"МУК 4.1.2454-09. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств фолпета в виноградном соке методом газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 02.02.2009)

1. Разработаны Российским государственным аграрным университетом - МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научным консультационным центром "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов" Минсельхоза России.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 25 декабря 2008 г. N 3).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 2 февраля 2009 г.

4. Введены в действие с 29 апреля 2009 г.

5. Введены впервые.

Настоящие Методические указания устанавливают метод газожидкостной хроматографии для определения уровня остаточных количеств фолпета в виноградном соке в диапазоне 0,02 - 0,1 мг/кг.

Краткая характеристика препарата

Название действующего вещества по ИСО: Фолпет.

Название действующего вещества по ИЮПАК: N-трихлорметил-тиофталимид.

Структурная формула (не приводится).

Отличается высокой реакционной способностью, быстро разрушается в биологических средах и почве.

Краткая токсикологическая характеристика

В России для фолпета установлены следующие гигиенические нормативы: ДСД - 0,01 мг/кг массы тела человека; МДУ в продукции (мг/кг): содержание вещества в картофеле, винограде, плодовых ягодных, томатах не допускается (на уровне чувствительности метода контроля).

Область применения

Фолпет - контактный фунгицид с неспецифическим местом действия и коротким защитным действием. Высокоэффективен в борьбе с болезнями растений, вызываемыми ложномучнисторосяными и мучнисторосяными грибами, в плодовых садах, на виноградниках, в посевах овощных культур и плантациях картофеля.

Применяется в России на виноградниках против милдью и плантациях картофеля против фитофтороза и макроспориоза с нормой расхода 1,25 - 1,5 кг д.в./га.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

Метод основан на определении фолпета методом газожидкостной хроматографии с использованием детектора постоянной скорости рекомбинации электронов после экстракции данных веществ из исследуемой пробы ацетонитрилом и очистки экстракта путем перераспределения в несмешивающихся жидкостях и с помощью колоночной хроматографии на флоризиле.

Идентификацию веществ проводят по времени удерживания путем сравнения с аналитическим стандартом, а количественное определение - методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Избирательность обеспечивается путем подбора колонки и изменения температуры колонки.

Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Все растворители используют свежеперегнанными. Перегонку растворителей проводят, строго отбирая фракцию, соответствующую по температуре кипения основному веществу.

Основной раствор фолпета готовят, количественно перенося навеску вещества массой по 100 мг в мерные колбы вместимостью 100 куб. см. В колбы вносят 20 куб. см ацетона, содержимое колб перемешивают до полного растворения кристаллов фолпета. Объем раствора в колбах доводят до метки ацетоном, после чего содержимое колб тщательно перемешивают. Получают раствор фолпета массовой концентрации 1 мг/куб. см (раствор N 1), который может храниться не более 1 месяца.

Методом последовательного разбавления раствора N 1 ацетоном в мерных колбах готовят рабочие растворы с концентрациями фолпета 0,01; 0,02; 0,05 и 0,1 мкг/куб. см, которые могут храниться в холодильнике не более 10 суток.

Основной и градуировочные растворы фолпета хранят в холодильнике.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации фолпета в растворе, устанавливают методом абсолютной калибровки по стандартным растворам с концентрациями 0,01; 0,02; 0,05 и 0,1 мкг/куб. см.

Для построения градуировочного графика в инжектор хроматографа вводят по 1 куб. мм каждого градуировочного раствора фолпета и хроматографируют в условиях п. 9.2. Проводят не менее 3 параллельных измерений и находят среднее значение площади хроматографического пика для каждой концентрации. По полученным данным строят градуировочный график зависимости площади хроматографического пика в мВ от концентрации фолпета в растворе в мкг/куб. см.

В пластмассовую колонку длиной 15 см, диаметром 1,5 см помещают на дно чистую стекловату и заполняют колонку 5 г флоризила 60/100 меш, уплотняя его путем вибрации колонки. На слой флоризила наносят слой безводного сернокислого натрия толщиной 1 см. Флоризил в колонке промывают 15 мл ацетона, ацетон под давлением удаляют из колонки. Затем колонку промывают 15 мл гексана.

