"МУК 4.1.4000-24. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методика измерений массовых концентраций антибиотиков (амоксициллин, ампициллин, азитромицин, эритромицин, оксациллин, бензилпенициллин, кларитромицин, ципрофлоксацин) в воде методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 19.02.2024)

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) описывают порядок применения высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (далее - ВЭЖХ/МС-МС) для измерения массовых концентраций азитромицина, амоксициллина, ампициллина, бензилпенициллина, кларитромицина, оксациллина, ципрофлоксацина, эритромицина в пробах воды (в питьевой воде, расфасованной в емкости, питьевой воде систем централизованного, в том числе горячего, и нецентрализованного водоснабжения, воде подземных и поверхностных водных объектов хозяйственно-питьевого и культурно-бытового водопользования, воде плавательных бассейнов, аквапарков) в диапазонах, указанных в табл. 1.1.

1.2. МУК носят рекомендательный характер.

2.1. Физико-химические свойства антибиотиков представлены в табл. 2.1.

3.1. При соблюдении условий проведения анализа <1> и методики, изложенной в настоящих МУК, погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 3.1, для соответствующих диапазонов концентраций.

--------------------------------

<1> ГОСТ Р ИСО 5725-1 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения", введенный в действие постановлением Госстандарта России от 23.04.2002 N 161-ст; ГОСТ Р ИСО 5725-2 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений", введенный в действие постановлением Госстандарта России от 23.04.2002 N 161-ст; ГОСТ Р ИСО 5725-3 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 3. Промежуточные показатели прецизионности стандартного метода измерений", введенный в действие постановлением Госстандарта России от 23.04.2002 N 161-ст; ГОСТ Р ИСО 5725-4 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 4. Основные методы определения правильности стандартного метода измерений", введенный в действие постановлением Госстандарта России от 23.04.2002 N 161-ст; ГОСТ Р ИСО 5725-5 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 5. Альтернативные методы определения прецизионности стандартного метода измерений", введенный в действие постановлением Госстандарта России от 23.04.2002 N 161-ст; ГОСТ Р ИСО 5725-6 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике", введенный в действие постановлением Госстандарта России от 23.04.2002 N 161-ст (далее - ГОСТ Р ИСО 5725-(1 - 6).

--------------------------------

<2> Пункт 5.1.10.1 РМГ 61-2010 "Показатели точности, правильности, прецизионности методик количественного химического анализа. Методы оценки", введенных приказом Росстандарта от 13.12.2011 N 1064-ст.

Границы относительной погрешности при доверительной вероятности P = 0,95 соответствуют относительной расширенной неопределенности измерений при коэффициенте охвата k = 2.

Значения показателя точности используют при:

- оформлении результатов измерений, выдаваемых лабораторией;

- оценке деятельности лабораторий на качество проведения измерений;

- оценке возможности использования результатов измерений при реализации методики измерений в конкретной лаборатории.

4.1. Метод основан на извлечении и концентрировании антибиотиков из воды способом твердофазной экстракции (далее - ТФЭ), за исключением оксациллина, бензилпенициллина и ампициллина, которые анализируют без концентрирования при непосредственном вводе в хроматограф образцов воды, разделении на жидкостном хроматографе на колонке с обращенной фазой C₁₈ и масс-спектрометрическом детектировании в режиме мониторинга множественных реакций (англ. Multiple Reaction Monitoring, далее - MRM).

4.2. Идентификация антибиотиков проводится по наличию характеристичных ионов в масс-спектрах и по времени удерживания. Количественное определение проводят по основным дочерним ионам методом абсолютной градуировки.

4.3. Степень извлечения ципрофлоксацина, кларитромицина, азитромицина, амоксициллина из воды способом ТФЭ составляет от 70% до 100%, эритромицина от 80% до 100%.

5.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы, приведенные в табл. 5.1 - 5.3.

6.1. При выполнении измерений соблюдают меры противопожарной безопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.004, имеют средства пожаротушения в соответствии с ГОСТ 12.4.009 и соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019.

6.2. Работа в лаборатории осуществляется в соответствии с методическими документами <3>.

--------------------------------

<3> ПНД Ф 12.13.1-03 "Методические рекомендации. Техника безопасности при работе в аналитических лабораториях (общие положения)", утвержденные директором ФГУ "Центр экологического контроля и анализа" Министерства природных ресурсов Российской Федерации 04.09.2003.

6.3. Работа с сосудами, работающими под давлением, осуществляется в соответствии с законодательством Российской Федерации <4>.

--------------------------------

<4> Правила промышленной безопасности при использовании оборудования, работающего под избыточным давлением, утвержденные приказом Федеральной службы по экологическому, технологическому и атомному надзору от 15.12.2020 N 536 (зарегистрировано Минюстом России 31.12.2020, регистрационный N 61998).

6.4. При работе с химическими реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.007 и ГОСТ 12.1.005.

