"МУ 3.3.2.2124-06. 3.3.2. Медицинские иммунобиологические препараты. Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионеллеза. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 17.08.2006)

1. Разработаны: Российским научно-исследовательским противочумным институтом "Микроб" (И.А. Дятлов, И.В. Шульгина, Т.Н. Донская, О.П. Плотников, Г.Ю. Куляш, А.К. Никифоров); Государственным научно-исследовательским институтом стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича (Л.В. Саяпина, Т.И. Анисимова); Ростовским научно-исследовательским противочумным институтом (Л.С. Подосинникова, Г.Д. Харабаджахян, Н.Р. Телесманич, А.Б. Мазрухо); Иркутским научно-исследовательским противочумным институтом (Э.С. Каретникова, О.Г. Татарникова).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол N 2 от 11.07.06).

3. Утверждены и введены в действие Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 17 августа 2006 г.

4. Введены взамен "Инструкции по бактериологическому контролю диагностических питательных сред для холерного вибриона" (утв. ГУКИ МЗ СССР 02.02.83), "Инструкции по бактериологическому контролю диагностических питательных сред для чумного микроба" (утв. ГУКИ МЗ СССР 07.09.83), "Инструкции по бактериологическому контролю диагностических питательных сред для туляремийного микроба" (утв. в Иркутском НИ противочумном институте Сибири и Дальнего Востока 08.10.82).

Методические указания по контролю диагностических питательных сред по биологическим показателям предназначены для контроля питательных сред лабораторного и промышленного изготовления, используемых при диагностике особо опасных инфекций (ООИ), по биологическим показателям.

Настоящими Методическими указаниями необходимо руководствоваться бактериологам лабораторий противочумных учреждений, отделов особо опасных инфекций центров гигиены и эпидемиологии Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, специализированных лабораторий учреждений здравоохранения.

2.1. Основы законодательства Российской Федерации об охране здоровья граждан.

2.2. Медицинские иммунобиологические препараты. Основные термины и положения. РД 42-28-24-88.

2.3. Положение о государственной регистрации сертификации и государственном контроле за качеством медицинских иммунобиологических препаратов в Российской Федерации. Постановление ГК СЭН от 03.07.94 N 5.

2.4. Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности. СП 1.3.1285-03.

2.5. Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами. СП 1.2.731-99.

2.6. Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности. СП 1.2.036-95.

2.7. Медицинские иммунобиологические препараты. Государственные испытания и регистрация новых медицинских иммунобиологических препаратов. СП 3.3.2.561-96.

3.1. Питательные среды по своему назначению подразделяются на диагностические и среды для выращивания биомассы при производстве различных медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП).

3.2. Диагностические среды включают: среды накопительные и для культивирования; для выделения конкретного возбудителя (элективные и селективные); дифференциальные (содержащие индикаторы, красители и т.д.); для идентификации, позволяющие по отдельным признакам (отношение к углеводам, мочевине, подвижности и т.п.) проводить идентификацию микроорганизмов.

3.3. Исследования по контролю качества питательных сред организуют и проводят в соответствии с санитарными правилами СП 1.3.1285-03 и СП 1.2.731-99.

4.1. Чувствительность определяют по максимальному разведению культуры, при котором на всех засеянных чашках (пробирках) наблюдается рост. По этому показателю оценивают диагностические среды для выделения и дифференциальные.

4.2. Показатель прорастания - по проценту выросших колоний микроорганизмов от числа засеянных клеток. По этому показателю оценивают питательные среды для культивирования.

4.3. Эффективность - по выходу микробных клеток с 1 мл питательной среды. По этому показателю контролируют питательные среды для культивирования и среды, используемые в производстве МИБП.

4.4. Показатель стабильности основных свойств микроорганизмов при выращивании на испытуемой среде - по отношению числа атипичных по морфологии, биохимическим, серологическим, фаголизабельным и другим свойствам колоний к числу выросших на агаровых пластинках колоний тест-штаммов. Определяют для всех сред.

4.5. Дифференцирующие свойства - по выраженности отличительных видовых и других признаков микроорганизмов определяют для сред дифференциальных и идентификации.

4.6. Показатель ингибиции - по степени подавляющего воздействия на постороннюю микрофлору; выражается количеством микробов-ассоциантов, которое не растет на среде, или числом сформировавшихся колоний микробов-ассоциантов, не препятствующих выделению возбудителя. Контролируют среды для выделения, дифференциальные и для накопления.

4.7. Показатель скорости роста - по минимальному времени вырастания культуры, для диагностических сред.

Для лабораторной диагностики возбудителей особо опасных инфекций используют питательные среды, имеющие сертификат производства и лицензию на производство, хранение и распространение, или среды, приготовленные по рецептуре, изложенной в методических руководствах и нормативных документах.

5.1. Качество питательных сред проверяют противочумные учреждения, применяя тест-штаммы I - IV групп патогенности, предусмотренные для контроля конкретных питательных сред. Лаборатории отделов особо опасных инфекций проводят контроль питательных сред с использованием тест-штаммов III - IV групп патогенности.

5.2. Для лицензированных питательных сред бактериологическому контролю подлежит первая варка и по одной варке ежегодно от каждой серии, а также все варки серии при изменении условий ее хранения или приготовления.

5.3. Для нелицензированных питательных сред, приготовленных по утвержденной рецептуре, контролируют каждую варку.

5.4. На контроль направляют по 200 мл плотных и по 100 мл жидких питательных сред. На этикетке указывают предприятие-изготовитель, название питательной среды, номер серии, дату приготовления, срок годности. Упаковка должна исключать возможность боя посуды и загрязнение среды при транспортировании.

