"МУК 4.1.3875-23. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методика определения остаточного содержания полипептидных антибиотиков в пищевой продукции методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 26.06.2023)

1. Разработаны ФБУЗ "Федеральный центр гигиены и эпидемиологии" Роспотребнадзора (А.А. Гарбузова, М.В. Зароченцев, О.В. Андросова, А.А. Константинов, И.П. Семенова, Н.А. Горячев, В.В. Бояркина, М.М. Дударев, С.А. Мокренская).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 26 июня 2023 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) распространяются на пищевую продукцию и продовольственное (пищевое) сырье: молоко и молочные продукты любой жирности, в т.ч. творог, сухое молоко, концентрированное и сгущенное молоко, сметана, жидкие молочные продукты (кефир, йогурт, сыворотка, сливки и т.д.), и устанавливают метод определения остаточного содержания полипептидных антибиотиков (бацитрацин, колистин A, колистин B, полимиксин B1, полимиксин B2, вирджиниамицин S, вирджиниамицин M) с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (далее - ВЭЖХ-МС/МС) в диапазоне от 0,01 до 0,2 мг/кг.

1.2. МУК носят рекомендательный характер.

2.1. Физико-химические свойства бацитрацина.

Бацитрацин - полипептидный антибиотик (рисунок 1). Угнетает синтез клеточной стенки путем подавления кругооборота липидных переносчиков субъединиц пептидогликанов, что также реализуется в виде бактерицидного действия. Бацитрацин в сочетании с другими антибиотиками (неомицин, полимиксин B) используется для наружного применения при лечении заболеваний кожи, глаз или носа, но может назначаться и внутрь, в виде инъекций, в качестве кишечного антисептика.

Регистрационный номер CAS: 22601-59-8.

Эмпирическая формула: C₆₆H₁₀₃N₁₇O₁₅S.

Молекулярная масса: 1422,69.

Моноизотопная молекулярная масса: 1421,75.

Цвет: белый порошок.

Точка плавления - плюс 221 - 225 °C.

Растворимость в воде: 24 мг/дм³ (при плюс 21 °C).

Коэффициент распределения в системе октанол/вода (при плюс 25 °C): K_owlog P = -0,8.

2.2. Физико-химические свойства колистина.

Колистин-антибиотик, продуцируемый некоторыми штаммами бактерии Paenibacillus polymyxa, эффективен против большинства грамотрицательных бактерий. Колистин является лекарством последнего резерва для лечения инфекционных заболеваний, вызванных грамотрицательными бактериями с множественной лекарственной устойчивостью. В ветеринарии препарат используется в виде колистина сульфата, как в чистом виде, так и в комбинации с другими антибиотиками. Препарат эффективен при лечении животных и птиц с заболеваниями органов дыхания, желудочно-кишечного тракта и другими болезнями.

2.2.1. Колистин A (рис. 2).

Регистрационный номер CAS: 7722-44-3.

Эмпирическая формула: C₅₃H₁₀₀N₁₆O₁₃.

Молекулярная масса: 1169,46.

Моноизотопная молекулярная масса: 1168,77.

2.2.2. Колистин B (рис. 3).

Регистрационный номер CAS: 7239-48-7.

Эмпирическая формула: C₅₂H₉₈N₁₆O₁₃.

Молекулярная масса: 1155,46.

Моноизотопная молекулярная масса: 1154,75.

2.3. Физико-химические свойства Полимиксина B.

Полимиксин B - антибиотик полипептидной структуры. Механизм действия обусловлен главным образом блокадой проницаемости цитоплазматической мембраны бактериальных клеток, что приводит к их деструкции. Действует преимущественно на грамотрицательные микроорганизмы. Устойчивость развивается медленно; вызывает перекрестную с колистином резистентность.

2.3.1. Полимиксин B1 (рис. 4).

Регистрационный номер CAS: 4135-11-9.

Эмпирическая формула: C₅₆H₉₈N₁₆O₁₃.

Молекулярная масса: 1203,50.

Моноизотопная молекулярная масса: 1202,75.

2.3.2. Полимиксин В2 (рис. 5).

Регистрационный номер CAS: 1404-26-8.

Эмпирическая формула: C₅₅H₉₆N₁₆O₁₃.

Молекулярная масса: 1189,45.

Моноизотопная молекулярная масса: 1188,73.

2.4. Физико-химические свойства вирджиниамицина.

Вирджиниамицин продуцируется культурой Streptomyces virginiae, обладает бактериостатическим, а в высоких концентрациях - бактерицидным действием в отношении большинства грамположительных и некоторых грамотрицательных бактерий. Он представляет собой смесь семи макроциклических пептидлактонов, объединенных в две группы: M и S. Основными компонентами культуральных жидкостей Streptomyces virginiae являются вирджиниамицины M1 и S1. Применяется для профилактики и лечения некротического энтерита у цыплят-бройлеров, кур, а также для стабилизации кишечной микрофлоры, увеличения привесов, улучшения использования кормов.

2.4.1. Вирджиниамицин M1 (рис. 6).

Регистрационный номер CAS: 21411-53-0.

Эмпирическая формула: C₂₈H₃₅N₃O₇.

Молекулярная масса: 525,59.

Моноизотопная молекулярная масса: 525,25.

2.4.2. Вирджиниамицин S1 (рис. 7).

Регистрационный номер CAS: 23152-29-6.

Эмпирическая формула: C₄₃H₄₉N₇O₁₀.

Молекулярная масса: 823,90.

Моноизотопная молекулярная масса: 823,35.

3.1. Метод основан на определении полипептидных антибиотиков с помощью ВЭЖХ-МС/МС после его экстракции из образцов органическим растворителем и очистки экстракта с помощью твердофазной экстракции.

3.2. Количественное определение остаточного содержания полипептидных антибиотиков проводят методом внутреннего стандарта по площадям хроматографических пиков с помощью градуировочной характеристики, полученной при анализе градуировочных растворов в аналогичных условиях.

4.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

5.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы, приведенные в табл. 2 - 4.

Примечание. Допускается применение других средств измерений, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам.

Примечание. Допускается применение других реактивов по качеству не хуже вышеуказанных.

Примечание. Допускается применение другого вспомогательного оборудования, не уступающего вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам.

6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф с масс-спектрометрическим детектированием.

6.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

6.3. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

7.1. Для учета специфики отбора проб отдельных видов пищевой продукции и продовольственного (пищевого) сырья следует руководствоваться действующей нормативно-технической документацией на конкретную продукцию.

8.1. При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха плюс (15 - 30) °C, относительной влажности не более 85%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

9.1. Выполнению измерений предшествуют приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики.

9.2. Приготовление растворов для проведения анализа.

9.2.1. Приготовление подвижных фаз А и Б.

9.2.1.1. Приготовление подвижной фазы А.

Для приготовления подвижной фазы А в мерную колбу вместимостью 1000 см³ вносят с помощью мерного цилиндра 500 см³ деионизированной воды, добавляют 5,0 см³ муравьиной кислоты и доводят раствор деионизированной водой до метки, перемешивают.

Приготовленный раствор хранят при комнатной температуре не более 1 недели.

9.2.1.2. Приготовление подвижной фазы Б.

В качестве подвижной фазы Б используют ацетонитрил. Подвижную фазу хранят при комнатной температуре не более 3 месяцев.

9.2.2. Приготовление рабочих растворов.

9.2.2.1. Приготовление смеси метанол:вода в объемном соотношении 1:1.

В мерную колбу объемом 1000 см³ приливают с помощью мерного цилиндра 500 см³ метанола и доводят деионизированной водой до метки.

Приготовленный раствор хранят при комнатной температуре не более 1 месяца.

9.2.2.2. Приготовление смеси метанол:вода в объемном соотношении 4:6.

В мерную колбу объемом 1000 см³ приливают с помощью мерного цилиндра 400 см³ метанола и доводят деионизированной водой до метки.

Приготовленный раствор хранят при комнатной температуре не более 1 месяца.

9.2.2.3. Приготовление раствора 1% муравьиной кислоты в смеси метанол:вода в объемном соотношении 4:6.

В мерную колбу объемом 1000 см³ с помощью мерного цилиндра добавляют 500 мл смеси по п. 9.2.2.2, вносят 10 мл муравьиной кислоты и доводят до метки смесью по п. 9.2.2.2.

Приготовленный раствор хранят при комнатной температуре не более 1 месяца.

9.2.2.4. Приготовление 0,5%-го раствора муравьиной кислоты в метаноле.

