"МУК 4.1.3869-23. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методика измерения массовых концентраций фенола и его производных в крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором РФ 23.06.2023)

1. Разработаны Федеральным бюджетным учреждением науки "Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Уланова Т.С., Зайцева Н.В., Карнажицкая Т.Д., Старчикова М.О.).

2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 23 июня 2023 г.

3. Введены впервые.

1.1 Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для измерения массовых концентраций фенола и его производных (резорцина, пирокатехина) в крови в диапазоне от 0,005 мг/дм³ до 0,5 мг/дм³.

1.2. МУК носят рекомендательный характер.

2.1. Структурные формулы фенола, резорцина и пирокатехина представлены на рис. 1.

2.1.1. Физико-химические свойства фенола (таблица 1).

Фенол - бесцветные игольчатые кристаллы со специфическим резким запахом, хорошо растворим в полярных и неполярных растворителях. На воздухе фенол быстро окисляется и окрашивается в розовый цвет. Фенол используется в производстве бисфенола A, фенолформальдегидных смол, циклогексанола, антисептиков, пестицидов, антиоксидантов, косметических средств.

2.1.2. Физико-химические свойства резорцина (таблица 2).

Резорцин - двухатомный фенол, бесцветные кристаллы со специфическим запахом, обладает свойствами фенолов. Резорцин применяется в производстве красителей, полимеров, в медицине как обеззараживающее средство.

2.1.3. Физико-химические свойства пирокатехина (таблица 3).

Пирокатехин - белые или бесцветные кристаллы с фенольным запахом, хорошо растворим в диэтиловом эфире, ацетоне, этаноле, пиридине. Является сильным восстановителем, окисляется на воздухе и на свету. Применяют в фотографии как проявитель, в производстве красителей, лекарственных веществ, ванилина.

2.2. Токсикологические свойства фенола, резорцина, пирокатехина.

Фенол. Вдыхание паров и пыли фенола вызывает нарушение функций нервной системы. Пыль, пары и раствор фенола раздражают слизистые оболочки глаз, дыхательных путей, кожу, вызывая химические ожоги.

Резорцин. Вызывает раздражение органов дыхания, кожи.

Пирокатехин. Оказывает общетоксическое действие, вызывает раздражение кожи, повреждение глаз, проявляет мутагенные и канцерогенные свойства.

3.1. При соблюдении всех регламентированных условий и проведении анализа в точном соответствии с данной методикой значения погрешности результатов измерений и ее составляющих не превышают значений, приведенных в таблице 4.

Границы относительной погрешности при доверительной вероятности P = 0,95 соответствуют относительной расширенной неопределенности измерений при коэффициенте охвата k = 2.

Значения показателя точности используют при:

- оформлении результатов измерений, выдаваемых лабораторией;

- оценке качества проведения измерений в лаборатории;

- оценке возможности использования результатов измерений при реализации методики измерений в конкретной лаборатории.

4.1. Измерение массовых концентраций фенола, резорцина и пирокатехина в крови проводят методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуориметрическим детектированием в обращенно-фазовом режиме хроматографирования. Извлечение фенола, резорцина и пирокатехина из подкисленной крови проводят методом жидкостной экстракции смесью ацетонитрила и этилацетата в присутствии высаливателей с очисткой экстракта сорбентом. Степень экстракции фенола 89%, резорцина 87%, пирокатехина 52%. Количественное определение в экстракте проводят методом абсолютной градуировки.

Нижний предел измерения фенола в анализируемом объеме пробы (10 мкл) составляет 0,05 нг, резорцина 0,05 нг, пирокатехина 0,05 нг.

Определению фенола, резорцина и пирокатехина не мешают о,м,п-крезолы, бензойная кислота, гидрохинон.

5.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы, приведенные в таблице 5.

--------------------------------

<1> Например, Экстракционный набор Vetex Q Tox.

6.1. При выполнении измерений соблюдают меры противопожарной безопасности в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.004, имеются средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009 и соблюдаются правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019.

6.2. При работе в лаборатории необходимо соблюдать правила техники безопасности <2>.

--------------------------------

<2> ПНД Ф 12.13.1-03 "Методические рекомендации. Техника безопасности при работе в аналитических лабораториях (общие положения)".

