"МУК 4.1.2331-08. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств клотианидина в воде, почве, ботве и клубнях картофеля методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 15.02.2008)

1. Разработаны Всероссийским НИИ защиты растений.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по защите прав потребителей и благополучия человека (протокол от 6 декабря 2007 г. N 3).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 15 февраля 2008 г.

4. Введены в действие с 10 апреля 2008 г.

5. Введены впервые в качестве дополнения.

Действующее вещество: клотианидин.

Структурная формула (не приводится).

(Е)-1-(2-хлор-1,3-тиазол-5-илметил)-3-метил-2-нитрогуанидин (IUPAC).

Мол. масса: 249,7.

Область применения: инсектицид из группы неоникотиноидов для борьбы с сосущими и грызущими насекомыми на рисе, кукурузе, рапсе, овощных и фруктовых культурах. Используется для протравливания семян, обработки почвы и вегетирующей культуры.

Гигиенические нормативы для клотианидина в России не установлены.

2.1.1. Область применения и принцип метода

Настоящий документ устанавливает методику определения остаточных количеств клотианидина в воде водоемов в диапазоне концентраций 0,001 - 0,01 мг/кг, в почве - 0,05 - 0,5 мг/кг, в клубнях картофеля - 0,01 - 0,1 мг/кг и в ботве картофеля - 0,02 - 0,2 мг/кг.

Методика основана на определении клотианидина методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его извлечения из образцов ацетоном (ботва и клубни картофеля) или водно-ацетоновой смесью (почва) с последующей очисткой методом твердофазной экстракции.

2.1.2. Метрологические характеристики

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.

2.1.3. Избирательность метода

Избирательность метода определения клотианидина достигается условиями подготовки проб и хроматографического анализа.

Ацетон, осч, ТУ 6-09-3513-86.

Ацетонитрил для ВЭЖХ, "Криохром", сорт 1 или х.ч., ТУ 6-09-3534-87.

Бумажные фильтры "красная лента", ТУ 6.091678-86.

Вода бидистиллированная или деионизированная, ГОСТ 6709-79.

Клотианидин, аналитический стандарт с содержанием д.в. 99,9%.

Кислота трифторуксусная, ч, ТУ 6-09-3877-80, свежеперегнанная; 0,05%-ный водный раствор.

Метанол, хч, ГОСТ 6995-77.

Этилацетат, хч, ГОСТ 22300-76 с изм. N 1, 2, 3.

Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрила и 0,05 М % трифторуксусной кислоты (30:70 или 20:80, по объему).

Патроны для твердофазной экстракции Диапак С16 ("БиоХимМак СТ").

Концентрирующие патроны, заполненные силикагелем 60 (0,040 - 0,063 mm), Merck.

Жидкостный хроматограф "ACQUITY" фирмы "Waters" с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки или "Breeze" фирмы "Waters", или аналогичный.

Аналитические колонки ACQUITY UPLC BEH С18 (100 x 2,1) мм, 1,7 мкм (Waters) и

ACQUITY UPLC BEH Phenyl (100 х 2,1) мм, 1,7 мкм (Waters) или Spherisorb ODS2 (2,1 х 150) мм, 3 мкм (Waters).

Баня ультразвуковая "Серьга", ТУ 3.836.008, или аналогичная.

Весы аналитические ВЛА-200, ГОСТ 24104-2001, или аналогичные.

Воронка Бюхнера, ГОСТ 9147.

Ротационный испаритель вакуумный ИР-1М, ТУ 25-11-917-74, Buchi R-205, или аналогичный.

Насос водоструйный, ГОСТ 10696-75.

Испаритель одноканальный "ПЭ-2300" для концентрирования экстрактов в токе азота.

Центрифуга ОПн-8УХЛ4.2, ТУ 5.375-4261-76.

Бидистиллятор.

Аллонж прямой с отводом для вакуума (для работы с концентрирующими патронами).

Шприц медицинский с разъемом Льюера, ГОСТ 22090.

РН-метр универсальный ЭВ-74, ГОСТ 22261-76.

Колбы плоскодонные на шлифах КШ500 29/32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Колбы круглодонные на шлифах КШ50 29/32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Воронки лабораторные В-75-110, ГОСТ 25336-82.

Цилиндры мерные на 100, 250 и 1000 куб. см, ГОСТ 1774-74.

Колбы мерные на 25, 50, 100 и 1000 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Пипетки на 1, 2, 5, 10 куб. см, ГОСТ 22292-74.

Микродозаторы Ленпипет переменного объема от 200 до 1000 куб. мм и от 1 до 5 куб. см.

Сито с диаметром ячеек 1 мм.

Отбор проб производится в соответствии с ГОСТ 26832-86 "Картофель свежий для переработки на продукты питания"; ГОСТ 28168-89 "Почвы. Отбор проб"; ГОСТ Р 51592-2000 "Вода. Общие требования к отбору проб". Для длительного хранения пробы почвы подсушиваются при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в течение года. Перед анализом сухую почву доводят до стандартной влажности и просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм. Пробы клубней и ботвы картофеля для определения остаточных количеств пестицидов хранят в морозильной камере при температуре -18 °С.

2.5.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Перед началом работы рекомендуется проверить чистоту применяемых органических растворителей. Для этого 100 мл растворителя упаривают в ротационном вакуумном испарителе при температуре 40 °С до объема 1,0 куб. см и хроматографируют. При обнаружении мешающих определению примесей очистку растворителей производят в соответствии с общепринятыми методиками.

2.5.2. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа аналитические колонки кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 - 0,2 куб. см/мин.) до стабилизации нулевой линии в течение 1 - 2 часов.

2.5.3. Приготовление растворов

Для приготовления 0,05% раствора трифторуксусной кислоты 0,5 куб. см свежеперегнанной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 куб. дм, доводят объем до метки бидистиллированной или деионизованной водой и перемешивают.

Приготовление стандартного и градуировочных растворов:

Берут точную навеску клотианидина (50 мг), переносят в мерную колбу на 100 куб. см, растворяют навеску в ацетонитриле и доводят до метки. (Стандартный раствор с концентрацией 0,5 мг/куб. см.) Градуировочные растворы с концентрациями 0,1; 0,2; 0,5; 0,75 и 1,0 мкг/куб. см готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы - смесь ацетонитрила и 0,05% трифторуксусной кислоты (20:80, по объему). При изучении полноты извлечения клотианидина используют ацетонитрильные растворы вещества.

Стандартный раствор можно хранить в холодильнике в силанизированном или тефлоновом флаконе при температуре 0 - 4 °С в течение 1 месяца, градуировочные растворы используют в течение рабочего дня.

2.5.4. Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация клотианидина в растворе) в хроматограф вводят по 10 куб. мм градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации клотианидина в градуировочном растворе.

2.5.5. Подготовка приборов и средств измерения

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями технической документации.

2.5.6. Подготовка концентрирующих патронов для очистки экстракта

2.5.6.1. Кондиционирование патрона, заполненного гексадецилсиликагелем - Диапак С16, осуществляют, пропуская через патрон последовательно по 2 мл метанола и воды. Элюат отбрасывают.

2.5.6.2. Кондиционирование патрона для дополнительной очистки экстрактов клубней и ботвы, заполненного Силикагелем 60 (0,5 г), осуществляют пропусканием 2 мл этилацетата.

2.6.1. Определение клотианидина в пробах воды

Образец предварительно отфильтрованной воды объемом 25 куб. см пропускают через кондиционированный концентрирующий патрон, заполненный гексадецилсиликагелем. Фильтрат отбрасывают. Клотианидин элюируют 5 куб. см ацетона. Элюат выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С и сухой остаток растворяют в 0,25 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ. 10 куб. мм раствора вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.2. Определение клотианидина в пробах почвы

Образец почвы массой 10 г, предварительно просеянной через сито, помещают в коническую колбу емкостью 100 куб. см с притертой пробкой, прибавляют 10 куб. см воды и 40 куб. см ацетона. Колбу помещают в ультразвуковую баню и экстрагируют клотианидин в течение 15 мин. Суспензию фильтруют в вакууме через воронку Бюхнера (фильтр "красная лента"), осадок на фильтре промывают 5 куб. см ацетона. Экстракцию повторяют, используя в качестве экстрагента 50 куб. см смеси ацетон - вода (4:1). Фильтрат упаривают на ротационном испарителе (40 °С) до водного остатка. Водный остаток пропускают через подготовленный по п. 2.5.6 патрон с октадецилсиликагелем. Фильтрат отбрасывают. Колбу ополаскивают дважды порциями по 3 мл ацетонитрила и смывы также пропускают через тот же патрон. Фильтрат отбрасывают. Клотианидин элюируют 5 куб. см ацетона. Элюат собирают, выпаривают досуха на ротационном испарителе (40 °С) и сухой остаток растворяют в 5 куб. см подвижной фазы. 10 куб. мм вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.3. Определение клотианидина в пробах клубней и ботвы картофеля

Навеску измельченных клубней или нарезанной ботвы картофеля массой 20 г помещают в коническую колбу емкостью 100 куб. см. Прибавляют 50 куб. см ацетона и экстрагируют клотианидин на ультразвуковой бане в течение 15 мин. Суспензию фильтруют в вакууме через воронку Бюхнера с фильтром "красная лента". Экстракцию повторяют с 50 куб. см ацетона, выдерживая в ультразвуковой ванне в течение 15 мин., суспензию фильтруют. Объединенный экстракт упаривают на ротационном испарителе при температуре бани не выше 40 °С до полного удаления ацетона. Дальнейшую очистку проводят на патроне Диапак С16. Водный остаток пропускают через откондиционированный по п. 2.5.6 патрон, ополаскивают колбу 2 куб. см воды и тоже пропускают через патрон. Объединенный фильтрат отбрасывают. Клотианидин элюируют 5 куб. см ацетона в чистую круглодонную колбу объемом 10 куб. см и отдувают ацетон в токе азота. Сухой остаток растворяют в 1 куб. см этилацетата и выдерживают колбу в ультразвуковой бане в течение 5 мин. Экстракт для дополнительной очистки вносят в подготовленный концентрирующий патрон, заполненный силикагелем 60. Патрон промывают 2 куб. см этилацетата. Фильтрат и промывку отбрасывают. Клотианидин элюируют 1 куб. см ацетона. Ацетон удаляют из элюата током азота (с помощью испарителя одноканального). Сухой остаток при анализе клубней растворяют в 2 куб. см, а ботвы - в 4 куб. см подвижной фазы и 10 куб. мм вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.4. Условия хроматографирования

Ультраэффективный жидкостный хроматограф "ACQUITY" фирмы Waters с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Колонка 1 - ACQUITY UPLC BEH С18 (100 х 2,1) мм, 1,7 мкм (Waters) при анализе воды. Колонка 2 - ACQUITY UPLC BEH Phenyl (100 х 2,1) мм, 1,7 мкм (Waters) при анализе проб почвы, клубней и ботвы картофеля. Температура колонки 30 +/- 1 °С. Подвижная фаза: ацетонитрил - 0,05%-ная трифторуксусная кислота в соотношении 30:70 и скорости потока 0,1 куб. см/мин. (колонка 1) и 20:80 и скорости потока 0,15 куб. см/мин. (колонка 2). Рабочая длина волны 270 нм. Объем вводимой пробы 10 мкл. Время удерживания клотианидина 4,4 +/- 0,05 мин. (колонка 1) и 5,4 +/- 0,1 мин. (колонка 2).

Альтернативные условия хроматографирования: жидкостный хроматограф "Breeze" фирмы Waters с УФ-детектором и дегазатором. Рабочая длина волны 270 нм. Аналитическая колонка Spherisorb ODS2 (150 х 2,1) мм, 3 мкм (Waters) для анализа воды, почвы, клубней и ботвы картофеля. Подвижная фаза ацетонитрил - 0,05%-ная трифторуксусная кислота в соотношении 20:80. Скорость потока элюента 0,2 куб. см/мин. Дозируемый объем 20 куб. см.

Время удерживания клотианидина 8,2 +/- 0,1 мин.

Содержание клотианидина в образцах воды, почвы, клубней и ботвы картофеля (Х, мг/кг) вычисляют по формуле:

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор клотианидина 1, мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения" (например: менее 0,005 мг/кг <*>).

--------------------------------

<*> 0,005 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6.2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

6.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

6.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

6.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

При проведении работы необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005-88).

При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.

Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации жидкостного хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 6.