В мерную колбу на 500 см³ с помощью мерного цилиндра вносят 450 см³ метанола, добавляют 2,5 см³ муравьиной кислоты, доводят раствор до метки метанолом и перемешивают.

Приготовленный раствор хранят при комнатной температуре не более 3 месяцев.

9.2.2.5. Приготовление раствора для перерастворения (смесь подвижной фазы А и подвижной фазы Б в объемном соотношении 8:2).

В мерную колбу на 100 см³ с помощью мерного цилиндра вносят 80 см³ подвижной фазы А и 20 см³ подвижной фазы Б.

Приготовленный раствор хранят при комнатной температуре не более 2 недель.

9.2.3. Приготовление градуировочных растворов.

9.2.3.1. Приготовление исходных растворов C₀.

Для приготовления исходных растворов Колистина A, Колистина Б, Полимиксина B2, Вирджиниамицина-S1, Бацитрацина A, Вирджиниамицина-M1, Полимиксина B1 с концентрацией 1 мг/см³ рассчитывают необходимое количество препарата с известным содержанием основного вещества, соответствующее 10 мг чистого вещества.

В мерную колбу вместимостью 10 см³ вносят рассчитанную массу препарата для градуировки. Добавляют 8 см³ смеси метанол:вода (п. 9.2.2.1), перемешивают и помещают в ультразвуковую баню на 1 мин, далее доводят полученный раствор до метки 10 см³ смесью метанол:вода (п. 9.2.2.1).

9.2.3.2. Приготовление рабочего раствора C₁ концентрацией 10 мкг/см³.

Раствор C₁ готовят в мерной колбе на 10 см³ согласно табл. 5.

Массовая концентрация всех аналитов в растворе составляет 10 мкг/см³.

Приготовленный раствор хранят при температуре от минус 18 до минус 37 °C не более 3 месяцев.

9.2.3.3. Приготовление рабочего раствора C₂ концентрацией 2 мкг/см³.

Для приготовления рабочего раствора C₂ переносят 2,0 см³ рабочего раствора C₁ в мерную колбу вместимостью 10 см³, доводят до метки метанолом и перемешивают. Массовая концентрация всех аналитов в растворе составляет 2 мкг/см³.

Приготовленный раствор хранят при температуре от плюс 2 до плюс 4 °C не более 3 дней.

9.2.3.4. Приготовление рабочего раствора C₃ концентрацией 200 нг/см³.

Для приготовления рабочего раствора C₃ переносят 1,0 см³ рабочего раствора C₂ в мерную колбу вместимостью 10 см³, доводят до метки метанолом и перемешивают. Массовая концентрация всех аналитов в растворе составляет 200 нг/см³.

Приготовленный раствор хранят при температуре от плюс 2 до плюс 4 °C не более 3 дней.

9.2.3.5. Приготовление исходного раствора внутреннего стандарта D₀.

Для приготовления рабочего раствора D₀ на аналитических весах взвешивают 10 мг чистого вещества стандартного образца Вирджиниамицина-M1-d2 и вносят в мерную колбу на 10 см³. Добавляют 8 см³ смеси метанол:вода (п. 9.2.2.1), перемешивают и помещают в ультразвуковую баню на 1 мин, далее доводят полученный раствор до метки 10 см³ смесью метанол:вода (п. 9.2.2.1). Массовая концентрация Вирджиниамицина-M1-d2 в исходном растворе составляет 1 мг/см³.

Приготовленный раствор хранят при температуре от -18 до -37 °C не более 6 месяцев.

9.2.3.6. Приготовление рабочего раствора D₁ внутреннего стандарта.

Для приготовления рабочего раствора D₁ в мерную колбу вместимостью 10 см³ с помощью мерного цилиндра добавляют 7 см³ метанола, переносят 1 см³ раствора D₀, доводят до метки метанолом и перемешивают. Массовая концентрация Вирджиниамицина-M1-d₂ в рабочем растворе D₁ составляет 100 мкг/см³.

Приготовленный раствор хранят при температуре от минус 18 до минус 37 °C не более 3 месяцев.

9.2.3.7. Приготовление рабочего раствора D₂ внутреннего стандарта.

Для приготовления рабочего раствора D₂ в мерную колбу вместимостью 10 см³ с помощью мерного цилиндра добавляют 7 см³ метанола, переносят 200 мм³ раствора D₁, доводят до метки метанолом и перемешивают. Массовая концентрация Вирджиниамицина-M1-d₂ в рабочем растворе D₂ составляет 2 мкг/см³.

