"МУК 4.1.3604-20. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методика измерения массовой доли натамицина в пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 29.07.2020)

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают порядок определения массовой доли натамицина в пищевой продукции методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (далее - ВЭЖХ-МС/МС) в диапазоне измерений от 0,001 до 1 мг/кг.

1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также могут быть использованы организациями, аккредитованными в установленном порядке на проведение исследований продовольственного сырья, пищевых продуктов.

1.3. Натамицин - полиеновый амфотерный макролидный антибиотик с противогрибковыми свойствами. Натамицин оказывает противогрибковое действие, связываясь со стеринами в клеточной мембране грибка, тем самым увеличивая проницаемость мембраны.

Общепринятое название: натамицин.

(1R,3S,5R,7R,8E,12R,14E,16E,18E,20E,22R,24S,25R,26S)-22-{[(2R,3S,4S,5S,6R)-4-амино-3,5-дигидрокси-6-метилоксан-2-ил]окси}-1,3,26-тригидрокси-12-метил-10-оксо-6,11,28-триоксатрицикло[22.3.1.0^5,7]октакоза-8,14,16,18,20-пентаен-25-карбоновая кислота.

Эмпирическая формула: C₃₃H₄₇NO₁₃, молекулярная масса: 665,7.

Цвет: белые кристаллы.

Чувствителен к ультрафиолету и быстро деградирует на свету.

Константа диссоциации в 50% водном 2-метоксиэтаноле (pKa1) - 4,6; (pKa2) - 8,35.

Точка плавления - темнеет при +/- 200 °C, разлагается при 280 - 300 °C.

Растворимость в воде: 4100 мг/дм³ (при 21 °C). Коэффициент распределения в системе октанол/вода (при 25 °C): Kow log P = 0,88.

1.4. МУК носят рекомендательный характер.

2.1. Метод основан на определении натамицина с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием масс-спектрометрического детектора типа тройной квадруполь после экстракции натамицина из образцов органическим растворителем, очистки экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей.

Количественное определение остаточного содержания натамицина проводят методом внутреннего стандарта по площадям хроматографических пиков с помощью градуировочной характеристики, полученной при анализе градуировочных растворов в аналогичных условиях.

3.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций (по ГОСТ Р ИСО 5725-(1 - 6)).

Полнота извлечения веществ, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

5.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007.

Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Организация обучения работников безопасности труда осуществляется по ГОСТ 12.0.004.

5.2. К выполнению измерений, обработке и оформлению результатов допускаются специалисты, освоившие данную методику и подтвердившие экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля точности измерений.

6.1. При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C, относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7.1. Выполнению измерений предшествуют приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики. На всех этапах пробоподготовки, а также приготовления растворов натамицина предохранять пробу и растворы от попадания прямых солнечных и ультрафиолетовых лучей.

7.2. Приготовление растворов для проведения анализа.

7.2.1. Приготовление подвижных фаз А и Б.

Для приготовления подвижной фазы А в мерную колбу вместимостью 1000 см³ приливают 995 см³ деионизованной воды, добавляют 5,0 см³ муравьиной кислоты, перемешивают. Раствор хранят при комнатной температуре. Срок годности - не более 1 мес.

Для приготовления раствора элюента мобильной фазы Б в мерную колбу вместимостью 1000 см³ вносят 1000 см³ метанола. Раствор хранят при комнатной температуре. Срок годности - не более 1 мес.

7.2.2. Приготовление рабочих растворов.

Приготовление 0,5%-го раствора муравьиной кислоты в метаноле. В мерную колбу объемом 1000 см³ помещают 500 см³ метанола, прибавляют 5 см³ муравьиной кислоты и доводят объем до метки метанолом. Срок хранения при комнатной температуре - не более 1 мес.

7.2.3. Приготовление градуировочных растворов.

7.2.3.1. Приготовление исходного стандарта натамицина C₀.

Для приготовления исходного раствора C₀ с концентрацией 1 мг/см³ рассчитывают необходимое количество препарата с известным содержанием натамицина, соответствующее 10 мг чистого натамицина.

В мерную колбу вместимостью 10 см³ вносят рассчитанную массу препарата натамицина для градуировки. Доводят до метки 0,5%-м раствором муравьиной кислоты в метаноле (п. 7.2.2), перемешивают и помещают в ультразвуковую баню на 10 мин.

Исходный раствор следует хранить без доступа солнечных и ультрафиолетовых лучей при температуре от -18 °C до -24 °C не более 1 мес.

Все рабочие растворы натамицина готовятся непосредственно перед применением.

7.2.3.2. Приготовление рабочего раствора C₁.