6.5. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать гигиенические нормативы <5>.

--------------------------------

<5> СанПиН 1.2.3685-21 "Гигиенические нормативы и требования к обеспечению безопасности и (или) безвредности для человека факторов среды обитания", утвержденные постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 N 2 (зарегистрировано Минюстом России 29.01.2021 регистрационный N 62296), с изменениями, внесенными постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 30.12.2022 N 24 (зарегистрировано Минюстом России 09.03.2023, регистрационный N 72558).

6.6. При выполнении измерений на приборе соблюдают правила, указанные в инструкции по эксплуатации жидкостного хромато-масс-спектрометра.

6.7. Утилизацию растворов после выполнения измерений проводят в соответствии с инструкцией по обращению с химическими отходами, действующей на предприятии.

7.1. К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа на жидкостном хроматографе с масс-спектрометрическим детектором.

8.1. При приготовлении растворов и подготовке проб к анализу в лаборатории соблюдают следующие условия:

- температура воздуха плюс 15 - 30 °C;

- атмосферное давление (84,0 - 106,7 кПа) (630 - 800 мм рт. ст.);

- влажность воздуха 20 - 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе с масс-спектрометрическим детектором проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

9.1. Перед выполнением измерений проводят следующие работы: подготовка посуды, приготовление растворов, подготовка хромато-масс-спектрометрической системы, установление градуировочных характеристик.

9.2. Подготовка посуды.

Лабораторную посуду промывают проточной водопроводной водой, деионизированной водой, исключая применение поверхностно-активных веществ; последовательно промывают органическими растворителями: этилацетатом и ацетоном. Рекомендуется на стадиях промывки использовать ультразвуковую баню. Сушка посуды проводится в сушильном шкафу при температуре плюс 105 - 110 °C.

9.3. Приготовление растворов.

9.3.1. Раствор муравьиной кислоты в деионизированной воде с объемной концентрацией 0,1%.

В мерную колбу вместимостью 500 см³ вносят 0,5 см³ муравьиной кислоты, доводят объем раствора до метки деионизированной водой, закрывают притертой пробкой и перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,2 мкм. Срок хранения раствора при температуре плюс 4 - 15 °C не более 30 дней.

9.3.2. Раствор муравьиной кислоты в метаноле с объемной концентрацией 0,1%.

В мерную колбу вместимостью 500 см³ вносят 0,5 см³ муравьиной кислоты, доводят объем раствора до метки метанолом, закрывают притертой пробкой и перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,2 мкм. Срок хранения раствора при температуре плюс 4 - 15 °C не более 12 месяцев.

9.3.3. Подвижная фаза для элюирования.

Состав подвижной фазы: смесь 0,1%-го водного раствора муравьиной кислоты (A) и метанола (B) задают на двух каналах насоса в режиме градиентного элюирования (табл. 9.2).

9.3.4. Исходный раствор эритромицина в метаноле с массовой концентрацией 1 мг/см³.

В мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают навеску эритромицина (0,010 +/- 0,001) г с учетом массовой доли основного вещества и формы аналитического стандарта, приливают 5 см³ метанола, содержимое колбы перемешивают до полного растворения навески, доводят объем раствора в колбе до метки метанолом, закрывают притертой пробкой и перемешивают. Массовая концентрация эритромицина в исходном растворе 1 мг/см³. Срок хранения раствора при температуре не выше минус 18 °C 6 месяцев.

9.3.5. Разбавленный раствор N 1 эритромицина в метаноле с массовой концентрацией 2 мкг/см³.

В мерную колбу вместимостью 25 см³ вносят дозатором 0,05 см³ исходного раствора эритромицина в метаноле с концентрацией 1 мг/см³, доводят объем раствора в колбе до метки метанолом, закрывают притертой пробкой и перемешивают. Массовая концентрация эритромицина в разбавленном растворе N 1 составляет 2 мкг/см³. Срок хранения раствора при температуре не выше минус 18 °C 3 месяца.

9.3.6. Разбавленный раствор N 2 эритромицина в метаноле с массовой концентрацией 0,05 мкг/см³.

В мерную колбу вместимостью 25 см³ вносят дозатором 0,625 см³ разбавленного раствора эритромицина в метаноле N 1 с концентрацией 2 мкг/см³, доводят объем раствора в колбе до метки метанолом, закрывают притертой пробкой и перемешивают. Массовая концентрация эритромицина в разбавленном растворе N 2 составляет 0,05 мкг/см³. Используют свежеприготовленный раствор.

9.3.7. Разбавленный раствор N 3 эритромицина в метаноле с массовой концентрацией 0,01 мкг/см³.

В мерную колбу вместимостью 10 см³ вносят дозатором 2 см³ разбавленного раствора эритромицина в метаноле N 2 с концентрацией 0,05 мкг/см³, доводят объем раствора в колбе до метки метанолом, закрывают притертой пробкой и перемешивают. Массовая концентрация эритромицина в разбавленном растворе N 3 составляет 0,01 мкг/см³. Используют свежеприготовленный раствор.

