"МУК 4.1.2592-10. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств пропиконазола в ягодах винограда и виноградном соке, зеленой массе, семенах и масле рапса методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 26.03.2010)

1. Разработаны Всероссийским НИИ защиты растений.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 03.12.2009 N 3).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 26 марта 2010 г.

4. Введены в действие с 26 марта 2010 г.

5. Введены впервые.

Действующее вещество: пропиконазол (смесь диастереомеров).

Название действующего вещества по номенклатуре ИЮПАК: (+/-)-1-[2-(2,4-дихлорофенил)-4-пропил-1,3-диоксалан-2-улметил]-1H-1,2,4-триазол.

Структурная формула (не приводится).

Системный фунгицид широкого спектра действия.

2.1.1. Область применения и принцип метода

Настоящий документ устанавливает методику определения остаточных количеств пропиконазола в ягодах винограда и виноградном соке в диапазоне концентраций 0,01 - 0,1 мг/кг, зеленой массе, семенах и масле рапса в диапазоне концентраций 0,025 - 0,250 мг/кг.

Методика основана на определении пропиконазола методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его извлечения из образцов водно-ацетонитрильной смесью или ацетонитрилом с последующей очисткой жидкостной экстракцией и на концентрирующих патронах.

2.1.2. Метрологические характеристики

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

2.1.3. Избирательность метода

Избирательность метода определения пропиконазола достигается условиями подготовки проб и хроматографического анализа.

Отбор проб винограда производится в соответствии с ГОСТ 25896-83 "Виноград свежий столовый. Технические условия". Пробы ягод винограда хранят до анализа в морозильной камере при температуре не выше -18 °C в течение 6 месяцев. Пробы виноградного сока хранят в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в течение недели.

Отбор проб семян и масла рапса производится в соответствии с ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб". Отобранные пробы семян рапса хранят в холодильнике при 4 °C не более 10-ти дней. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят в морозильной камере при -18 °C. Перед анализом образцы семян измельчают.

2.5.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей

2.5.2. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа аналитические колонки кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 - 0,2 куб. см/мин.) до стабилизации нулевой линии в течение 1 ч.

2.5.3. Приготовление растворов

Для приготовления 0,005 М раствора ортофосфорной кислоты 0,5 г 98% ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 куб. дм, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

Приготовление стандартного и градуировочных растворов

Точную навеску пропиконазола (50 мг) помещают в мерную колбу объемом 100 куб. см, растворяют в ацетонитриле и доводят до метки. (Стандартный раствор с концентрацией 0,5 мг/куб. см.) Градуировочные растворы с концентрациями 0,1, 0,2, 0,5, 0,75 и 1,0 мкг/куб. см готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы.

Стандартный раствор можно хранить в холодильнике в силанизированном или тефлоновом флаконе при температуре 0 - 4 °C в течение 1 месяца, градуировочные растворы используют в течение рабочего дня.

При изучении полноты извлечения пропиконазола используют ацетонитрильные растворы вещества.

2.5.4. Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация пропиконазола в растворе) в хроматограф вводят по 10 куб. мм градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации пропиконазола в градуировочном растворе.

2.5.5. Подготовка приборов и средств измерения

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями технической документации.

2.5.6. Подготовка концентрирующих патронов для очистки экстракта

2.5.6.1. Кондиционирование патронов, заполненных гексадецилсиликагелем - Диапак C16 (0,4 г), предназначенных для очистки экстрактов ягод и сока винограда, а также зеленой массы и семян рапса, осуществляют, пропуская через них последовательно по 1 куб. см метанола и воды. Патроны для очистки проб масла рапса кондиционируют пропусканием 2 куб. см ацетонитрила. Элюаты отбрасывают.

2.5.6.2. Кондиционирование патронов для повторной очистки экстрактов ягод и сока винограда, зеленой массы, семян и масла рапса, заполненных силикагелем 60 (0,5 г), осуществляют пропусканием 2,5 куб. см гексана.

2.6.1. Определение пропиконазола в ягодах и соке винограда

Гомогенизированную пробу ягод винограда массой 50 г помещают в коническую колбу вместимостью 250 куб. см, прибавляют 10 куб. см воды и 40 куб. см ацетона. Пропиконазол экстрагируют на ультразвуковой бане в течение 10 мин. Суспензию фильтруют в вакууме через воронку Бюхнера с фильтром "красная лента", промывая массу на фильтре 10 куб. см ацетона. Экстракцию повторяют и объединенный экстракт упаривают на ротационном испарителе при температуре бани не выше 40 °C до полного удаления ацетона. Водный остаток (50 - 60 куб. см) фильтруют через бумажный фильтр "красная лента" и пропускают через концентрирующий патрон Диапак C16, откондиционированный по п. 2.5.6.1. Фильтрат отбрасывают. Пропиконазол элюируют 5 куб. см ацетона в чистую круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см. Элюат упаривают досуха на ротационном испарителе (40 °C).

Пробу виноградного сока объемом 50 куб. см фильтруют через воронку Бюхнера с фильтром "красная лента", фильтрат пропускают через концентрирующий патрон Диапак C16, откондиционированный по п. 2.5.6.1. Патрон промывают 5 куб. см воды. Фильтрат и промывку отбрасывают. Пропиконазол элюируют 5 куб. см ацетона в круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см. Элюат упаривают досуха на ротационном испарителе (40 °C).