Для приготовления рабочего раствора C₁ переносят 1 см³ исходного раствора натамицина C₀ в мерную колбу вместимостью 100 см³, доводят до метки 0,5%-м раствором муравьиной кислоты в метаноле (п. 7.2.2) и перемешивают. Массовая концентрация натамицина в растворе C₁ составляет 10 мкг/см³.

7.2.3.3. Приготовление рабочего раствора C₂.

Для приготовления рабочего раствора C₂ переносят по 1,0 мл³ рабочего раствора натамицина C₁ в мерную колбу вместимостью 10 см³, доводят до метки 0,5%-м раствором муравьиной кислоты в метаноле (п. 7.2.2) и перемешивают. Массовая концентрация натамицина в растворе C₂ составляет 1 мкг/см³.

7.2.3.4. Приготовление рабочего раствора C₃.

Для приготовления рабочего раствора C₃ переносят по 1,0 мл³ рабочего раствора натамицина C₂ в мерную колбу объемом 10 см³, доводят объем до метки 0,5%-м раствором муравьиной кислоты в метаноле (п. 7.2.2) и перемешивают. Массовая концентрация натамицина в растворе C₃ составляет 0,1 мкг/см³.

7.2.3.5. Приготовление рабочего раствора C₄.

Для приготовления рабочего раствора C₄ переносят по 1,0 см³ рабочего раствора натамицина C₃ в мерную колбу объемом 10 см³, доводят объем до метки 0,5%-м раствором муравьиной кислоты в метаноле (п. 7.2.2) и перемешивают. Массовая концентрация натамицина в растворе C₄ составляет 0,01 мкг/см³.

7.2.3.6. Приготовление рабочего раствора внутреннего стандарта D_0.

Для приготовления рабочего раствора D₀ на аналитических весах взвешивают 2 мг чистого вещества стандартного образца метронидазола-d4 и переносят в мерную колбу вместимостью 10 см³. Добавляют 8 см³ метанола, перемешивают и помещают в ультразвуковую баню на одну минуту, доводят полученный раствор до метки 10 см³ метанолом. Массовая концентрация метронидазола-d4 в растворе составляет 200 мкг/см³. Срок хранения раствора при температуре от 0 °C до 8 °C - не более 3 мес.

7.2.3.7. Приготовление рабочего раствора D₁ внутреннего стандарта. Для приготовления рабочего раствора D₁ переносят 0,2 см³ раствора D₀ в мерную колбу вместимостью 100 см³, доводят до метки деионизированной водой и перемешивают. Массовая концентрация метронидазола-d4 в растворе D₁ составляет 400 нг/см³. Срок хранения раствора при температуре от 0 °C до 8 °C - не более 3 мес.

7.3. Установление градуировочной характеристики.

7.3.1. Для построения градуировочной характеристики берут "чистые" пробы, приготовленные и проанализированные ранее, не содержащие натамицин более 0,001 мг/кг, в зависимости от типа исследуемой матрицы. Взвешивают по 1,0 г, в пробы добавляют 50 мм³ внутреннего стандарта D₁, градуировочные растворы C₁ - C₄, с таким расчетом, чтобы массовые доли натамицина находились в пределах от 0,001 до 1 мг/кг, далее проводят пробоподготовку по главе IX.

7.3.2. Для получения градуировочной характеристики используют не менее четырех уровней концентраций матричных градуировочных растворов.

7.3.3. При построении градуировочной зависимости для количественного определения натамицина анализируют матричные градуировочные растворы различных уровней концентраций в условиях, описанных в главах VIII и XII. Затем строят графики зависимости массовой доли натамицина от отношения площади хроматографического пика натамицина к площади пика внутреннего стандарта для каждого характеристичного иона. Построение графиков может проводиться при помощи программы обработки данных ВЭЖХ-МС/МС или при помощи компьютерной программы (например, Excel).

8.1. Для учета специфики отбора проб отдельных видов продуктов следует руководствоваться действующей нормативно-технической документацией на конкретную продукцию.

9.1. Пищевая продукция.