5.5. Ингибиторы (теллурит калия, генцианвиолет и др.), среды с ингибиторами и стимуляторами роста (гемолизированная кровь и др.) проверяют противочумные учреждения.

5.6. Препаратами сравнения (контроль) должны быть ранее проверенные качественные питательные среды (аналоги по назначению).

5.7. Срок годности готовых питательных сред определен в нормативной документации и инструкциях по применению каждой конкретной среды.

Для бактериологического контроля питательных сред, предназначенных для культивирования и выделения возбудителя чумы, используют штаммы Yersinia pestis EV, Yersinia pestis Р-1680 - Закавказского горного очага и Yersinia pestis И-2377 - Горно-Алтайского очага.

В качестве тест-штамма при контроле ингибиторов посторонней микрофлоры используют Escherichia coli 18, Bacillus cereus 8 и Proteus vulgaris НХ 19 N 222. Тест-штаммы получают из ГИСК им. Л.А. Тарасевича через Государственную коллекцию патогенных бактерий "Микроб".

При бактериологическом контроле сред для идентификации чумного и псевдотуберкулезного микробов по признаку ферментации мочевины и углеводов (ЦДС) используют тест-штаммы Yersinia pestis EV и Yersinia pseudotuberculosis И-199, который получают из Иркутского НИПЧИ Сибири и Дальнего Востока.

Тест-штаммы Y. pestis EV, Y. pestis Р-1680, Y. pestis И-2377, E. coli 18, P. vulgaris НХ 19 N 222, B. cereus 8 и Y. pseudotuberculosis И-199 хранят в лиофилизированном состоянии при температуре (5 +/- 1) °С до сохранения их свойств согласно п. 6.1.3. Рабочие субкультуры хранят в 0,4%-м агаре Хоттингера рН 7,2 +/- 0,1 (по МУК 4.1/4.2.588-96, с. 46) под слоем стерильного вазелинового масла или на скошенном агаре Хоттингера рН 7,2 +/- 0,1 в запаянных пробирках при температуре (5 +/- 1) °С.

Пересевы культур проводят не менее 1 раза в 3 мес., но не более четырех раз. По истечении этого срока для работы вскрывают новую ампулу с культурой.

Тест-штамм Y. pseudotuberculosis И-199 должен быть типичным по культурально-морфологическим и биохимическим свойствам, лизироваться псевдотуберкулезным бактериофагом. На агаровых средах при температуре (28 +/- 1) °С тест-штамм псевдотуберкулезного микроба растет в виде бугристых хромогенных колоний, в бульоне - равномерное помутнение; в мазках - грамотрицательные палочки. Тест-штамм должен ферментировать глюкозу, арабинозу, маннит, рамнозу, мочевину; не должен расщеплять лактозу, сахарозу; должен обладать подвижностью.

Тест-штамм P. vulgaris НХ 19 N 222 должен быть типичным по культурально-морфологическим и биохимическим свойствам. В бульоне через 18 - 24 ч роста при температуре (37 +/- 1) °С - равномерное помутнение с пленкой на поверхности, на агаровых средах - в виде мутных сероватых роящихся колоний. В мазках - грамотрицательные палочки. Тест-штамм P. vulgaris должен ферментировать с образованием кислоты и газа глюкозу, маннозу, сахарозу и не расщеплять маннит и арабинозу.

Культуры каждого тест-штамма из ампулы или со среды хранения пересевают в пробирку с бульоном Хоттингера рН 7,2 +/- 0,1 (МУК 4.1/4.2.588-96, с. 45) и на чашки Петри с агаром Хоттингера рН 7,2 +/- 0,1. Посевы с Y. pestis EV, Y. pestis Р-1680, Y. pestis И-2377 и Y. pseudotuberculosis И-199 инкубируют при температуре (28 +/- 1) °С в течение (48 +/- 1) ч; посевы с E. coli 18, P. vulgaris НХ 19 N 222 и B. cereus 8 - при температуре (36 +/- 1) °С в течение (24 +/- 1) ч. Выросшие на питательном агаре культуры каждого штамма проверяют визуально на чистоту роста и пересевают на скошенный в пробирках питательный агар. В случае отсутствия роста на питательной среде для последующего пассажа используют культуру, выращенную на питательном бульоне. После инкубации посевов Y. pestis EV, Y. pestis Р-1680, Y. pestis И-2377 и Y. pseudotuberculosis И-199 при температуре (28 +/- 1) °С и E. coli 18, P. vulgaris НХ 19 N 222 и B. cereus 8 - при температуре (36 +/- 1) °С в течение (24 +/- 1) ч. культуры используют для контроля питательных сред.

Для посева на испытуемые среды используют культуры тест-штаммов не более 3 - 4 пассажей на питательных средах.

Плотные питательные среды должны обеспечивать рост чумного микроба через 48 ч инкубации на всех агаровых пластинках при высеве 10 м.к., показатель прорастания при высеве 100 м.к. должен быть не менее 50%. Начальный рост чумного микроба ("кружевные платочки") должен быть через 24 ч инкубации; типичные колонии диаметром не менее 1 мм - через 48 ч. Морфология микробов - грамотрицательные биполярные полиморфные палочки.

Стабильность основных свойств чумного микроба определяют по отношению числа атипичных по морфологии колоний тест-штаммов к общему числу колоний на чашках с испытуемыми средами, а также по биохимическим свойствам и лизабельности бактериофагом диагностическим чумным Л-413С. Оценку морфологии проводят на чашках, где выросло не менее 25 и не более 150 отдельных колоний. При этом оценивают:

а) характер роста культур в жидкой среде (хлопьевидный осадок, прозрачная надосадочная жидкость), форму, структуру, характер роста колоний и их величину на плотной среде (шероховатые колонии не менее 1 мм в диаметре с кружевной периферией);

б) морфологию микробов - грамотрицательные биполярные полиморфные палочки. Количество атипичных колоний тест-штаммов не должно составлять более 1%.

Биохимические свойства и лизабельность фагами должны соответствовать изложенным в п. 1.3, их проверяют только при государственных испытаниях новых питательных сред.

Дифференцирующие свойства питательной среды ЦДС, применяемой для идентификации чистых культур возбудителей чумы и псевдотуберкулеза, определяют с использованием тест-штаммов Y. pestis EV и Y. pseudotuberculosis И-199 по признаку ферментации углеводов и мочевины.

Для проведения контроля среды используют культуры тест-штаммов, выращенные при температуре (28 +/- 1) °С в течение (23 +/- 1) ч на скошенном в пробирках агаре Хоттингера рН 7,2 +/- 0,1. По одной бактериологической петле N 2 по Чаплевскому (d = 2 мм) культуры Y. pestis EV и Y. pseudotuberculosis И-199 вносят "уколом" в столбик с 5 мл питательной среды, затем той же петлей производят посев "штрихом" на скошенную поверхность среды. Одну пробирку со средой оставляют незасеянной (контроль). Посевы инкубируют в течение 48 ч при температуре (28 +/- 1) °С. Определяют наличие роста тест-штаммов и изменение цвета среды визуально. В последнем случае контролем служит пробирка со стерильной средой.

При росте Y. pestis EV столбик среды окрашивается в красно-оранжевый цвет, скошенная поверхность в сине-зеленый; при росте Y. pseudotuberculosis И-199 столбик и скошенная поверхность среды окрашиваются в синий цвет.

При выделении возбудителя чумы из биологического материала или объектов внешней среды для подавления сопутствующей микрофлоры применяют среды с генцианвиолетом (С.1. 42555), кристаллвиолетом или питательную среду для выделения чумного микроба. Для приготовления рабочего раствора генцианвиолета готовят насыщенный спиртовой раствор: 1 г сухого препарата заливают 10 мл 96%-го спирта и оставляют на сутки при температуре (22 +/- 1) °С. При необходимости срочного приготовления раствора его выдерживают в термостате при температуре (37 +/- 1) °С в течение 2 - 3 ч. После соответствующей экспозиции 1 мл спиртового насыщенного раствора генцианвиолета прибавляют к 99 мл дистиллированной воды и получают спиртово-водный рабочий раствор (1:1000).

Ингибирующие свойства среды определяют как по отношению к чумному микробу, так и по отношению к микробам-ассоциантам. Для выбора доз генцианвиолета испытывают следующие конечные концентрации препарата в агаре: 1:100000, 1:150000, 1:200000, 1:250000, 1:300000, 1:400000, для чего к 100 мл расплавленного агара добавляют соответственно 1,0; 0,66; 0,5; 0,4; 0,3; 0,25 мл рабочего раствора генцианвиолета.

Для работы выбирают разведения генцианвиолета, резко тормозящие ползучий рост вульгарного протея и не угнетающие рост чумного микроба. На агаровых пластинках с генцианвиолетом без протея среднее число колоний чумного микроба должно быть не менее 30. На агаре без ингибитора должен быть сплошной рост протея. При посеве чумного микроба без протея среднее число колоний на агаре без генцианвиолета должно быть не менее 50.

В целях ингибиции посторонней микрофлоры можно использовать кристаллвиолет в той же концентрации после соответствующего контроля и определения оптимальных доз.

Для стимуляции роста чумного микроба на питательных средах используют сульфит натрия по ГОСТ 195-77 и кровь гемолизированную.

Раствор сульфита натрия готовят ex temporae. Навеску препарата (0,25 г) растворяют в 10 мл стерильной дистиллированной воды и подогревают на пламени горелки до кипения. Раствор в количестве 1 мл добавляют к 100 мл расплавленного агара, хорошо перемешивают и разливают по чашкам Петри. К 10 мл питательного бульона добавляют 0,1 мл (2 капли) раствора сульфита натрия.

Сульфит натрия проверяют через 2 - 3 месяца, т.к. при неправильном хранении (в негерметичной посуде, на свету) препарат окисляется до сульфата натрия, который не стимулирует роста чумного микроба.

В зависимости от проверяемой среды и целей контроля в качестве тест-штаммов используют Vibrio cholerae О1 Р-1 (145) классического биовара, Vibrio cholerae О1 М-878 биовара эльтор, Vibrio cholerae не О1 Р-9741, Escherichia coli 18 и Proteus vulgaris НХ 19 N 222, которые получают из ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Контроль питательных сред для выделения галофильных вибрионов проводят с тест-штаммом Vibrio parahaemolyticus АТСС 17802, который получают из коллекции музея живых культур Ростовского-на-Дону НИПЧИ. В лабораториях, имеющих разрешение на работу с возбудителем холеры (II группа патогенности), контроль качества питательных сред проводят с V. cholerae Р-1 (145) классического биовара, V. cholerae О1 М-878 биовара эльтор и V cholerae не О1 Р-9741. Для контроля сред в лабораториях, не имеющих разрешения на работу с возбудителем холеры, используют штамм V. cholerae не О1 Р-9741. Тест-штаммы E. coli 18 и P. vulgaris НХ 19 N 222 используют для контроля сред с ингибиторами посторонней микрофлоры.

Тест-штаммы V. cholerae Р-1 (145) классического биовара, V. cholerae М-878 биовара эльтор, V. cholerae не О1 Р-9741 и V. parahaemolyticus АТСС 17802 хранят в лиофилизированном состоянии при температуре 4 - 6 °С не более 5 лет или в 0,3 - 0,4%-м питательном агаре рН 7,7 +/- 0,1, V. parahaemolyticus АТСС 17802 - в 0,3 - 0,4%-м питательном агаре рН 7,7 +/- 0,1 с 3% натрия хлорида под слоем стерильного вазелинового масла в защищенном от света месте при температуре 18 - 25 °С. Пересевы культур проводят не менее 1 раза в 3 мес., но не более четырех раз. По истечении этого срока для работы вскрывают новую ампулу с культурой.

Условия хранения тест-штаммов E. coli 18 и P. vulgaris HX 19 N 222 должны соответствовать требованиям, изложенным в п. 6.1.2.

Тест-штаммы V. cholerae О1 и не О1 должны обладать типичными для S-формы культуральными, морфологическими, биохимическими и серологическими свойствами.

В бульоне Мартена рН 7,7 +/- 0,1 через 18 - 24 ч роста вибрионы должны давать равномерное помутнение среды и нежную пленку на поверхности, на агаровых средах рН 7,7 +/- 0,1 через 12 - 24 ч - гладкие, округлые, прозрачные (для V. cholerae не О1 - полупрозрачные), голубоватые в проходящем свете колонии диаметром 1,0 - 1,5 мм. В мазках при окраске по Граму выявляются грамотрицательные изогнутые палочки.

Тест-штаммы должны ферментировать с образованием кислоты сахарозу, маннозу и не расщеплять арабинозу. Штаммы V. cholerae классического и эльтор биоваров должны агглютинироваться до титра диагностическими холерными сыворотками О1 адсорбированной и гомологичными типовыми (Инаба или Огава), лизироваться только гомологичными (классическим или эльтор) фагами. Тест-штамм V. cholerae не О1 не должен агглютинироваться холерными сыворотками О1 группы, обладать чувствительностью к холерным и эльтор диагностическим бактериофагам.

Тест-штаммы холерного вибриона проверяют на отсутствие диссоциации путем определения агглютинабельности культуры в растворе трипофлавина. Для постановки данного теста агаровую культуру каждого из тест-штаммов растирают петлей в капле 0,2%-го водного раствора трипофлавина. Образование агглютината свидетельствует о наличии SR-диссоциации в культуре.

Тест-штамм V. parahaemolyticus АТСС 17802 при культивировании на питательном агаре рН 7,7 +/- 0,1 с 3% натрия хлорида должен формировать колонии правильной круглой формы с ровными краями, полупрозрачные, с блестящей поверхностью, диаметром не менее 1,0 мм. При окраске по Граму в мазках выявляются прямые или слегка изогнутые грамотрицательные палочки. Штамм должен обладать оксидазной активностью, ферментировать с образованием кислоты без газа маннозу и не расщеплять сахарозу, ферментировать глюкозу, декарбоксилировать лизин и орнитин и не ферментировать аргинин.

Тест-штаммы E. coli 18 и P. vulgaris НХ 19 N 222 должны соответствовать требованиям, изложенным в п. 6.1.3.

Тест-штаммы холерных вибрионов, хранящихся в лиофилизированном виде или на полужидком агаре Хоттингера, высевают в пробирки с 5 мл 1%-й пептонной воды или 5 мл бульона Мартена рН 7,7 +/- 0,1 и инкубируют при температуре (37 +/- 1) °С в течение 3 - 5 ч, после чего высевают бактериологической петлей N 2 на чашку с питательной средой для выделения и культивирования холерного вибриона, с агаром Мартена или Хоттингера рН 7,7 +/- 0,1 (I-й пассаж). Через 18 - 20 ч культивирования с поверхности агара отбирают типичные по морфологии колонии холерного вибриона и пересевают их на агаровые пластинки вышеуказанных питательных сред, инкубируют при температуре (37 +/- 1) °С в течение 3 - 5 ч, после чего используют для контроля (II-й пассаж).

Подготовка тест-штаммов E. coli 18 и P. vulgaris НХ 19 N 222 осуществляется согласно п. 6.1.4.

Плотные питательные среды считают пригодными, если на них вырастают типичные по морфологии колонии, соответствующие требованиям п. 6.2.3 для каждого тест-штамма, диаметром не менее 1,0 мм, в количестве 30% от расчетной посевной дозы 100 м.к., при наличии единичных колоний на 3 чашках Петри с посевной дозой 10 м.к. На контрольном агаре при посеве 100 м.к. каждого тест-штамма должно вырастать не менее 30 колоний, при посеве 10 м.к. - единичные колонии на всех чашках. Расчет ведется по среднему числу колоний на всех чашках.

При определении стабильности основных свойств тест-штаммов должно выявляться не более двух атипичных по морфологии, биохимическим, серологическим и фаголизабельным свойствам колоний на каждой чашке при посевной дозе 100 м.к.

Подлежащий проверке основной раствор пептона разводят в 10 раз дистиллированной водой до 1%-й концентрации в пересчете на пептон, разливают по 100 мл во флаконы, закрывают ватно-марлевыми пробками и стерилизуют при 121 °С в течение 30 мин. Контролируемая 1%-я пептонная вода разливается и стерилизуется аналогично, но без предварительного разведения. В качестве контрольной среды используют заранее отконтролированную и соответствующую требованиям настоящего документа 1%-ю пептонную воду.

