объем вводимой пробы 10 куб. мм.

Время удерживания метрафенона (5,5 +/- 0,3) мин.

Линейный диапазон детектирования сохраняется в интервале концентраций 0,1 - 1,0 мкг/куб. см.

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание метрафенона в воде, почве, зеленой массе зерне и соломе зерновых культур, ягодах и соке винограда (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

Содержание остаточных количеств метрафенона в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор метрафенона с концентрацией 1,0 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения" (например: менее 0,01 мг/кг <*>).

--------------------------------

<*> 0,01 мг/кг - предел обнаружения метрафенона в почве, соке и ягодах винограда, зерне и зеленой массе зерновых культур.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):