9.3.8. Исходный раствор азитромицина в метаноле с массовой концентрацией 1 мг/см³.

В мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают навеску азитромицина (0,010 +/- 0,001) г с учетом массовой доли основного вещества и формы аналитического стандарта, приливают 5 см³ метанола; содержимое колбы перемешивают до полного растворения навески, доводят объем раствора в колбе до метки метанолом, закрывают притертой пробкой и перемешивают. Массовая концентрация азитромицина в исходном растворе 1 мг/см³. Срок хранения раствора при температуре не выше минус 18 °C 6 месяцев.

9.3.9. Разбавленный раствор N 1 азитромицина в метаноле с массовой концентрацией 1 мкг/см³.

В мерную колбу вместимостью 25 см³ вносят дозатором 0,025 см³ исходного раствора азитромицина в метаноле с концентрацией 1 мг/см³, доводят объем раствора в колбе до метки метанолом, закрывают притертой пробкой и перемешивают. Массовая концентрация азитромицина в разбавленном растворе N 1 составляет 1 мкг/см³. Срок хранения раствора при температуре не выше минус 18 °C 3 месяца.

9.3.10. Разбавленный раствор N 2 азитромицина в метаноле с массовой концентрацией 0,005 мкг/см³.

В мерную колбу вместимостью 25 см³ вносят дозатором 0,125 см³ разбавленного раствора азитромицина в метаноле N 1 с концентрацией 1 мкг/см³, доводят объем раствора в колбе до метки метанолом, закрывают притертой пробкой и перемешивают. Массовая концентрация азитромицина в разбавленном растворе N 2 составляет 0,005 мкг/см³. Используют свежеприготовленный раствор.

9.3.11. Разбавленный раствор N 3 азитромицина в метаноле с массовой концентрацией 0,001 мкг/см³.

В мерную колбу вместимостью 25 см³ вносят дозатором 5 см³ разбавленного раствора азитромицина в метаноле N 2 с концентрацией 0,005 мкг/см³, доводят объем раствора в колбе до метки метанолом, закрывают притертой пробкой и перемешивают. Массовая концентрация азитромицина в разбавленном растворе N 3 составляет 0,001 мкг/см³. Используют свежеприготовленный раствор.

9.3.12. Исходный раствор амоксициллина в метаноле с массовой концентрацией 1 мг/см³.

В мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают навеску амоксициллина (0,010 +/- 0,001) г с учетом массовой доли основного вещества и формы аналитического стандарта, приливают 5 см³ метанола, содержимое колбы перемешивают до полного растворения навески; доводят объем раствора в колбе до метки метанолом, закрывают притертой пробкой и перемешивают. Массовая концентрация амоксициллина в исходном растворе 1 мг/см³. Срок хранения раствора при температуре не выше минус 18 °C 3 месяца.

9.3.13. Исходный раствор кларитромицина в метаноле с массовой концентрацией 1 мг/см³.

В мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают навеску кларитромицина (0,010 +/- 0,001) г с учетом массовой доли основного вещества и формы аналитического стандарта, приливают 5 см³ метанола, содержимое колбы перемешивают до полного растворения навески, доводят объем раствора в колбе до метки метанолом, закрывают притертой пробкой и перемешивают. Массовая концентрация кларитромицина в исходном растворе 1 мг/см³. Срок хранения раствора при температуре не выше минус 18 °C 6 месяцев.

9.3.14. Исходный раствор ципрофлоксацина в метаноле с массовой концентрацией 0,2 мг/см³.

В мерную колбу вместимостью 50 см³ помещают навеску ципрофлоксацина (0,010 +/- 0,001) г с учетом массовой доли основного вещества и формы аналитического стандарта, приливают 25 см³ метанола, закрывают колбу пробкой и помещают в ультразвуковую баню на 5 - 10 мин до полного растворения ципрофлоксацина; доводят объем раствора в колбе до метки метанолом, закрывают притертой пробкой и перемешивают. Массовая концентрация ципрофлоксацина в исходном растворе 0,2 мг/см³. Срок хранения раствора при температуре не выше минус 18 °C 3 месяца.

9.3.15. Разбавленный раствор N 1 смеси амоксициллина, кларитромицина и ципрофлоксацина в метаноле с массовой концентрацией 2 мкг/см³.

В мерную колбу вместимостью 25 см³ вносят дозатором по 0,05 см³ исходных растворов амоксициллина, кларитромицина в метаноле с концентрациями 1 мг/см³ и 0,25 см³, ципрофлоксацина в метаноле с концентрацией 0,2 мг/см³; доводят объем раствора в колбе до метки метанолом, закрывают притертой пробкой и перемешивают. Массовые концентрации амоксициллина, кларитромицина и ципрофлоксацина в разбавленном растворе N 1 составляют 2 мкг/см³. Срок хранения раствора при температуре не выше минус 18 °C 3 месяца.