Хроматографическое поведение фолпета проверяют каждый раз при использовании новой партии флоризила. В стаканчик помещают 1 мл стандартного раствора фолпета с концентрацией 0,1 мкг/мл, добавляют 9 мл гексана, перемешивают содержимое и наносят на колонку. Промывают колонку последовательно 10 мл гексана и 5 мл смеси гексан:ацетон - 4:1, смывы отбрасывают.

Пропускают через колонку 4 порции смеси гексан - ацетон (1:1) по 5 мл каждая, собирая их в отдельные концентраторы. Собранные фракции выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 1 мл ацетона и вводят в хроматограф 1 мкл пробы. Фракции, содержащие фолпет, объединяют, выпаривают досуха, сухой остаток вновь растворяют в 1 мл ацетона и вводят в хроматограф 1 мкл пробы. Рассчитывают содержание вещества в элюате, определяют полноту смыва с колонки и необходимый для очистки объем элюата.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" N 2051-79 от 21.08.79, а также с ГОСТ 25892-83 "Виноградный сок, ТУ".

Пробы соков хранят в стеклянной герметично закрытой таре в холодильнике при температуре +4 °С не более 10 суток.

9.1.1. Экстракция фолпета из анализируемой пробы и предварительная очистка. Навеску сока 10 г разводят 10 мл насыщенного раствора хлористого натрия и переносят в делительную воронку. Добавляют в воронку 50 мл ацетонитрила и встряхивают содержимое воронки в течение 1 - 2 мин. После разделения слоев нижний водный слой переливают в стаканчик, а слой ацетонитрила - в концентратор емкостью 250 мл. Водную фракцию из стаканчика переносят в делительную воронку, добавляют в воронку 30 мл ацетонитрила и экстрагируют фолпет, как указано выше. Экстракцию повторяют еще раз с тем же объемом ацетонитрила.

Добавляют в воронку 30 мл хлористого метилена и встряхивают воронку в течение 1 - 2 мин. После разделения слоев нижний слой хлористого метилена сливают в концентратор, пропуская через безводный сернокислый натрий. Повторяют экстракцию еще два раза, используя каждый раз по 30 мл хлористого метилена. Хлористый метилен выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе.

9.1.2. Очистка экстракта на колонке с флоризилом. Сухой остаток в концентраторе разводят в 1 мл ацетона, добавляют 9 мл гексана, обмывают смесью стенки концентратора и переносят его содержимое на колонку с флоризилом. Колонку промывают последовательно 10 мл гексана и 5 мл смеси гексан - ацетон - 4:1, смывы отбрасывают. Фолпет элюируют с колонки 15 мл смеси гексан - ацетон. Элюат собирают в концентратор емкостью 100 мл и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 35 °С. Сухой остаток в концентраторе разводят в 1 мл ацетона и вводят в хроматограф 1 мкл пробы.

Капиллярная кварцевая колонка НР-5 (5% дифенил и 95% диметилполисилоксан), длина 15 м, внутренний диаметр 0,32 мм, толщина пленки 0,25 мкм.

Температура термостата колонки программированная: начальная температура - 160 °С, нагрев колонки по 10 °С в минуту до 210 °С. Нагрев колонки после анализа по 25 °С в минуту до 260 °С, выдержка 3 мин. Время анализа - 11 мин.

Температура испарителя - 230 °С, детектора - 320 °С.

Регулятор расхода гелия - РРГ-11; режим Split less.

Газ 1 - гелий (газ-носитель), расход гелия - 1 куб. см/мин., сброс 1:50, начало сброса - 20 с, длительность сброса - 2 мин.

Газ 2 - гелий, линейная скорость - 28 см/с, давление на входе - 38,21 кПа;

Газ 3 - азот (поддув в детектор), расход во время анализа - 45 куб. см/мин. Расход азота при продувке детектора после анализа - 65 куб. см/мин.

Абсолютное время удерживания фолпета - 6 мин. 37 с - 6 мин. 40 с.

Объем вводимой пробы - 1 куб. мм.

Минимально детектируемое количество фолпета в анализируемом объеме - 0,01 нг.

Линейность детектирования сохраняется в пределах 0,01 - 0,1 нг.

Каждую анализируемую пробу вводят в хроматограф 3 раза и вычисляют среднюю площадь пика.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией фолпета 0,1 мкг/куб. см соответственно, разбавляют.

Для определения содержания фолпета в пробах методом ГЖХ используют следующую формулу:

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

где дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее 0,02 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> 0,02 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева.