"Наставление по применению набора антигенов и сывороток для диагностики гриппа лошадей"
(утв. Минсельхозом России 27.02.2004)

1.1. Набор антигенов и сывороток предназначен для диагностики гриппа лошадей путем идентификации выделенных штаммов вируса и исследования сывороток крови лошадей, больных и переболевших этой болезнью.

1.2. Диагностический набор содержит:

- сухие инактивированные антигены 1 (H₇N₇) и 2 (H₃N₈) серотипов вируса гриппа лошадей - по 2 флакона (ампулы) каждого вида;

- сухие гипериммунные сыворотки к 1 (H₇N₇) и 2 (H₃N₈) серотипам вируса гриппа лошадей - по 2 флакона (ампулы) каждого вида;

- сыворотка нормальная - 1 флакон (ампула).

1.3. Специфические антигены представляют собой сухую аморфную массу беловато-серого цвета; специфические сыворотки - розовато-кремового цвета.

1.4. Антигены и сыворотки расфасовывают по 1,0 см³ во флаконы (ампулы). Флаконы (ампулы) укладывают в картонные или полистироловые коробки, обеспечивающие неподвижность и целостность флаконов (ампул).

Каждая коробка представляет собой набор антигенов и сывороток для диагностики гриппа лошадей. В каждую коробку вкладывают наставление по применению.

1.5. На флаконы (ампулы) наклеивают или несмываемой краской по стеклу наносят этикетки с указанием:

- для антигенов - названия антигена, объема, титра в РГА, даты изготовления и номера серии;

- для сывороток - наименования гипериммунной сыворотки к подтипу вируса, на который она получена, титра в РТГА, объема фасовки, даты изготовления и номера серии.

На коробках с набором указывают наименование предприятия-изготовителя и его товарный знак; полное название препарата; количество флаконов (ампул) каждого компонента, входящего в препарат; название антигенов, сывороток и их серотипов; дату изготовления; срок годности; номер серии; номер контроля; условия хранения и обозначение ТУ.

1.6. Набор хранят в сухом темном помещении при температуре от 2 до 8 °C. Допускается хранение при любой минусовой температуре.

1.7. Срок годности набора - 3 года с даты изготовления.

Сущность метода основана на способности сывороток крови лошадей, содержащих специфические антитела, тормозить гемагглютинирующую активность антигена (вируса) гриппа лошадей соответствующего серотипа.

3.1. Антигены в ампулах (флаконах) разводят физиологическим раствором (pH 7,2...7,4) до первоначального объема, т.е. добавляют к содержимому по 1,0 см³ физиологического раствора. Сухая масса должна полностью раствориться при встряхивании в течение 3...5 мин и представлять собой гомогенную взвесь желтоватого цвета.

3.2. Сыворотки в ампулах (флаконах) разводят дистиллированной водой в соотношении 1:10. Сухая сыворотка должна растворяться при встряхивании в течение 3...5 мин и представлять собой прозрачную жидкость розовато-кремового цвета. Разведенную сыворотку прогревают на водяной бане при температуре 56 °C в течение 5 мин. Надосадочную часть сыворотки собирают для постановки РТГА. Разведенные антигены и сыворотки хранят при температуре от 2 до 8 °C не более 24 ч.

3.3. Приготовление 1%-ной суспензии эритроцитов петуха.

Для получения 1%-ной суспензии эритроцитов используют петухов старше 6 мес.

Взятие крови у петухов производят из подкрыльцовой вены. Набирают необходимое количество крови в стеклянную пробирку с 2...3%-ным раствором лимоннокислого натрия на физиологическом растворе (pH от 7,2 до 7,4) в соотношении 2:1.

Полученную кровь трижды отмывают физиологическим раствором, осаждая эритроциты на центрифуге в течение 10 мин при 1500 об/мин.

Из осадка эритроцитов готовят 1%-ную суспензию, которую хранят при температуре от 2 до 8 °C не более 4 сут.

3.4. Идентификация выделенного из патологического материала больных лошадей вируса в реакции торможения гемагглютинации (РТГА).

3.4.1. С целью выделения вируса используют носовые смывы от больных лошадей в первые 2...3 дня от начала заболевания. Для идентификации вируса в РТГА используют вируссодержащий материал с титром гемагглютинации не ниже 1:8.

3.4.2. Постановка реакции гемагглютинации.