Каждую пробу измельчают на гомогенизаторе и взвешивают по 1 г гомогенизированной пробы в полипропиленовой пробирке на лабораторных весах с наибольшим пределом взвешивания 200 г. В пробирку добавляют 50 мм³ раствора внутреннего стандарта D₁ по (п. 7.2.3.7) и оставляют для уравновешивания на 15 мин. Затем добавляют 4 см³ 0,5%-го раствора муравьиной кислоты в метаноле по (п. 7.2.2) закрывают крышкой и интенсивно перемешивают на встряхивателе в течение 15 мин. Далее виалы с образцами помещают на предварительно охлажденную до 4 °C центрифугу и центрифугируют при 4000 об/мин в течение 15 мин. После чего обезжиривают путем добавления 3 см³ гексана. Пробирку помещают в шейкер на 15 мин. Далее виалы с образцами помещают на предварительно охлажденную до 4 °C центрифугу и центрифугируют при 4000 об/мин в течение 15 мин. Отбирают 1 см³ нижнего слоя в микроцентрифужную пробирку и оставляют в морозильной камере на 60 мин. Далее пробирки с образцами помещают на предварительно охлажденную до 4 °C центрифугу и центрифугируют при 14000 об/мин в течение 15 мин. Пипеточным дозатором переносят центрифугат в виалу для автосамплера жидкостного хроматографа. Полученный раствор используют для ВЭЖХ-МС/МС анализа.

9.2. Сыр, сырные продукты, плавленый сыр и др.

Сыр натирают на металлической бытовой терке с мелкой перфорацией, взвешивают 1,0 г гомогенизированной пробы в полипропиленовой пробирке, добавляют 50 мм³ раствора внутреннего стандарта D₁ (по п. 7.2.3.7). Далее обработку проб и подготовку к хроматографированию проводят по п. 9.1.

10.1. Хромато-масс-спектрометр включают в соответствии с руководством (инструкцией) по эксплуатации и устанавливают параметры, рекомендуемые изготовителем капиллярных колонок. Например, для колонки диаметром 3 мм, длиной 100 мм, с обращенно-фазным сорбентом C18 с размером частиц 3 мкм, применяют следующие хроматографические условия:

- температура колонки - 30 °C;

- скорость потока подвижной фазы - 0,3 см³/мин;

- объем вводимой пробы - 3 мм³.

10.2. Разделение проводят в режиме градиентного элюирования (приготовление элюентов в соответствии с п. 9.1.1): в начальный момент элюирование в 10%-й подвижной фазе Б, далее по 11,0 мин переход к 60% фазы Б; с 11,0 до 11,1 переход к 90% фазы Б, с 11,1 по 12,5 мин поддерживается 90% фазы Б; с 12,5 по 12,6 мин переход к 10% фазы Б, и далее по 15,0 мин происходит уравновешивание хроматографической колонки в фазе А/Б по объему (90/10).

Условия детектирования на тройном квадрупольном масс-спектрометрическом детекторе:

- поток газа-осушителя - 10,0 л/мин;

- температура интерфейса 300 °C;

- температура линии десольватации 250 °C;

- температура нагревательного блока 400 °C;

- скорость сканирования 10 скан/с.

Детектирование пиков проводят методом регистрации выбранных реакций. Для каждого соединения измеряют сигнал для двух ионов согласно табл. 3.

--------------------------------

<*> Примечание. Допускается использование другого внутреннего стандарта, близкого по физико-химическим свойствам.

11.1. Расчеты содержания натамицина выполняют с помощью градуировочной характеристики следующим образом. Вычисляют отношение площади пика фрагментного иона к площади внутреннего стандарта с помощью программы обработки спектров, поставляемой вместе с хромато-масс-спектрометром. Затем для найденного значения (абсциссы) находят точку на градуировочной характеристике. Ордината этой точки является искомым содержанием.

11.2. Окончательные результаты измерений содержания натамицина округляют до целого значения и выражают в микрограммах на килограмм.

12.1. За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

13.1. Результат анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

14.1. Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ Р ИСО 5725-6, используя контроль стабильности среднеквадратичного (стандартного) отклонения промежуточной прецизионности по 6.2.3 ГОСТ Р ИСО 5725-6 и показателя правильности по п. 6.2.4 ГОСТ Р ИСО 5725-6.

1. ГОСТ 12.1.004 "Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования".

2. ГОСТ 12.1.005 "Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны".

3. ГОСТ 12.1.007 "Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".

4. ГОСТ 12.1.018-93 "Система стандартов безопасности труда. Пожаровзрывобезопасность статического электричества. Общие требования".

5. ГОСТ 12.1.019 "Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты".

6. ГОСТ ИСО 5725-1 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения".

7. ГОСТ ИСО 5725-6 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике".

8. ГОСТ Р 53228 "Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания".

9. ГОСТ 1770 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) "Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия".

10. ГОСТ 29169-91 (ИСО 648-77) "Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой".

11. ГОСТ 29227 "Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования".

12. ГОСТ 5848 "Реактивы. Кислота муравьиная. Технические условия".

13. ГОСТ 6995 "Реактивы. Метанол-яд. Технические условия".

14. ГОСТ Р 52501 "Вода для лабораторного анализа. Технические условия".