9.3.16. Разбавленный раствор N 2 смеси амоксициллина, кларитромицина и ципрофлоксацина в метаноле с массовой концентрацией 0,02 мкг/см³.

В мерную колбу вместимостью 25 см³ вносят дозатором 0,25 см³ разбавленного раствора амоксициллина, кларитромицина и ципрофлоксацина в метаноле N 1 с концентрацией 2 мкг/см³, доводят объем раствора в колбе до метки метанолом, закрывают притертой пробкой и перемешивают. Массовая концентрация амоксициллина, кларитромицина и ципрофлоксацина в разбавленном растворе N 2 составляет 0,02 мкг/см³. Используют свежеприготовленный раствор.

9.3.17. Разбавленный раствор N 3 смеси амоксициллина, кларитромицина и ципрофлоксацина в метаноле с массовой концентрацией 0,004 мкг/см³.

В мерную колбу вместимостью 25 см³ вносят дозатором 5 см³ разбавленного раствора амоксициллина, кларитромицина и ципрофлоксацина в метаноле N 2 с концентрацией 0,02 мкг/см³, доводят объем раствора в колбе до метки метанолом, закрывают притертой пробкой и перемешивают. Массовая концентрация амоксициллина, кларитромицина и ципрофлоксацина в разбавленном растворе N 3 составляет 0,004 мкг/см³. Используют свежеприготовленный раствор.

9.3.18. Исходный раствор ампициллина в метаноле с массовой концентрацией 1 мг/см³.

В мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают навеску ампициллина (0,010 +/- 0,001) г с учетом массовой доли основного вещества и формы аналитического стандарта, приливают 5 см³ метанола, содержимое колбы перемешивают до полного растворения навески, доводят объем раствора в колбе до метки метанолом, закрывают притертой пробкой и перемешивают. Массовая концентрация ампициллина в исходном растворе 1 мг/см³. Срок хранения раствора при температуре не выше минус 18 °C 3 месяца.

9.3.19. Исходный раствор бензилпенициллина в метаноле с массовой концентрацией 1 мг/см³.

В мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают навеску бензилпенициллина (0,010 +/- 0,001) г с учетом массовой доли основного вещества и формы аналитического стандарта, приливают 5 см³ метанола, содержимое колбы перемешивают до полного растворения навески, доводят объем раствора в колбе до метки метанолом, закрывают притертой пробкой и перемешивают. Массовая концентрация бензилпенициллина в исходном растворе 1 мг/см³. Срок хранения раствора при температуре не выше минус 18 °C 3 месяца.

9.3.20. Исходный раствор оксациллина в метаноле с массовой концентрацией 1 мг/см³.

В мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают навеску оксациллина (0,010 +/- 0,001) г с учетом массовой доли основного вещества и формы аналитического стандарта, приливают 5 см³ метанола, содержимое колбы перемешивают до полного растворения навески, доводят объем раствора в колбе до метки метанолом, закрывают притертой пробкой и перемешивают. Массовая концентрация оксациллина в исходном растворе 1 мг/см³. Срок хранения раствора при температуре не выше минус 18 °C 3 месяца.

9.3.21. Разбавленный раствор N 1 ампициллина, бензилпенициллина и оксациллина в метаноле с массовой концентрацией 25 мкг/см³.

В мерную колбу вместимостью 25 см³ вносят дозатором по 0,625 см³ исходных растворов ампициллина, бензилпенициллина и оксациллина с концентрацией - 1 мг/см³, доводят объем раствора в колбе до метки метанолом, закрывают притертой пробкой и перемешивают. Массовая концентрация ампициллина, бензилпенициллина и оксациллина в разбавленном растворе N 1 составляет 25 мкг/см³. Срок хранения раствора при температуре не выше минус 18 °C 1 месяц.

9.3.22. Разбавленный раствор N 2 ампициллина, бензилпенициллина и оксациллина в метаноле с массовой концентрацией 5 мкг/см³.

В мерную колбу вместимостью 25 см³ вносят дозатором 5 см³ исходного раствора ампициллина, бензилпенициллина и оксациллина с концентрацией 25 мкг/см³, доводят объем раствора в колбе до метки метанолом, закрывают притертой пробкой и перемешивают. Массовая концентрация ампициллина, бензилпенициллина и оксациллина в разбавленном растворе N 2 составляет 5 мкг/см³. Используют свежеприготовленный раствор.

9.3.23. Водный раствор натрия тиосульфата с массовой долей 2%.

В мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 2 г натрия тиосульфата, доводят объем раствора до метки деионизированной водой, закрывают притертой пробкой и перемешивают. Срок хранения раствора при комнатной температуре 10 дней.