Реакция гемагглютинации является подготовительным этапом в постановке реакции торможения гемагглютинации.

Вначале готовят двукратные разведения вируссодержащего материала (или антигена из набора при исследовании сыворотки крови лошадей) от 1:2 до 1:1024. Для этого в ряд лунок вносят физиологический раствор в объеме 0,2 см³, 0,025 см³ для микрометода. Затем в первую лунку вносят по 0,2 см³ (0,025 см³) вируса, трехкратно пипетируют и переносят 0,2 см³ (0,025 см³) смеси во вторую и так далее до требуемого разведения. Из последней лунки 0,2 см³ (0,025 см³) смеси удаляют в дезинфицирующий раствор.

В каждую лунку добавляют по 0,2 см³ (0,025 см³) 1%-ной суспензии эритроцитов. Необходимо ставить контроль на спонтанную агглютинацию эритроцитов (к 0,2 см³ (0,025 см³) физиологического раствора добавляют 0,2 см³ (0,025 см³) 1%-ной суспензии эритроцитов).

Планшеты с лунками встряхивают и оставляют при температуре 18...20 °C, учет реакции проводят после полного оседания эритроцитов в контроле.

3.4.3. Учет реакции.

Положительная реакция гемагглютинации оценивается по форме осадка эритроцитов, которые оседают, образуя "зонтик". В случае отрицательной реакции, так же как и в контроле, эритроциты оседают, образуя на дне лунки "пуговку".

Титром вируса считается его наибольшее разведение, при котором наблюдается агглютинация эритроцитов.

3.4.4. Постановка реакции торможения гемагглютинации.

После того как определен титр гемагглютинации вновь выделенного вируса (или антигена из набора), переходят к постановке реакции торможения гемагглютинации. Последняя основана на способности специфических антител тормозить гемагглютинирующую активность вируса.

3.4.4.1. Для постановки реакции торможения гемагглютинации готовят рабочую дозу вновь выделенного вируса. С этой целью выделенный вирус разводят физиологическим раствором во столько раз, сколько получают от деления титра, полученного в РГА, на 4. Например, рабочее разведение будет 128 : 4 = 32, т.е. в 0,2 см³ (0,025 см³) разведенного 1:32 вируса будет содержаться 4 АЕ. Для его приготовления необходимо взять 31 см³ физиологического раствора и добавить 1 см³ исходного вируса. Перед постановкой основного опыта проверяют правильность выбора 4 АЕ. Для этого используют 5 лунок, в первую и вторую наливают 4 АЕ по 0,2 см³ (0,025 см³), т.е. выбранное разведение вируса, после чего во вторую, третью, четвертую, пятую лунки наливают по 0,2 см³ (0,025 см³) физиологического раствора. После пипетирования из второй лунки переносят 0,2 см³ (0,025 см³) в третью, из третьей после смешивания - 0,2 см³ (0,025 см³) переносят в четвертую, а затем в пятую, из пятой лунки удаляют 0,2 см³ (0,025 см³) смеси в дезинфицирующий раствор. Таким образом, во 2-й лунке остается 2 АЕ, в 3-й - 1 АЕ, в 4-й - 0,5 АЕ, в 5-й - 0,25 АЕ. После этого в каждую лунку добавляют по 0,2 см³ (0,025 см³) 1%-ной суспензии эритроцитов, планшеты легко встряхивают и оставляют на 30 мин при температуре 18...20 °C. При правильном выборе рабочей дозы (4 АЕ) в 1-й, 2-й, 3-й лунках должна быть полная агглютинация эритроцитов (зонтик); в 4-й лунке агглютинация может быть частичной или отсутствовать, а в 5-й лунке агглютинация должна отсутствовать.

3.4.4.2. В ряд лунок, начиная со второй, наливают по 0,2 см³ (0,025 см³) физиологического раствора. Затем в первую и вторую лунки добавляют по 0,2 см³ (0,025 см³) приготовленной (из набора) сыворотки в разведении 1:10. Во второй лунке пипетируют и переносят 0,2 см³ (0,025 см³) смеси в третью и так далее до полного разведения 1:2560, из последней лунки удаляют 0,2 см³ (0,025 см³) в дезинфицирующий раствор. После этого во все лунки вносят по 0,2 см³ (0,025 см³) рабочего разведения (4 АЕ) испытуемого вируса, планшеты с лунками встряхивают и оставляют при температуре 18...20 °C. После тридцатиминутного контакта сыворотки с вирусом в каждую лунку добавляют по 0,4 см³ (0,1 см³) 1%-ной суспензии эритроцитов.