6.3. При работе с химическими реактивами соблюдают требования безопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.007 и ГОСТ 12.1.005. Помещение должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией.

6.4. При работе с биологическими средами соблюдают санитарно-эпидемиологические правила <3>.

--------------------------------

<3> СанПиН 3.3686-21 "Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней", утвержденные постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 N 4 (зарегистрировано Минюстом России 15.02.2021 N 62500).

6.5. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать гигиенические нормативы <4>.

--------------------------------

<4> СанПиН 1.2.3685-21 "Гигиенические нормативы и требования к обеспечению безопасности и (или) безвредности для человека факторов среды обитания", утвержденные постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 N 2 (зарегистрировано Минюстом России 29.01.2021 N 62296).

6.6. При выполнении измерений на жидкостном хроматографе соблюдают меры безопасности, указанные в руководстве по правилам эксплуатации прибора.

6.7. Утилизацию растворов после выполнения измерений проводят в соответствии с инструкцией по обращению с химическими отходами, действующей на предприятии.

7.1. К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются лица, имеющие квалификацию не ниже инженера-химика с опытом работы на жидкостном хроматографе, освоившие метод измерений и получившие удовлетворительные результаты оперативного контроля процедуры измерений.

8.1. При выполнении приготовления растворов и подготовке проб в лаборатории соблюдают следующие условия:

- температура воздуха плюс (20 +/- 5) °C;

- атмосферное давление от 84,0 до 106,7 кПа (630 - 800 мм рт. ст.);

- влажность воздуха при плюс 25 °C от 30 до 80%.

8.2. Выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендуемых технической документацией прибора.

9.1. Подготовка посуды.

Используемую посуду вымыть моющим раствором, промыть проточной водопроводной водой, ополоснуть дистиллированной водой и высушить в сушильном шкафу при температуре плюс 105 °C.

9.2. Приготовление растворов.

9.2.1. Подвижная фаза для элюирования.

Состав подвижной фазы - смесь ацетонитрила и 0,1%-го водного раствора уксусной кислоты в соотношении 35:65 (объемные доли) задают на двух каналах насоса жидкостного хроматографа.

9.2.2. Исходный раствор пирокатехина с концентрацией 1 г/дм³ для градуировки.

Взвешивают (0,100 +/- 0,001) г пирокатехина, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³, доводят дистиллированной водой до метки, закрывают пробкой и перемешивают. Массовая концентрация пирокатехина в исходном растворе составляет 1 г/дм³. Используют свежеприготовленный раствор.

9.2.3. Исходный раствор резорцина с концентрацией 1 г/дм³ для градуировки.

Взвешивают (0,100 +/- 0,001) г резорцина, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³, доводят дистиллированной водой до метки, закрывают пробкой и перемешивают. Массовая концентрация резорцина в исходном растворе составляет 1 г/дм³. Используют свежеприготовленный раствор.

9.2.4. Рабочий раствор фенола, резорцина и пирокатехина N 1 с концентрацией 2 мг/дм³ для градуировки.

В мерную колбу вместимостью 100 см³ переносят с помощью пипетки или дозатора 0,2 см³ стандартного образца фенола в этаноле массовой концентрацией 1 г/дм³, 0,2 см³ исходного раствора резорцина с концентрацией 1 г/дм³, 0,2 см³ исходного раствора пирокатехина с концентрацией 1 г/дм³, доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают. Используют свежеприготовленный раствор.

9.2.5. Рабочий раствор фенола, резорцина и пирокатехина N 2 с концентрацией 0,05 мг/дм³ для градуировки.

В мерную колбу вместимостью 100 см³ переносят с помощью пипетки или дозатора 2,5 см³ рабочего раствора N 1 с концентрацией 2 мг/дм³, доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают. Используют свежеприготовленный раствор.

9.2.6. Приготовление 0,1%-го водного раствора уксусной кислоты.

В мерную колбу вместимостью 500 см³ приливают 100 см³ дистиллированной воды и 0,5 см³ уксусной кислоты (плотность 1,05 г/см³), перемешивают, доводят дистиллированной водой до метки, закрывают пробкой и перемешивают. Срок хранения раствора не более 3 дней при комнатной температуре.