Приготовление взвесей тест-штаммов холерного вибриона, прошедших предварительную подготовку - согласно п. 6.2.4. Контроль жидких накопительных питательных сред осуществляют по методу, изложенному в п. 6.2.5.

Через 6 ч инкубации при температуре (37 +/- 1) °С из каждого засеянного флакона бактериологической петлей N 5 производят высев культуры с поверхности среды на 3 чашки Петри с заранее отконтролированным щелочным агаром рН 7,7 +/- 0,1. Посевы на агаровых пластинках инкубируют при температуре (37 +/- 1) °С в течение 12 - 18 ч.

Определение показателя эффективности осуществляют по методике, изложенной в п. 6.1.6. Контроль проводят с использованием тест-штаммов V. cholerae О1 Р-1 (145) классического биовара, V. cholerae О1 М-878 биовара эльтор и Vibrio cholerae не О1 Р-9741. В учреждениях, где нет разрешения на работу с возбудителями II группы патогенности, этот показатель определяют только со штаммом Vibrio cholerae не О1 Р-9741. Подготовку тест-штаммов проводят согласно п. 6.2.4.

Контроль питательных сред проводят по следующим показателям: чувствительности к тест-штаммам холерных вибрионов; ингибиции тест-штаммов холерных вибрионов и микробов-ассоциантов - E. coli 18 и P. vulgaris НХ 19 N 222.

Чувствительность плотных элективных сред проверяют и оценивают по методике, указанной в п. 6.2.5. Посевы инкубируют при температуре (37 +/- 1) °С в течение 18 ч.

При проверке качества солевых консервантов определяют выживаемость в них тест-штамма V. cholerae не О1 Р-9741. Для этого в 3 пробирки с 5 мл консерванта вносят по 0,1 мл взвеси, содержащей 100 м.к. культуры. Одновременно для контроля количества жизнеспособных клеток в посевном материале проводят посев культуры этой дозы на ранее отконтролированный щелочной агар. Пробирки со взвесями культуры в консерванте оставляют при комнатной температуре на 3 сут., после чего содержимое каждой пробирки полностью переносят в отдельный флакон со 100 мл 1%-й пептонной воды рН 8,2 - 8,4 с высокой чувствительностью к росту холерного вибриона и инкубируют в течение 6 ч при температуре (37 +/- 1) °С. Затем из каждого флакона производят высев петлей N 5 на агаровую пластинку высококачественной среды. Консервант считают годным при наличии роста холерного вибриона.

Порядок приготовления и хранения 1%-й пептонной воды с теллуритом калия.

Приготовление рабочих растворов. Теллурит калия выпускается промышленностью в виде сухого порошка или 2%-го раствора. Каждая серия препарата, используемого для приготовления питательных сред, при диагностике холеры должна быть проверена на ингибирующие свойства в отношении холерного вибриона и кишечной палочки. В работе используют 0,025% (1:4000) раствор теллурита калия. Для его приготовления к 5 мл 2%-го раствора добавляют 395 мл стерильной дистиллированной воды. Из сухого препарата рабочий раствор готовят разведением 50,0 мг теллурита калия в 200 мл стерильной дистиллированной воды.

Хранение теллурита калия и его рабочих растворов. Сухой порошок хранят в темном месте при комнатной температуре. Срок годности не ограничен.

Концентрированный или 2%-й раствор теллурита калия хранят в темном месте в герметично закрытой посуде. Срок годности не более 4 лет.

Рабочий раствор теллурита калия хранят в холодильнике и используют в течение 7 дней после приготовления.

Почернение или помутнение растворов свидетельствует об их непригодности.

Приготовление пептонной воды с теллуритом калия. К 1%-й пептонной воде теллурит калия добавляют перед ее использованием в рабочей концентрации, оттитрованной для каждой серии препарата. Пептонная вода должна иметь щелочную реакцию среды (рН 8,0).

Хранение пептонной воды с теллуритом калия. Срок хранения пептонной воды с теллуритом калия не более 24 - 48 ч при температуре 4 - 20 °С в защищенном от света месте.

Проверка качества теллурита калия. Для выбора дозы рабочего раствора теллурита калия испытывают следующие конечные концентрации препарата в пептонной воде: 1:50000, 1:100000, 1:200000, 1:300000. С этой целью готовят 2 ряда пробирок со стерильной, ранее проверенной 1%-й пептонной водой. В первом ряду определяют ингибирующие свойства теллурита калия по отношению к чистой культуре холерного вибриона, во втором - к смеси этой культуры с культурой кишечной палочки. В качестве тест-штаммов используют V. cholerae Р-1 (145) классического биовара и E. coli 18.

В 9 - 10 пробирки теллурит калия не вносится, они являются контролем чувствительности среды без ингибитора к росту культур тест-штаммов. Цифры в скобках обозначают конечные концентрации теллурита калия в среде.

Во второй ряд добавляют по 0,2 мл смеси суспензий холерного вибриона и кишечной палочки.

Через 6 ч и 18 - 24 ч инкубации посевов при температуре (37 +/- 1) °С из всех пробирок делают высев петлей N 5 на чашки с щелочным агаром рН 7,8 +/- 0,1. Учет результатов проводят через 18 - 24 ч.

Рабочим разведением теллурита калия считают разведение, при котором в смеси холерного вибриона с кишечной палочкой резко тормозится рост последней и не угнетается рост холерного вибриона.

Посев чистой культуры холерного вибриона из этого разведения не должен заметно отличаться от контроля.

Плотные питательные среды считают пригодными, если они обеспечивают рост 10 м.к. тест-штаммов V. cholerae на всех засеянных агаровых пластинках через 12 ч инкубации посевов при температуре (37 +/- 1) °С.