Для точного учета реакции торможения гемагглютинации ставят контроль:

- контроль сыворотки для исключения присутствия изоагглютининов к эритроцитам (0,2 см³ (0,025 см³) сыворотки в разведении 1:10, 0,2 см³ (0,025 см³) физиологического раствора и 0,4 см³ (0,1 см³) 1%-ной суспензии эритроцитов);

- контроль избранной дозы вируса (0,2 см³ рабочей дозы вируса (4 АЕ) и 0,2 см³ 1%-ной суспензии эритроцитов);

- контроль стандартных диагностикумов (антигенов 0,2 см³ + 0,2 см³ (0,025 см³ + 0,025 см³) гомологичных сывороток + 0,4 см³ (0,1 см³) 1%-ной суспензии эритроцитов);

- контроль эритроцитов на спонтанную агглютинацию (0,2 см³ (0,025 см³) физиологический раствор и 0,2 см³ (0,025 см³) 1%-ной суспензии эритроцитов).

3.4.4.3. Учет реакции.

Титром сыворотки считается ее последнее разведение, давшее полную задержку гемагглютинации вируса. Идентификацию возбудителя считают завершенной, если диагностическая сыворотка из набора тормозит гемагглютинирующую активность выделенного штамма вируса в том же титре, как антиген из набора.

3.5. Установление специфических антител (антигемагглютининов) в сыворотке крови больных животных к вирусу гриппа лошадей.

3.5.1. Парные сыворотки крови лошадей отбирают после проявления первых клинических признаков заболевания у животных и через 2...4 недели.

3.5.2. Получение и подготовка сывороток.

Кровь от лошадей берут в области верхней трети шеи (яремной вены) в пробирки, увлажненные физиологическим раствором. Полученную кровь выдерживают 2...3 ч при температуре 18...20 °C, осторожно по стенке пробирки обводят стерильной стеклянной палочкой или другим инструментом и переносят в холодильник с температурой 4 °C. Через 12...24 ч сыворотку отсасывают в стерильную пробирку. Сыворотки отправляют на исследование или хранят в замороженном виде. Избегать повторного замораживания и оттаивания сывороток.

Перед использованием сыворотки разводят и обрабатывают, как указано в п. 3.2.

3.5.3. Постановка реакции торможения гемагглютинации.

3.5.3.1. Постановка реакции описана в п. 3.4.4.

В реакции используют антигены 1-го и 2-го серотипов, подготовленные согласно пп. 3.4.2, 3.4.3.

3.5.3.2. Обработка результатов.

Титром сыворотки считается ее последнее разведение, давшее полную задержку гемагглютинации с одним заведомо известным антигеном.

Штаммовая принадлежность определена, если испытуемая сыворотка тормозит гемагглютинирующую активность диагностического антигена в пределах целого или 1/2...1/8 его титра с гомологичной диагностической сывороткой, при отсутствии реакции с другим антигеном или же в реакции не выше 1:20.

Ретроспективно диагноз на грипп может быть поставлен при исследовании парных сывороток крови лошадей при четырехкратном увеличении в них титра.

4.1. В случае несоответствия набора требованиям, указанным в настоящем наставлении, а также его неэффективности применение данной серии препарата прекращают и в соответствии с указанием ГУВ МСХ РФ от 8 мая 1992 г. N 22-7/28 "О порядке предъявления рекламации на ветпрепараты отечественного производства и закупаемые по импорту" сообщают об этом предприятию-изготовителю, Всероссийскому государственному Центру качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (123022, Москва, Звенигородское шоссе, 5), Центральной научно-методической ветеринарной лаборатории (111162, Москва, ул. Оранжерейная, 23).

Одновременно в Центр направляют с нарочным (высылают) 2 набора данной серии.

С утверждением настоящего наставления на территории Российской Федерации не действует "Наставление по применению набора антигенов и сывороток для диагностики гриппа лошадей" N 13-7-2/959, утвержденное Департаментом ветеринарии Министерства сельского хозяйства и продовольствия РФ 23 мая 1997 г.