Приготовленный раствор хранят при температуре от минус 18 до минус 37 °C не более 3 месяцев.

9.3. Установление градуировочной характеристики.

9.3.1. Для построения градуировочной характеристики берут "чистые" пробы, приготовленные и проанализированные ранее, не содержащие определяемые аналиты более 0,01 мг/кг, в зависимости от типа исследуемой матрицы. Взвешивают по 2,0 г, в пробы добавляют 50 мм³ рабочего раствора внутреннего стандарта D₁, градуировочные растворы G₁ - G₅, с таким расчетом, чтобы массовые доли определяемых антибиотиков полипептидной группы находились в пределах от 0,01 до 0,2 мг/кг (схема приготовления градуировки представлена в табл. 6), далее проводят пробоподготовку по п. 10.1.

9.3.2. Для получения градуировочной характеристики используют не менее четырех уровней концентраций матричных градуировочных растворов. Каждый градуировочный раствор измеряют два раза. Определяют значения времени удерживания ион-продуктов аналитов и их внутренних стандартов.

9.3.3. При построении градуировочной зависимости для количественного определения полипептидных антибиотиков анализируют матричные градуировочные растворы различных уровней концентраций в условиях, описанных в п. 8.1 и п. 12.1.

9.3.4. Вычисление площади пика проводят для каждого анализируемого вещества и внутреннего стандарта. Количественное определение полипептидных антибиотиков проводят по одному, наиболее интенсивному и характерному, ион-продукту.

9.3.5. Градуировочную характеристику строят в координатах "отношение площади пика определяемого соединения к площади пика внутреннего стандарта этого соединения" - "отношение концентраций аналита и внутреннего стандарта". При построении градуировочной характеристики используют линейную регрессию вида y = ax + b, при этом коэффициент корреляции должен быть не менее 0,98. Построение градуировочной характеристики проводят при каждой серии измерений заново. Построение графиков может проводиться при помощи программы обработки данных ВЭЖХ-МС/МС или при помощи сторонних программ расчета градуировочных характеристик.

10.1. Подготовка проб молока и молочной продукции.

10.1.1. Образец тщательно перемешивают с помощью гомогенизатора, взвешивают по 2,0 г в полипропиленовой пробирке объемом 15 см³. В пробирку с образцом добавляют 50 мм³ раствора внутреннего стандарта D1 по (п. 9.2.3.6), перемешивают на вортексе для пробирок и оставляют для уравновешивания на 10 мин в темном месте. Затем добавляют 7 см³ 1% муравьиной кислоты в смеси метанол:вода в объемном соотношении 4:6 по п. 9.2.2.3, закрывают крышкой и интенсивно перемешивают на ротационном перемешивателе в течение 20 минут. Далее пробирки с образцами помещают на предварительно охлажденную до плюс 4 °C центрифугу и центрифугируют при 4000 об/мин в течение 15 мин. Полученный экстракт очищают методом твердофазной экстракции по п. 10.1.2.

10.1.2. Картриджи для твердофазной экстракции предварительно кондиционируют, последовательно пропуская 6 см³ метанола и 6 см³ деионизованной воды (вакуум или избыточное давление не применяют). Затем пропускают через картридж экстракт, полученный в соответствии с 10.1.1. После этого промывают картридж деионизованной водой 2 раза порциями по 6 см³ и сушат под вакуумом в течение 5 мин. Элюируют определяемые вещества в новую полипропиленовую пробирку вместимостью 15 см³ с использованием 5 см³ раствора 0,5% муравьиной кислоты в метаноле (п. 9.2.2.4). Упаривают элюат в токе азота до (0,1 - 0,2) см³ при температуре плюс 40 °C. Добавляют 500 мкл раствора для перерастворения (п. 9.2.2.5), помещают в ультразвуковую баню на 1 мин, перемешивают и переносят в микроцентрифужную пробирку. Доводят объем раствора до 1 см³ раствором для перерастворения (п. 9.2.2.5) и центрифугируют при плюс 4 °C со скоростью вращения 14000 об/мин в течение 15 мин. Пипеточным дозатором переносят центрифугат в виалу для автосамплера жидкостного хроматографа. При необходимости раствор фильтруют через мембранный фильтр. Полученный раствор используют для ВЭЖХ-МС/МС анализа.