9.2.7. Приготовление 0,37%-го водного раствора ортофосфорной кислоты.

В мерную колбу вместимостью 50 см³ приливают 10 см³ дистиллированной воды и 0,1 см³ ортофосфорной кислоты (плотность 1,87 г/см³), перемешивают, доводят дистиллированной водой до метки, закрывают пробкой и перемешивают. Срок хранения раствора не более 3 дней при комнатной температуре.

9.3. Подготовка хроматографической колонки.

Хроматографическую колонку устанавливают в хроматограф и подают смесь ацетонитрила и 0,1%-го водного раствора уксусной кислоты в соотношении 35:65 (объемные доли) со скоростью 0,8 см³/мин до установления равновесия колонки, которое определяется по стабильности нулевой детектора. Проводят холостую разгонку в режиме хроматографа (п. 9.4.3).

9.4. Установление градуировочной характеристики.

9.4.1. Градуировочную характеристику для определения фенола, пирокатехина, резорцина в крови устанавливают по результатам измерений 3-х серий из 6 градуировочных растворов с различными массовыми концентрациями определяемых фенолов в каждой серии.

9.4.2. Градуировочные растворы готовят в мерных колбах вместимостью 25 см³. Для этого в каждую колбу вносят исходный раствор для градуировки в соответствии с таблицей 6, доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают содержимое колбы. Используют свежеприготовленные градуировочные растворы. Аликвотную часть (10 мм³) анализируют на жидкостном хроматографе в рабочем режиме работы хроматографа (п. 9.4.3).

Градуировочный коэффициент рассчитывают по формуле:

где C_i - массовые концентрации фенола, пирокатехина и резорцина в i-ом градуировочном растворе, мг/дм³;

S_i - средние значения трех измерений площадей пиков фенола, пирокатехина и резорцина, полученных при анализе i-го градуировочного раствора, усл. ед.;

n - количество градуировочных смесей (n = 6).

Градуировку проводят при смене реактивов или разделительной колонки. Один раз в год градуировочную характеристику устанавливают заново.

9.4.3. Режим работы хроматографа:

- колонка с обращенной фазой <5> C18, внутренний диаметр 4,6 мм, длина 150 мм, размер частиц 5 мкм;

- элюент: смесь ацетонитрила и 0,1% водного раствора уксусной кислоты в соотношении 35:65 (объемные доли);

--------------------------------

<5> Например, колонка с обращенной фазой Eclipse XDB C18.

9.4.4. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят 1 раз в квартал в анализируемой серии измерений. Образцами для контроля стабильности являются градуировочные растворы, выбранные таким образом, чтобы массовые концентрации фенола, пирокатехина и резорцина соответствовали нижней и верхней границам и середине диапазона построения градуировочных характеристик. Градуировка признается стабильной при выполнении условия:

где C - заданные массовые концентрации фенола, пирокатехина и резорцина в градуировочном растворе, мг/дм³;

X - результат измерения массовых концентраций фенола, пирокатехина и резорцина в образце для градуировки, мг/дм³.

При невыполнении условия (2) эксперимент повторяют с другим градуировочным раствором. При повторном невыполнении условия стабильности градуировочной характеристики выясняют и устраняют причины нестабильности, строят новую градуировочную характеристику.

10.1. Отбор проб.

Отбор проб крови в количестве 2 см³ производят из вены в вакуумные пробирки с внесенным антикоагулянтом (гепарин) или в химически чистые, обеззараженные полипропиленовые пробирки вместимостью 15 см³ с добавлением антикоагулянта (гепарин).

10.2. Подготовка проб.

В полипропиленовую пробирку вместимостью 15 см³ помещают 1 см³ крови, вносят 50 мм³ 0,37% раствора ортофосфорной кислоты, перемешивают, добавляют 0,5 см³ этилацетата, затем 0,5 см³ ацетонитрила, перемешивают 1 мин, добавляют 0,25 г смеси солей для экстракции, перемешивают 1 мин и центрифугируют 10 мин со скоростью 5000 об/мин при температуре плюс 20 °C. Отбирают верхний слой экстракта, к нему добавляют 0,1 г сорбента, перемешивают 1 мин и центрифугируют 10 мин в тех же условиях. Очищенный экстракт фильтруют через тефлоновый фильтр с размером пор 0,2 мкм.

10.3. Порядок выполнения измерений.

Для измерения массовых концентраций фенола, пирокатехина и резорцина в крови (мг/дм³) вводят в хроматограф 10 мм³ экстракта, полученного по п. 10.2. Анализируют две параллельные пробы в рабочем режиме хроматографа (п. 9.4.3).

10.4. Идентификацию фенола, пирокатехина и резорцина на хроматограмме проводят путем сравнения времен удерживания хроматографических пиков, полученных при анализе пробы и рабочего раствора с концентрацией 0,05 мг/дм³ для идентификации, приготовленного в соответствии с п. 9.2.5.

11.1. Массовые концентрации фенола, пирокатехина и резорцина в крови рассчитывают по формуле:

где C - массовая концентрация определяемого соединения в крови, мг/дм³;

- среднее значение двух параллельных измерений площади хроматографического пика определяемого соединения в экстракте, усл. ед.;

K - градуировочный коэффициент для определения массовой концентрации определяемого соединения в экстракте;

K_Э - коэффициент, учитывающий степень экстракции определяемого соединения, рассчитанный по формуле:

где А - 100% степень экстракции;

Б - рекомендуемая степень экстракции для определяемого соединения (п. 4), которая устанавливается в результате расчета отношения между хроматографическими пиками, полученными при измерении площади (высоты) пика для аттестованного значения образца до и после экстракции, проводимой в соответствии с п. 10.1 - 10.2;

V₁ - объем экстракта, см³ (V = 0,75 см³);

V - объем крови, взятой на анализ, см³ (V = 1 см³).

11.2. За результат измерения принимают среднее арифметическое значение двух параллельных определений C₁, C₂, для которых выполняется условие:

где r - предел повторяемости (относительное значение), %.

Значения предела повторяемости приведены в таблице 4.

При невыполнении условия (4) получают дополнительно еще два результата параллельных определений.

Если максимальное абсолютное расхождение между наибольшим и наименьшим результатами измерений не превышает критического диапазона, относительное значение которого приведено в таблице 4 для P = 0,95 и n = 4:

то в этом случае все четыре результата признают приемлемыми и за окончательный результат принимают среднее арифметическое четырех измерений, полученных в условиях повторяемости.

При невыполнении условия (5) в качестве окончательного результата измерений принимают медиану четырех результатов измерений, полученных в условиях повторяемости (параллельных определений). Дополнительно выявляют и устраняют причины, приводящие к невыполнению условий (4) и (5).

12.1. Результат измерений представляют в виде:

где - результат измерений массовых концентраций фенола, пирокатехина и резорцина в крови, мг/дм³;

- характеристика погрешности, мг/дм³, при P = 0,95, рассчитанная по формуле:

где - относительное значение характеристики погрешности, %.

Значение приведено в таблице 1.

U_р - расширенная неопределенность при k = 2, мг/дм³, вычисляемая по формуле:

где U_(отн)р - расширенная неопределенность (в относительных единицах) при k = 2 (таблица 1), %.

Допустимо результат измерений в документах, выдаваемых лабораторией, при условии: или U_л < U_р представлять в виде:

где - значение характеристики погрешности результатов измерений, установленное при внедрении методики в лаборатории и обеспечиваемое контролем стабильности результатов измерений, мг/дм³;

+/- U_л - значение расширенной неопределенности при k = 2, установленное при внедрении методики в лаборатории, мг/дм³.

12.2. Численное значение C оканчивается цифрой того же разряда, что и значение погрешности (неопределенности) .

13.1. Контроль точности результатов измерений организуют и проводят путем проведения проверки приемлемости результатов измерений, получаемых в условиях повторяемости, внутрилабораторной (промежуточной) прецизионности, оперативного контроля процедуры измерений, контроля стабильности градуировочной характеристики (п. 9.4.5) и контроля стабильности результатов измерений в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-6.

13.2. Проверка приемлемости результатов измерений, получаемых в условиях внутрилабораторной прецизионности.

Образцами для проверки приемлемости результатов измерений, получаемых в условиях внутрилабораторной прецизионности, являются образцы крови с внесенными в них добавками растворов фенола, резорцина и пирокатехина, подготовленных в соответствии с п. 9.2.4 - 9.2.5.

Проверку приемлемости результатов измерений, получаемых в условиях внутрилабораторной прецизионности (в пределах одной лаборатории, разными операторами, в разное время), проводят по результатам измерений массовых концентраций фенола, пирокатехина и резорцина в крови с одинаковым содержанием соединений. Результаты измерений признают приемлемыми при выполнении условия:

где C₁ и C₂ - результаты измерений массовых концентраций фенола, пирокатехина и резорцина в крови, полученные в условиях воспроизводимости, мг/дм³;

R_л - предел внутрилабораторной прецизионности (относительное значение), %. Значения предела внутрилабораторной прецизионности приведены в таблице 4.

Если условие (9) не выполняется, процедуру повторяют. При повторном превышении предела внутрилабораторной прецизионности выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Алгоритм оперативного контроля процедуры измерений с использованием метода добавок.

Образцами для контроля процедуры измерений являются образцы крови с внесенными в них добавками аттестованного раствора фенола, пирокатехина и резорцина, приготовленного в соответствии с п. 9.4.2.

Оперативный контроль процедуры измерений проводят путем сравнения результата отдельно взятой контрольной процедуры К_к с нормативом контроля К.

Результат контрольной процедуры К_к рассчитывают по формуле:

где - результат измерений массовой концентрации фенола, пирокатехина и резорцина в пробе с известной добавкой - среднее арифметическое двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, расхождение между которыми удовлетворяет условию (4), мг/дм³;

- результат измерений массовой концентрации фенола, пирокатехина и резорцина в исходной пробе - среднее арифметическое двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, расхождение между которыми удовлетворяет условию (4), мг/дм³;

C_д - величина введенной добавки, мг/дм³.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

где , - значения характеристики погрешности результатов измерений, установленные в лаборатории при реализации методики, соответствующие массовой концентрации фенола, пирокатехина и резорцина в пробе с известной добавкой и в исходной пробе соответственно, мг/дм³.

с последующим уточнением по мере накопления информации в процессе контроля стабильности результатов измерений.

Процедуру измерений признают удовлетворительной при выполнении условия:

При невыполнении условия (15) контрольную процедуру повторяют. При повторном невыполнении условия (15) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.4. Оперативный контроль процедуры измерений, а также реализуемые процедуры контроля стабильности результатов выполняемых измерений приводят в документах лаборатории, устанавливающих порядок и содержание работ по организации методов контроля стабильности результатов измерений в пределах лаборатории.

1. Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. СанПиН 1.2.3685-21 "Гигиенические нормативы и требования к обеспечению безопасности и (или) безвредности для человека факторов среды обитания".

3. ГОСТ 12.1.004 "ССБТ. Пожарная безопасность. Общие требования".

4. ГОСТ 12.1.005 "ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны".

5. ГОСТ 12.1.007 "ССБТ. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".

6. ГОСТ 12.4.009 "ССБТ. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание".

7. ГОСТ 12.1.019 "ССБТ. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты".

8. ГОСТ 61 "Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия".

9. ГОСТ 1770 "Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Технические условия".

10. ГОСТ 6552 "Реактивы. Кислота ортофосфорная. Технические условия".

11. ГОСТ 28311 "Дозаторы медицинские лабораторные. Общие технические требования и методы испытаний".

12. ГОСТ 29227 "Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования".

13. ГОСТ 58144 "Вода дистиллированная. Технические условия".

14. ГОСТ Р 52501 "Вода для лабораторного анализа. Технические условия".

15. ГОСТ Р 53228 "Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания".

16. ГОСТ Р ИСО 5725-6 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике".

17. ГОСТ Р ИСО 7886-1 "Шприцы инъекционные однократного применения стерильные. Часть 1. Шприцы для ручного использования".

18. ТУ 6-09-14-2167 "Ацетонитрил. Технические условия".

19. ТУ 92-00243346-01 "Шкаф сушильный ШС-80".