9.4. Подготовка хромато-масс-спектрометрической системы.

9.4.1. Подготовку хромато-масс-спектрометрической системы к работе проводят в соответствии с руководством по эксплуатации прибора.

9.4.2. Режим работы хромато-масс-спектрометрической системы.

Режим работы хромато-масс-спектрометрической системы устанавливают в соответствии с условиями, указанными в табл. 9.1.

--------------------------------

<6> Примечание: допускается корректировка рабочих параметров масс-спектрометрического детектора в соответствии с руководством по эксплуатации прибора.

9.5. Установление градуировочных характеристик.

9.5.1. Градуировочную характеристику, выражающую зависимость сигнала детектора от массовой концентрации антибиотика в анализируемом растворе, устанавливают методом абсолютной градуировки по пяти сериям градуировочных растворов. Каждую серию, состоящую из пяти градуировочных растворов, готовят из разбавленных растворов антибиотиков, приготовленных в соответствии с п. 9.3.6 - 9.3.7, 9.3.10 - 9.3.11, 9.3.16 - 9.3.17, 9.3.22.

9.5.2. Градуировочные растворы эритромицина в деионизированной воде готовят в мерных колбах вместимостью 10 см³. В каждую колбу вносят дозатором разбавленные растворы эритромицина N 2 и N 3 в соответствии с табл. 9.3, доводят объем раствора в колбе до метки деионизированной водой, закрывают притертой пробкой и перемешивают. Проводят ТФЭ градуировочных растворов эритромицина с использованием вакуумной установки для ТФЭ и картриджей HLB 6CC/500 мг следующим образом:

- промывают картридж, пропуская через него 5 см³ метанола, 5 см³ деионизированной воды со скоростью потока не более 0,2 см³/мин (без применения вакуума);

- загружают на картридж 10 см³ градуировочного раствора;

- промывают картридж 2 см³ деионизированной воды для удаления слабоудерживаемых компонентов;

- элюируют эритромицин с картриджа 10 см³ метанола, собирая метанольный экстракт в коническую полипропиленовую пробирку вместимостью 15 см³, и упаривают при температуре плюс 40 °C в потоке воздуха <7> до 1 см³.

--------------------------------

<7> Примечание: допускается применять для данных целей любой инертный газ (азот, аргон, гелий).

Полученный экстракт фильтруют в хроматографическую виалу через шприцевой фильтр диаметром 13 мм и размером пор 0,2 мкм и анализируют аликвоту в количестве 10 мм³ в рабочем режиме хроматографа (п. 9.4.2).

9.5.3. Градуировочные растворы азитромицина в деионизированной воде готовят в мерных колбах вместимостью 10 см³. В каждую колбу вносят дозатором разбавленные растворы азитромицина N 2 и N 3 в соответствии с табл. 9.4, доводят объем раствора в колбе до метки деионизированной водой, закрывают притертой пробкой и перемешивают. Проводят ТФЭ градуировочных растворов азитромицина с использованием вакуумной установки для ТФЭ и картриджей HLB 6CC/500 мг следующим образом. Промывают картридж, пропуская через него 5 см³ 0,1%-го раствора муравьиной кислоты в метаноле, 5 см³ деионизированной воды со скоростью потока не более 0,2 см³/мин (без применения вакуума). Пропускают через картридж 10 см³ градуировочного раствора. Промывают картридж 2 см³ деионизированной воды для удаления слабоудерживаемых компонентов. Элюируют азитромицин с картриджа 5 см³ 0,1%-го раствора муравьиной кислоты в метаноле, собирая элюат в коническую полипропиленовую пробирку вместимостью 15 см³; упаривают элюат при температуре плюс 40 °C в потоке воздуха до 1 см³, к концентрату добавляют 0,1 см³ деионизированной воды. Пробу перемешивают и упаривают до объема 0,2 см³. После упаривания фильтруют пробу через шприцевой фильтр диаметром 4 мм и размером пор 0,2 мкм в хроматографическую виалу со вставкой объемом 250 мм³ и анализируют аликвоту в количестве 10 мм³ в рабочем режиме хроматографа (п. 9.4.2).

9.5.4. Градуировочные растворы смеси амоксициллина, кларитромицина, ципрофлоксацина в деионизированной воде готовят в мерных колбах вместимостью 10 см³. В каждую колбу вносят дозатором разбавленные растворы смеси амоксициллина, кларитромицина, ципрофлоксацина N 2 и N 3 в соответствии с табл. 9.5, доводят объем раствора в колбе до метки деионизированной водой, закрывают притертой пробкой и перемешивают. Проводят ТФЭ амоксициллина, кларитромицина, ципрофлоксацина аналогично п. 9.5.3, используя для экстракции 10 см³ градуировочного раствора. Фильтруют экстракт в хроматографическую виалу через шприцевой фильтр диаметром 4 мм и анализируют аликвоту объемом 10 мм³ в рабочем режиме хроматографа (п. 9.4.2).

9.5.5. Градуировочные растворы смеси оксациллина, бензилпенициллина, ампициллина в деионизированной воде готовят в мерных колбах вместимостью 10 см³. В каждую колбу вносят дозатором разбавленный раствор смеси оксациллина, бензилпенициллина, ампициллина в метаноле N 2 в соответствии с табл. 9.6, доводят объем раствора в колбе до метки деионизированной водой, закрывают притертой пробкой и перемешивают. Фильтруют градуировочный раствор в хроматографическую виалу через шприцевой фильтр диаметром 13 мм с размером пор 0,2 мкм и анализируют аликвоту в количестве 10 мм³ в рабочем режиме хроматографа (п. 9.4.2).

9.5.6. Обнаружение и количественное определение антибиотиков.

9.5.6.1. Идентификацию антибиотиков осуществляют по выделению родительского и дочерних (основного и подтверждающих) ионов с соответствующим отношением массы иона к его заряду (табл. 9.7) и по времени удерживания на хроматограмме при сравнении с соответствующими стандартами. Тип сканирования - MRM.

9.5.6.2. Количественное определение и построение градуировочной характеристики проводят по основному (наиболее интенсивному) дочернему иону (табл. 9.7).

9.5.6.3. Градуировочный коэффициент для определения массовой концентрации антибиотика в анализируемом растворе (экстракте) рассчитывают по формуле (1):

где C_i - массовая концентрация антибиотика в i-м градуировочном растворе, нг/см³;

S_i - среднее значение пяти измерений площади пика основного дочернего иона антибиотика, полученное при анализе i-го градуировочного раствора, условные единицы (далее - усл. ед.);

n - количество градуировочных растворов (n = 5).

Построение градуировочной зависимости, обработка и хранение результатов градуировки выполняются программным обеспечением хромато-масс-спектрометра. Градуировочная зависимость считается приемлемой, если коэффициент корреляции (R²) градуировочных кривых для определения азитромицина, амоксициллина, кларитромицина и ципрофлоксацина составляет не менее 0,9600; эритромицина, оксациллина, бензилпенициллина, ампициллина - не менее 0,9800.

9.5.7. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировочной характеристики выполняют при каждой серии измерений. Образцами для контроля стабильности являются градуировочные растворы, выбранные таким образом, чтобы массовая концентрация антибиотика соответствовала нижней, верхней границам и середине диапазона построения градуировочной характеристики.

Градуировочная характеристика признается стабильной, если расхождение между известным значением массовой концентрации определяемого антибиотика в градуировочном растворе и измеренным значением массовой концентрации в этом растворе не превышает норматива контроля К_гр, условие (2):

где C - заданная массовая концентрация антибиотика в градуировочном растворе нг/см³;

C_m - результат измерения массовой концентрации антибиотика в градуировочном растворе, нг/см³;

К_гр - норматив контроля стабильности градуировочной характеристики в абсолютной форме, рассчитанный по формуле (3):

где - погрешность построения градуировочной характеристики, %.

Значения погрешностей построения градуировочных характеристик антибиотиков приведены в табл. 9.8.

При невыполнении условия стабильности градуировочной характеристики (2) эксперимент повторяют с другим градуировочным раствором. При повторном невыполнении условия стабильности градуировочной характеристики выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики, строят новую градуировочную характеристику.

Градуировочную характеристику строят заново при смене реактивов или хроматографической колонки, а также в случае других существенных изменений условий хроматографического анализа.

10.1. Отбор проб воды проводят в соответствии с методическими документами <8>.

--------------------------------

<8> ГОСТ Р 56237 "Вода питьевая. Отбор проб на станциях водоподготовки и в трубопроводных распределительных системах", утвержденный приказом Росстандарта от 17.11.2014 N 1628-ст; ГОСТ Р 59024 "Вода. Общие требования к отбору проб", утвержденный приказом Росстандарта от 10.09.2020 N 640-ст.

10.2. Транспортируют и хранят пробы в посуде из темного стекла с завинчивающейся крышкой с фторопластовым вкладышем. Требуемый объем пробы должен быть не менее 250 см³.

10.3. При работе с пробами питьевой воды централизованного водоснабжения, воды бассейнов и аквапарков сразу после отбора добавить в пробу 2%-й раствор натрия тиосульфата из расчета 0,25 см³ на 250 см³ воды.

10.4. Допускается хранение отобранных проб воды при температуре плюс 4 - 15 °C не более 2 суток.

11.1. Подготовка проб.

11.1.1. Подготовку проб для определения эритромицина проводят в соответствии с п. 9.5.2, используя для ТФЭ 10 см³ анализируемой воды. Концентрирование пробы воды в 10 раз.

11.1.2. Подготовку проб для определения азитромицина, амоксициллина, кларитромицина и ципрофлоксацина проводят в соответствии с п. 9.5.3, используя для ТФЭ 10 см³ анализируемой воды. Концентрирование пробы воды в 50 раз.

11.1.3. Перед выполнением прямых измерений ампициллина, бензилпенициллина и оксациллина пробу воды фильтруют через шприцевой фильтр из полиамида с диаметром пор 0,2 мкм в хроматографическую виалу.

11.2. Порядок выполнения измерений.

11.2.1. Перед анализом антибиотиков в исследуемых пробах воды проводят анализ холостого образца, в качестве которого используют деионизированную воду, прошедшую пробоподготовку в соответствии с п. 11.1.1 - 11.1.3 в зависимости от анализируемого антибиотика.

11.2.2. Для измерения массовых концентраций антибиотиков в анализируемом растворе (мг/дм³) вводят в хроматограф 10 мм³ подготовленной пробы.

11.2.3. Анализируют две параллельные пробы в рабочем режиме хромато-масс-спектрометрической системы (п. 9.4.2).

12.1. Расчет массовых концентраций эритромицина, азитромицина, амоксициллина, кларитромицина, ципрофлоксацина в воде проводят с использованием программного обеспечения прибора в автоматическом режиме или вычисляют по формуле (4):

где C - массовая концентрация антибиотика в анализируемой пробе, мг/дм³;

S_i - площадь пика основного дочернего иона антибиотика на хроматограмме в анализируемой пробе, усл. ед.;

K - градуировочный коэффициент для определения массовой концентрации соответствующего антибиотика в экстракте, нг/(см³·усл. ед.);

k - коэффициент концентрирования (k = 10 для расчета массовых концентраций эритромицина в воде; k = 50 для расчета массовых концентраций азитромицина, амоксициллина, кларитромицина, ципрофлоксацина в воде);

V₁ - объем экстракта, см³ (V₁ = 1 см³ для эритромицина; V₁ = 0,2 см³ для азитромицина, амоксициллина, кларитромицина, ципрофлоксацина);

V₂ - объем анализируемой пробы, мм³ (V₂ = 10 мм³).

12.2. Расчет массовых концентраций ампициллина, бензилпенициллина и оксациллина в воде проводят с использованием программного обеспечения прибора в автоматическом режиме или вычисляют по формуле (5):

где C - массовая концентрация антибиотика в анализируемой пробе, мг/дм³;

S_i - площадь пика основного дочернего иона антибиотика на хроматограмме в анализируемой пробе, усл. ед.;

K - градуировочный коэффициент для определения массовой концентрации соответствующего антибиотика в пробе воды, нг/(см³·усл. ед.).

12.3. За результат измерения массовой концентрации антибиотиков в воде принимают среднее арифметическое значение двух результатов параллельных измерений C₁, C₂, для которых выполняется условие (6):

где r - предел повторяемости, %.

Относительные значения предела повторяемости приведены в табл. 12.1.

При невыполнении условия (6) получают еще два результата параллельных измерений.

Если максимальное абсолютное расхождение между наибольшим и наименьшим результатами измерений не превышает критического диапазона CR_0,95(4), %, приведенного в табл. 12.1 для P = 0,95 и n = 4, и выполняется условие (7):

то в этом случае все четыре результата признают приемлемыми и за окончательный результат принимают среднее арифметическое четырех измерений.

При невыполнении условия (7) в качестве окончательного результата измерений принимают медиану четырех результатов измерений, полученных в условиях повторяемости (параллельных определений). Дополнительно выявляют и устраняют причины, приводящие к невыполнению условий (6) и (7).

13.1. Результат измерений представляют в виде выражения (8):

где - результат измерений массовой концентрации антибиотика в воде, мг/дм³;

- характеристика погрешности при P = 0,95, рассчитанная по формуле (9):

где - относительное значение характеристики погрешности, %. Значение приведено в табл. 3.1.

Допустимо результат измерений в документах, выдаваемых лабораторией, представлять в виде выражения (9):

где - значение характеристики погрешности результатов измерений, установленное при внедрении методики в лаборатории и обеспечиваемое контролем стабильности результатов измерений, мг/дм³.

13.2. Численное значение C должно оканчиваться цифрой того же разряда, что и значение .

14.1. Контроль точности результатов измерений организуют и проводят путем проведения проверки приемлемости результатов измерений, получаемых в условиях повторяемости (п. 12.3), воспроизводимости (п. 14.2), оперативного контроля процедуры измерений (п. 14.3), контроля стабильности градуировочной характеристики (п. 9.5.7) и контроля стабильности результатов измерений в соответствии с методическими документами <9>.

--------------------------------

<9> ГОСТ Р ИСО 5725-(1 - 6).

14.2. Проверка приемлемости результатов измерений, получаемых в условиях воспроизводимости.

Образцами для проверки приемлемости результатов измерений, получаемых в условиях воспроизводимости, являются образцы деионизированной воды с внесенными в них добавками растворов антибиотиков, подготовленных в соответствии с п. 9.5.2 - 9.5.5.

Проверку приемлемости результатов измерений, получаемых в условиях воспроизводимости, проводят по результатам измерений массовых концентраций антибиотиков в деионизированной воде с одинаковым содержанием измеряемых соединений.

Результаты измерений признают приемлемыми при выполнении условия (11):

где C₁ и C₂ - результаты измерений массовых концентраций антибиотиков в воде, полученные в условиях воспроизводимости, мг/дм³;

R - предел воспроизводимости (относительное значение), %. Значения предела воспроизводимости приведены в табл. 12.1.

Если условие (10) не выполняется, процедуру повторяют. При повторном превышении предела воспроизводимости выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

14.3. Алгоритм оперативного контроля процедуры измерений с использованием метода добавок.

Образцами для проверки приемлемости результатов измерений, получаемых в условиях оперативного контроля процедуры измерений с использованием метода добавок, являются образцы деионизированной воды с внесенными в них добавками растворов антибиотиков, подготовленных в соответствии с п. 9.5.2 - 9.5.5.

Оперативный контроль процедуры измерений проводят путем сравнения результата отдельно взятой контрольной процедуры К_к с нормативом контроля К.

Результат контрольной процедуры К_к рассчитывают по формуле (12):

- результат измерений массовой концентрации антибиотика в пробе с известной добавкой - среднее арифметическое двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, расхождение между которыми удовлетворяет условию (6), мг/дм³;

- результат измерений массовой концентрации антибиотика в исходной пробе - среднее арифметическое двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, расхождение между которыми удовлетворяет условию (6), мг/дм³;

C_д - величина введенной добавки, мг/дм³.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле (13):

где , - значения характеристики погрешности результатов измерений, установленные в лаборатории при реализации методики, соответствующие массовой концентрации антибиотика в пробе с известной добавкой и в исходной пробе соответственно, мг/дм³.

Примечание: допустимо характеристику погрешности результатов измерений при внедрении методики в лаборатории устанавливать на основе выражений (14) и (15):

с последующим уточнением по мере накопления информации в процессе контроля стабильности результатов измерений.

Процедуру измерений признают удовлетворительной при выполнении условия (16):

При невыполнении условия (16) контрольную процедуру повторяют. При повторном невыполнении условия (16) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

14.4. Периодичность контроля приводят в документах лаборатории, устанавливающих порядок и содержание работ по организации методов контроля стабильности результатов измерений в пределах лаборатории.

1. Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. СанПиН 1.2.3685-21 "Гигиенические нормативы и требования к обеспечению безопасности и (или) безвредности для человека факторов среды обитания".

3. Правила промышленной безопасности при использовании оборудования, работающего под избыточным давлением.

4. ПНД Ф 12.13.1-03 "Методические рекомендации. Техника безопасности при работе в аналитических лабораториях (общие положения)".

5. РМГ 61-2010 "Показатели точности, правильности, прецизионности методик количественного химического анализа. Методы оценки".

6. ГОСТ 12.1.004 "Пожарная безопасность. Общие требования".

7. ГОСТ 12.1.005 "Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны".

8. ГОСТ 12.1.007 "Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".

9. ГОСТ 12.1.019 "Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты".

10. ГОСТ 12.4.009 "Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание".

11. ГОСТ 1770 "Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Технические условия".

12. ГОСТ 2768 "Ацетон технический. Технические условия".

13. ГОСТ 8981 "Эфиры этиловый и нормальный бутиловый уксусной кислоты технические. Технические условия".

14. ГОСТ 27068 "Натрий серноватистокислый (натрия тиосульфат) 5-водный. Технические условия".

15. ГОСТ 28311 "Дозаторы медицинские лабораторные. Общие технические требования и методы испытаний".

16. ГОСТ Р ИСО 5725-1 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения".

17. ГОСТ Р ИСО 5725-2 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений".

18. ГОСТ Р ИСО 5725-3 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 3. Промежуточные показатели прецизионности стандартного метода измерений".

19. ГОСТ Р ИСО 5725-4 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 4. Основные методы определения правильности стандартного метода измерений".

20. ГОСТ Р ИСО 5725-5 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 5. Альтернативные методы определения прецизионности стандартного метода измерений".

21. ГОСТ Р ИСО 5725-6 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике".

22. ГОСТ Р 52501 "Вода для лабораторного анализа. Технические условия".

23. ГОСТ Р 53228 "Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания".

24. ГОСТ Р 56237 "Вода питьевая. Отбор проб на станциях водоподготовки и в трубопроводных распределительных системах".

25. ГОСТ Р 59024 "Вода. Общие требования к отбору проб".

26. ГОСТ ISO 7886-1 "Шприцы инъекционные однократного применения стерильные. Часть 1. Шприцы для ручного использования".