10.1.3. В случае если массовая доля полипептидного антибиотика выше верхнего диапазона определяемых концентраций разбавить пробу в 10 раз, используя образец, не содержащий соответствующего полипептидного антибиотика, повторить пробоподготовку (п. 10.1). При расчете массовой доли полипептидных антибиотиков в пробах молока и молочных продуктов учесть разбавление в конечном расчете концентрации, умножив полученное содержание на коэффициент разбавления.

10.2. Условия хроматографирования.

10.2.1. Жидкостный хромато-масс-спектрометр включают в соответствии с руководством (инструкцией) по эксплуатации и устанавливают параметры, рекомендуемые изготовителем аналитических колонок. Например, для колонки диаметром 2 мм, длиной 150 мм, с обращенно-фазным сорбентом C18 с размером частиц 2,2 мкм, применяют следующие хроматографические условия:

- температура колонки - плюс 40 °C;

- скорость потока подвижной фазы - 0,25 см³/мин;

- объем вводимой пробы - 5 мм³.

10.2.2. Разделение проводят в режиме градиентного элюирования в соответствии с таблицей 7.

Условия детектирования на тройном квадрупольном масс-спектрометрическом детекторе (пример):

- поток газа-осушителя - 6,0 л/мин;

- поток газа-распылителя - 2,5 л/мин;

- температура интерфейса - плюс 300 °C;

- температура линии десольватации - плюс 200 °C;

- температура нагревательного блока - плюс 300 °C;

- скорость сканирования - 10 сканов/с.

Детектирование пиков проводят методом "регистрации выбранных реакций" (MRM). Для каждого соединения измеряют сигнал для двух дочерних ионов согласно таблице 8.

Примечание. Приведенные выше параметры хроматографического разделения и масс-спектрометрического детектирования могут отличаться в зависимости от используемого оборудования и хроматографической колонки.

10.2.3. Контроль чувствительности хромато-масс-спектрометрической системы осуществляют введением в инжектор хроматографа 0,005 см³ матричного градуировочного раствора G1, полученное соотношение сигнал/шум для каждого аналита должно быть не менее 10.

11.1. В соответствии с данными, полученными при анализе градуировочных растворов, проводят количественную обработку хроматограмм с использованием программного обеспечения, получая значения массовой концентрации антибиотиков полипептидной группы в двух параллельных измерениях анализируемой пробы.

11.2. Массовую долю полипептидных антибиотиков в пробах молока и молочных продуктов вычисляют при помощи встроенной программы обработки данных ВЭЖХ-МС/МС или при помощи других программ расчета градуировочных характеристик по линейному уравнению вида:

где y - отношение площади пика аналита к площади пика внутреннего стандарта;

x - отношение концентрации аналита к концентрации внутреннего стандарта;

a - угловой коэффициент прямой;

b - показатель ординаты точки пересечения прямой с осью ординат.

Расчет содержания полипептидных антибиотиков C_в-ва мкг/кг выполняется в соответствии с формулой:

где C_ст - концентрация внутреннего стандарта, мкг/кг;

S_в-ва - площадь пика аналита;

S_ст - площадь пика внутреннего стандарта.

12.1. За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (3):

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

13.1. Результат анализа представляют в виде:

, мг/кг при вероятности P = 0,95,

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.

В случае, если содержание полипептидных антибиотиков менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

где * 0,01 мг/кг - предел количественного обнаружения полипептидных антибиотиков в молоке и молочных продуктах.

14.1. Контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-(1 - 6).

Периодичность и формы контроля определяются руководством по качеству.

1. Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. ГОСТ 12.1.004 "Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования".

3. ГОСТ 12.1.005 "Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны".

4. ГОСТ 12.1.007 "Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".

5. ГОСТ Р ИСО 5725-(1 - 6) "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

6. ГОСТ Р 53228 "Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания".

7. ГОСТ 1770 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) "Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия".

8. ГОСТ 29169-91 (ИСО 648-77) "Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой".

9. ГОСТ 29227 "Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования".

10. ГОСТ 5848 "Реактивы. Кислота муравьиная. Технические условия".

11. ГОСТ 6995 "Реактивы. Метанол-яд. Технические условия".

12. ГОСТ Р 52501 "Вода для лабораторного анализа. Технические условия".