Сухой остаток проб ягод или сока винограда растворяют в 2,5 куб. см гексана и полученный раствор количественно вносят в подготовленный концентрирующий патрон, заполненный силикагелем 60. Патрон промывают 5 куб. см гексана. Фильтрат и промывку отбрасывают. Пропиконазол элюируют 5 куб. см смеси гексан-ацетон (80:20). Элюат упаривают досуха на ротационном испарителе (40 °C), сухой остаток растворяют в 5 куб. см подвижной фазы и 10 куб. мм образца вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.2. Определение пропиконазола в зеленой массе, семенах и масле рапса

Навеску размолотых на лабораторной мельнице семян или измельченной зеленой массы (20 г) помещают в коническую колбу вместимостью 250 куб. см, прибавляют 75 куб. см ацетонитрила, содержащего 20% воды (по объему). Пропиконазол экстрагируют на ультразвуковой бане в течение 15 мин. Суспензию фильтруют в вакууме через воронку Бюхнера с фильтром "красная лента". Экстракцию повторяют. Объединенный экстракт упаривают на ротационном испарителе (40 °C) до полного удаления ацетонитрила.

Водный остаток экстракта семян рапса фильтруют через бумажный фильтр "красная лента" и пропускают через концентрирующий патрон Диапак C16, откондиционированный по п. 2.5.6.1. Фильтрат отбрасывают. Пропиконазол элюируют 5 куб. см ацетона в круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см. Элюат упаривают досуха на ротационном испарителе (40 °C). Дальнейшую очистку проб проводят по п. 2.6.3.

Водный остаток экстракта зеленой массы доводят до 100 куб. см водой, фильтруют через бумажный фильтр "красная лента" и экстрагируют 25 куб. см гексана. Экстракцию повторяют дважды. Объединенный гексановый экстракт промывают два раза водой по 20 куб. см. Промывки отбрасывают, а гексановый раствор сушат безводным сульфатом натрия и упаривают досуха на ротационном испарителе (40 °C). Дальнейшую очистку проб проводят по п. 2.6.3.

К 10 г масла рапса прибавляют 50 куб. см гексана и экстрагируют в делительной воронке вместимостью 100 куб. см ацетонитрилом трижды по 10 куб. см. Объединенный экстракт упаривают на ротационном испарителе до объема 1 куб. см и пропускают через два соединенных последовательно концентрирующих патрона Диапак C16 (0,4 г), подготовленных соответственно по п. 2.5.6.1. Промывают 2 куб. см ацетонитрила. Фильтрат и промывку отбрасывают. Пропиконазол элюируют 3 куб. см ацетонитрила. Элюат упаривают досуха на ротационном испарителе (40 °C). Дальнейшую очистку проб проводят по пункту 2.6.3.

2.6.3. Очистка на концентрирующем патроне, заполненном силикагелем 60 (0,5 г)

Сухой остаток, полученный по п. 2.6.2, растворяют в 2,5 куб. см гексана и количественно вносят в подготовленный по п. 2.5.6.2 концентрирующий патрон, заполненный силикагелем 60. Патрон промывают 5 куб. см гексана и для проб масла дополнительно 5 куб. см хлористого метилена. Фильтрат и промывки отбрасывают. Пропиконазол элюируют 5 куб. см смеси гексан-ацетон (80:20). Полученный раствор упаривают на ротационном испарителе (40 °C), сухие остатки семян и зеленой массы растворяют в 2 куб. см, а масла - в 1 куб. см подвижной фазы и 10 куб. мм образца вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.4. Условия хроматографирования

Ультраэффективный жидкостный хроматограф "ACQUITY" фирмы Waters с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Для анализа проб ягод и сока винограда, зеленой массы и семян рапса используют колонку 1.

Температура колонки (30 +/- 1) °C.

Подвижная фаза: ацетонитрил - 0,005 М ортофосфорная кислота в соотношении 55:45.

Скорость потока элюента: 0,2 куб. см/мин.

Рабочая длина волны 220 нм.

Объем вводимой пробы 10 куб. мм.

Время удерживания пропиконазола (5,15 +/- 0,05) мин. (изомер 1) и (5,30 +/- 0,05) мин. (изомер 2).

Пробы, полученные из масла рапса, анализируют на колонке 2.

Температура колонки (30 +/- 1) °C.

Подвижная фаза: ацетонитрил - 0,005 М ортофосфорная кислота в соотношении 45:55.

Скорость потока элюента: 0,8 куб. см/мин.

Рабочая длина волны 220 нм.

Объем вводимой пробы 10 куб. мм.

Время удерживания совокупного пика пропиконазола (5,1 +/- 0,1) мин.

Содержание пропиконазола в образцах ягод винограда и виноградном соке, зеленой массе, семенах и масле рапса (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор пропиконазола 1 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

где:

X - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

ДЕЛЬТА - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения" (например: менее 0,01 мг/кг*, где * - 0,01 мг/кг - предел обнаружения).

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

6.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

6.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

где ДЕЛЬТА - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

6.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

При проведении работы необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1005-88).

При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.

Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации жидкостного хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 6.