Для бактериологического контроля питательных сред, предназначенных для диагностики туляремии, используют тест-штаммы Francisella tularensis holarctica 15 НИИЭГ, 503/840, F. tularensis neoarctica В 399 A-cole и F. tularensis mediaasiatica 120. Тест-штаммы F. tularensis 15 НИИЭГ получают из ГИСК им. Л.А. Тарасевича, 503/840, В 399 A-cole и 120 - в НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи или Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб".

В качестве тест-штаммов при определении ингибиторов посторонней микрофлоры используют P. vulgaris НХ 19 N 222, E. coli 18 и B. cereus 8.

Тест-штаммы туляремийного микроба хранят в лиофилизированном состоянии при температуре 2 - 8 °С до сохранения свойств согласно п. 6.3.3. Рабочие субкультуры хранят на среде Мак-Коя или на питательной среде для выделения и культивирования туляремийного микроба (FT-агар) при температуре 4 - 6 °С. Пересевы культур проводят не менее 1 раза в 3 мес., но не более четырех раз. По истечении этого срока для работы вскрывают новую ампулу с культурой.

Порядок хранения тест-штаммов P. vulgaris НХ 19 N 222, E. coli 18 и B. cereus 8 изложен в п. 6.1.2.

Тест-штаммы туляремийного микроба должны обладать типичными культуральными, морфологическими, биохимическими и серологическими свойствами.

В мазках, окрашенных по Граму, туляремийный микроб имеет вид мелких грамотрицательных кокков или коккобактерий. Агглютинабельность культур определяют в развернутой реакции агглютинации с сывороткой диагностической туляремийной. Тест-культуры в SR-форме должны давать положительную реакцию с сывороткой в разведении не ниже 1/2 ее титра; колонии в R-форме дают замедленную мелкохлопчатую агглютинацию в более низком титре.

Тест-штаммы E. coli 18, P. vulgaris НХ 19 N 222 и B. cereus 8 должны соответствовать требованиям, изложенным в п. 6.1.3.

Тест-штаммы. F. tularensis 15 НИИЭГ, хранящиеся в лиофилизированном состоянии, перед проведением контроля питательных сред пересевают на желточную среду Мак-Коя или питательную среду FT-агар и инкубируют при (37 +/- 1) °С в течение 48 ч. Затем культуры пересевают повторно на среду Мак-Коя или FT-агар (II пассаж) и после двухсуточной инкубации используют для работы. Культуры, хранившиеся на желточной среде, используют для работы после однократного пересева.

Подготовка культур тест-штаммов E. coli 18, P. vulgaris 19 и B. cereus 8 осуществляется согласно п. 6.1.4.

Оценку морфологии проводят на чашках, где выросло не менее 40% от числа засеянных клеток. Типичными считают беловато-серые блестящие колонии не менее 1,0 - 1,5 мм в диаметре (диаметр колоний в популяции не должен отличаться более, чем в два раза). В мазках - грамотрицательные коккобактерии. Появление на среде более 10% колоний серого цвета по сравнению с исходными данными свидетельствует о непригодности среды - способности усиливать процессы диссоциации туляремийного микроба.

Тест-культуры должны агглютинироваться сывороткой диагностической туляремийной в разведении не ниже S ее титра. Агглютинабельность тест-штаммов, выращенных на плотных питательных средах, проверяют в случае несоответствия их по морфологии, а также если на предприятии изменена технология приготовления среды или при использовании новой серии гидролизата.

Определение показателя эффективности осуществляют по методике, изложенной в п. 6.1.6. Контроль проводят с использованием тест-штаммов F. tularensis 15 НИИЭГ, 503/840, F. tularensis В 399 A-cole и F. tularensis 120. Подготовку тест-штаммов проводят согласно п. 6.3.4.

При выделении возбудителя туляремии из различных объектов исследования применяют элективные питательные среды для выделения возбудителя туляремии, в состав которых входят ингибиторы сопутствующей микрофлоры.

Плотные питательные среды считаются пригодными, если они на 3 - 7-е сутки обеспечивают рост типичных по морфологии колоний тест-штаммов туляремийного микроба на всех агаровых пластинках при посеве 10 м.к., не усиливают диссоциацию микроорганизмов. Элективные питательные среды должны ингибировать рост микробов-ассоциантов. На питательной среде должно вырастать не более 10 колоний тест-штаммов E. coli 18, B. cereus 8 и допускается рост только изолированных колоний P. vulgaris НХ 19 N 222 без тенденции к роению.

Для бактериологического контроля питательных сред, предназначенных для диагностики бруцеллеза, используют тест-штаммы Brucella abortus 19 ВА, Brucella melitensis 16 М и Brucella suis 1330. Тест-штаммы B. abortus 19 ВА получают в лиофилизированном состоянии из ГИСК им. Л.А. Тарасевича, B. melitensis 16 М и B. suis 1330 - из НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи или Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб".

Тест-штаммы Brucella хранят в лиофилизированном состоянии при температуре (5 +/- 1) °С до сохранения свойств согласно п. 6.4.3. Рабочую субкультуру бруцелл хранят в пробирке на скошенном агаре Альбими <*> или эритрит-агаре при температуре (5 +/- 1) °С. Пересевы культур проводят не менее 1 раза в 3 мес., но не более четырех раз. По истечении этого срока для работы вскрывают новую ампулу с культурой.

--------------------------------

<*> Агар Альбими: к 1 л дистиллированной воды добавляют 20 г сухого пептона, 20 мл дрожжевой воды, 5 г натрия хлорида. Все перемешивают и растворяют при нагревании до полного растворения. Устанавливают рН 7,2 - 7,4, для подщелачивания используют 20%-й NaOH, для подкисления - HCl в разведении 1:1. Затем добавляют 20 г корсаковского пластинчатого агара, предварительно промытого и отжатого, нагревают до расплавления агара. Фильтруют через ватно-марлевый фильтр, добавляют 1 г глюкозы, 0,1 г метабисульфита натрия и 13,25 мл глицерина на 1 л среды. Устанавливают, как описано выше, рН 7,2 - 7,3. Разливают в стерильные флаконы и стерилизуют при 110 °С 20 мин.

Тест-штаммы должны обладать типичными для S-формы бруцелл культуральными, морфологическими и биохимическими свойствами. В мазках - грамотрицательные палочки или коккобациллы. На агаре тест-штаммы бруцелл образуют выпуклые, гладкие, бесцветные, мутноватые, круглые колонии диаметром 1,0 - 1,5 мм; в бульоне - рост гомогенный без просветления. Тест-штаммы не должны обнаруживать признаков диссоциации в пробе с трипафлавином, реакции термопреципитации и при окраске колоний кристаллическим фиолетовым по методу White-Wilson; должны агглютинироваться сывороткой диагностической бруцеллезной до ее титра с образованием крупно-хлопчатого агглютината. Биохимические свойства: тест-штаммы бруцелл должны ферментировать глюкозу; B. abortus 19 ВА и B. suis 1330 должны разлагать арабинозу, галактозу, рибозу; B. melitensis 16 М не должен ферментировать указанные углеводы; B. melitensis 16 М должен расти на питательных средах с анилиновыми красками фуксин и тионин; B. abortus 19 ВА - только на среде с фуксином, а B. suis - на среде с тионином.

Для проверки агглютинабельности культуры в растворе трипафлавина на предметное стекло наносят каплю трипафлавина 1:500, приготовленного в 0,9%-м растворе натрия хлорида, в котором эмульгируется капля испытуемой культуры. У диссоциированных культур быстро (1 - 2 мин.) наступает агглютинация с образованием хорошо выраженных хлопьев. Взвесь из S-форм культур остается гомогенной.

Лиофилизированную культуру тест-штаммов пересевают в 2 пробирки с бульоном Альбими <**> и чашку Петри с печеночным агаром, агаром Альбими или на эритрит-агар. Посевы инкубируют при температуре (37 +/- 1) °С в течение (48 +/- 2) ч. Выросшую культуру каждого тест-штамма проверяют на чистоту роста, отсутствие диссоциации, затем пересевают в пробирку со скошенным агаром Альбими, печеночным или эритрит-агаром. После инкубации посевов B. abortus 19 ВА, B. melitensis 16 М и B. suis 1330 при температуре (37 +/- 1) °С в течение (48 +/- 2) ч культуры используют для контроля питательных сред. Пересевы культур со среды хранения проводят через каждые 3 мес., но не более четырех раз.

--------------------------------

<**> Бульон Альбими: готовят так же, как агар Альбими (см. выше), только без добавления корсаковского агара.

Учет результатов. Через (72 +/- 2) ч инкубации при температуре (37 +/- 1) °С должен наблюдаться рост бруцелл трех тест-штаммов на всех агаровых пластинках при высеве на них 10 м.к. и не менее 60% из числа засеянных 100 м.к.

Через 22 - 26 ч инкубации при температуре (37 +/- 1) °С по 0,1 мл микробной взвеси из каждой пробирки высевают на 3 чашки Петри с эритрит-агаром.

Засеянные чашки с эритрит-агаром без подращивания и с подращиванием инкубируют при температуре (37 +/- 1) °С в течение 70 - 74 ч.

Учет результатов. Показатель эффективности среды определяют отношением среднего числа колоний, выросших на чашках с эритрит-агаром после обогащения в эритрит-бульоне, к среднему числу колоний, выросших на эритрит-агаре до обогащения; он должен быть не менее 3.

Стабильность основных свойств бруцелл определяют отношением числа атипичных по свойствам колоний тест-штаммов, изложенным в п. 6.4.3, к общему числу колоний на чашках с испытуемыми средами. Питательная среда не должна изменять свойства тест-штаммов.

Определение показателя эффективности осуществляют по методике, изложенной в п. 6.1.6. Контроль проводят с использованием тест-штаммов B. abortus 19 ВА, B. melitensis 16 М и B. suis 1330. Подготовку тест-штаммов проводят согласно п. 6.4.4.

Для контроля питательных сред, предназначенных для выявления и культивирования сибиреязвенного микроба используют штаммы B. anthracis СТИ-1 и B. anthracis 228/8. В качестве тест-штаммов при определении ингибиторов посторонней микрофлоры используют штаммы P. vulgaris НХ 19 N 222 и E. coli 18. Для определения дифференцирующих свойств питательных сред используют тест-штамм B. cereus 8. Тест-штаммы получают из ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

Тест-штаммы B. anthracis и B. cereus хранят в лиофилизированном состоянии при температуре (5 +/- 1) °С до сохранения свойств согласно п. 6.5.3 или на агаре Хоттингера рН 7,1 +/- 0,1. Пересевы культур со среды хранения проводят через каждые 3 мес., но не более четырех раз. Тест-штаммы E. coli 18 и P. vulgaris НХ 19 N 222 хранят согласно п. 6.1.2.

Тест-штаммы B. anthracis должны обладать типичными культурально-морфологическими и биохимическими свойствами. По морфологии - это крупные толстые с закругленными концами грамположительные палочки, на агаре - крупные диаметром 2 - 3 мм, шероховатые серовато-белые колонии с ворсистыми краями ("львиная грива"); в бульоне - рост в виде ватных хлопьев, взвешенных комков, без помутнения. Тест-штаммы сибиреязвенного микроба должны ферментировать с образованием кислоты (без газа) глюкозу и мальтозу; не должны разлагать арабинозу, рамнозу, маннозу, лактозу, маннит; не должны обладать гемолитической, фосфатазной, лецитиназной активностями.

Тест-штамм B. cereus 8 должен обладать типичными культурально-морфологическими и биохимическими свойствами. В бульоне Хоттингера рН 7,2 +/- 0,1 через 24 ч роста при температуре (37 +/- 1) °С - помутнение среды с трудноразбиваемым крошковатым осадком, прочной пленкой и пристеночным кольцом; на агаровых средах B. cereus растет в виде твердых, круглых, белых (иногда окрашенных в желтый цвет) колоний с извитыми нитями по краям. В мазках - грамположительные палочки. Тест-штамм должен расщеплять глюкозу, маннозу и сахарозу до кислоты и не расщеплять маннит, лактозу и арабинозу.

Тест-штаммы E. coli 18 и P. vulgaris НХ 19 N 222 должны соответствовать свойствам, изложенным в п. 6.1.3.

В ампулы с лиофилизированными культурами E. coli 18 и P. vulgaris НХ 19 N 222 вносят по 1 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида и по 0,2 мл из каждой ампулы вносят стерильной пипеткой в пробирки с бульоном Хоттингера рН 7,2 +/- 0,1. Через (21 +/- 3) ч инкубации при температуре (37 +/- 1) °С бактериологической петлей делают пересевы из бульона на скошенный агар Хоттингера, посевы инкубируют при температуре (37 +/- 1) °С в течение (21 +/- 3) ч.

Стабильность основных свойств сибиреязвенного микроба определяют по отношению числа атипичных по морфологии колоний тест-штаммов к общему числу колоний на чашках с испытуемыми средами. Количество атипичных (RS, S и SM) колоний не должно превышать 10%.

Определение показателя эффективности осуществляют по методике, изложенной в п. 6.1.6. Контроль проводят с использованием тест-штаммов B. anthracis СТИ-1 и B. anthracis 228/8. Подготовку тест-штаммов проводят согласно п. 6.5.4.

При выделении возбудителя сибирской язвы из биологического материала и объектов внешней среды для подавления сопутствующей микрофлоры применяют питательные среды, содержащие ингибиторы роста.

Плотные питательные среды считаются пригодными, если они обеспечивают рост 50% тест-штаммов сибиреязвенного микроба при посевной дозе 100 спор и хотя бы по одной колонии на каждой чашке при посеве 10 спор B. anthracis СТИ-1 и 228/8.

Жидкие среды считают пригодными, если наблюдается рост сибиреязвенного микроба во всех пробирках при посеве 100 спор на 10 мл среды. По скорости роста среда считается пригодной, если через (21 +/- 3) ч в бульоне отмечается интенсивный рост культуры, соответствующий п. 6.5.3.

Для бактериологического контроля питательных сред, предназначенных для диагностики легионеллеза, используют тест-штаммы Legionella pneumophila Philadelphia 1 АТСС 33152 и Legionella pneumophila Bloomington-2 АТСС 33155. Указанные тест-штаммы получают из ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

В качестве тест-штаммов при определении пригодности ингибиторов посторонней микрофлоры используют штаммы P. vulgaris НХ 19 N 222, E. coli 18, B. cereus 8 и Candida albicans, которые получают из ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

Тест-штаммы L. pneumophila Philadelphia и L. pneumophila Bloomington хранят в лиофилизированном состоянии при температуре 2 - 8 °С до сохранения свойств согласно п. 6.6.3 или на жидкой среде хранения (1 г серно-кислотного гидролизата рыбной муки марки ФК (ГРМ ФК), 5 мл глицерина по ГОСТ 6259-75 и 95 мл дистиллированной воды) в пробирках при температуре 2 - 8 °С. Пересевы культур проводят не менее 1 раза в 3 мес., но не более четырех раз. По истечении этого срока для работы вскрывают новую ампулу с культурой.

Штаммы P. vulgaris НХ 19 N 222, B. cereus 8 и E. coli 18 хранят согласно п. 6.1.2; C. albicans - при температуре 2 - 8 °С до сохранения свойств.

Тест-штаммы E. coli 18, P. vulgaris НХ 19 N 222 и B. cereus 8 должны соответствовать требованиям, изложенным в п. 6.1.3.

В ампулы с лиофилизированной культурой тест-штаммов легионелл вносят 1 мл стерильного 0,01 М калий-фосфатного буфера, рН 7,1 +/- 0,1 (0,9 г калия фосфорно-кислого однозамещенного, 2,2 г калия фосфорно-кислого двузамещенного 3-водного, 1 л дистиллированной воды), высевают по 0,1 мл на чашки Петри с питательной средой для культивирования и выявления возбудителя легионеллеза - буферным угольно-дрожжевым агаром с альфа-кетоглютаровой кислотой (среда BCYEальфа), элективной средой (СЭЛ) или легионелбакагаром и инкубируют при температуре (36 +/- 1) °С в течение (48 +/- 2) ч, или культуры тест-штаммов со среды хранения пересевают на чашки Петри с этими средами и инкубируют при температуре (36 +/- 1) °С в течение (48 +/- 2) ч. Выросшую культуру пересевают бактериологической петлей на питательные среды для легионелл и инкубируют при температуре (36 +/- 1) °С в течение (24 +/- 2) ч.