"Наставление по применению набора для диагностики коронавирусного энтерита крупного рогатого скота методом гемагглютинации"
(утв. Минсельхозпродом РСФСР 11.08.1990)

1.1. Набор для диагностики коронавирусного энтерита крупного рогатого скота методом гемагглютинации применяется для обнаружения коронавирусного антигена и антикоронавирусных антител у крупного рогатого скота. Антиген определяют в пробах фекалий больных, тонкого и толстого отделов кишечника павших с признаками диареи телят. Обнаружение антител проводят в сыворотке крови и молозиве лактирующих коров.

1.2. Срок годности набора - 2 года со дня изготовления при соблюдении условий хранения в сухом и темном месте при температуре 8...12 °C в пределах срока годности. Допускается хранение при любой минусовой температуре.

1.3. Разведенные сыворотки и антиген сохраняют активность в течение 1 мес. при условии их хранения при -20 °C. Разведенные препараты должны храниться в пенициллиновых флаконах под резиновыми пробками.

2.1. Для проведения реакций необходимы следующие материалы и растворы:

2.1.1. Фосфатно-буферный солевой раствор (ФБСР) готовят по следующей прописи:

Для приготовления ФБСР с pH 7,2...7,4 смешивают 430 мл раствора А, 119 мл раствора Б и 500 мл раствора В.

2.1.2. Раствор Альсевера используют для консервирования крови и готовят по следующей прописи:

Раствор Альсевера разливают по флаконам и стерилизуют в водяной бане по 30...40 мин три дня подряд. К одной части крови добавляют 10 частей консерванта. Консервированная кровь пригодна для получения эритроцитов в течение 10...12 сут со дня ее получения.

2.2. 0,5%-ную суспензию эритроцитов мышей готовят следующим образом: кровь от мышей берут в раствор Альсевера путем тотального обескровливания животных. Затем необходимое количество крови центрифугируют в течение 10 мин при 2000 об/мин. Осадок эритроцитов отмывают трижды ФБСР. Из отмытых эритроцитов готовят 0,5%-ную суспензию.

2.3. Сыворотки крови, молозива и молока, а также контрольную и специфическую сыворотки из набора перед исследованием обрабатывают эритроцитами мышей, для чего к 0,25 мл сыворотки добавляют 0,25 мл 10%-ной суспензии эритроцитов, выдерживают 1 ч при комнатной температуре и центрифугируют 15 мин при 1500...2000 об/мин.

Таким образом, перед использованием в реакциях сыворотки оказываются разведенными 1:2.

3.1. Для выявления антител в сыворотках крови, молозиве и молоке используют реакцию торможения гемагглютинации (РТГА).

Постановка РТГА включает два этапа: а) определение рабочей дозы антигена и б) постановка основного опыта.

3.1.1. Вначале определяют рабочую дозу антигена (4 АЕ), для чего проводят титрование антигена в РГА. Для этого во все лунки панели вносят по 0,025 мл (1 капля) ФБСР и делают двукратное разведение специфического антигена. Затем во все лунки вносят по 1 капле 0,5%-ной суспензии эритроцитов.

3.1.2. Учет реакции проводят через 1 ч после оседания эритроцитов в контрольных лунках, которые содержат 1 каплю ФБСР и 1 каплю 0,5%-ной суспензии эритроцитов. Учет проводят по четырехкрестовой системе (рис. 23). За гемагглютинирующий титр антигена принимают наибольшее его разведение, которое вызывает агглютинацию эритроцитов не менее чем на ++.

++++ - эритроциты оседают в виде зонтика с неровными зубцами; +++ - зонтика не образуется, эритроциты находятся в виде хлопьев; ++ - эритроциты в виде хлопьев оседают на дно лунки; + - на дне лунки образуется диск, окруженный хлопьями эритроцитов; - - эритроциты оседают на дно лунки в виде диска или колечка с ровными краями.

Затем показатель титра антигена в РГА делят на 4. Так, если титр антигена 1:256, то рабочее разведение будет составлять 1:64 (4 АЕ).

3.1.3. Перед постановкой основного опыта определяют правильность выбора 4 АЕ (рис. 24). Для этого в 5 лунок раскапывают по 1 капле ФБСР, а затем титруют рабочую дозу антигена. Таким образом, в первой лунке будет 2 АЕ, во второй 1 АЕ, в третьей - 0,5 АЕ. После этого в каждую лунку добавляют по 1 капле 0,5%-ной суспензии эритроцитов, панели встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 60 мин.

При правильном выборе рабочей дозы (4 АЕ) в первой и второй лунках должна быть агглютинация, а в третьей лунке агглютинации быть не должно. Если в третьей лунке оказывается полная или частичная агглютинация, то это означает, что выбранная доза антигена содержит не 4 АЕ, а больше. В этом случае доза должна быть уменьшена. Особенно важно, чтобы во второй лунке, где должна быть 1 АЕ антигена, была полная агглютинация. Если в ней агглютинация не полная, то выбранная рабочая доза содержит меньше АЕ в 0,025 мл и должна быть увеличена.

Уменьшение или увеличение рабочей дозы антигена проводят добавлением соответственно ФБСР или антигена и повторно проверяют.

3.1.4. Для постановки основного опыта в ряд лунок панели разливают по 1 капле ФБСР. В первую лунку вносят 1 каплю испытуемой сыворотки и делают двукратное разведение петлями. После этого во все лунки панели вносят по 1 капле рабочего разведения антигена (4 АЕ). После часового контакта сыворотки с антигеном во все лунки добавляют по 1 капле 0,5%-ной суспензии эритроцитов.

3.2. Учет реакции. Реакцию учитывают через 60 мин. За титр сыворотки принимают наибольшее ее разведение, которое тормозит агглютинацию эритроцитов коронавирусным антигеном не менее, чем на ++.

Контролем реакции служит результат взаимодействия специфической и контрольной сывороток с коронавирусным антигеном, для чего сыворотки титруют как полевые.

Сыворотку считают положительной, если ее титр 1:32 и выше.

Пробы, при исследовании которых получен сомнительный результат, исследуют повторно. При получении двух сомнительных результатов пробу считают отрицательной.

4.1. Для постановки этой реакции в первый ряд лунок панели вносят по 1 капле отрицательной (контрольной) сыворотки; во второй - по капле специфической антигемагглютинирующей сыворотки, разведенных 1:20 ФБСР. Затем в первые лунки обоих рядов вносят по 1 капле испытуемого антигена из фекалий или кишечника, перемешивают петлями объемом 0,025 мл, делают двукратные разведения и ставят на инкубацию на 1 ч. По истечении срока инкубации во все лунки обоих рядов панели вносят по 1 капле (0,025 мл) 0,5%-ной суспензии эритроцитов, перемешивают и оставляют на 1 ч.

1-й ряд - титр испытуемого антигена в ряду с отрицательной (контрольной) сывороткой; 2-й ряд - титр испытуемого антигена в ряду со специфической антигемагглютинирующей сывороткой.

4.2. Учет реакции. Реакция считается положительной, если титр гемагглютинации в исследуемом материале составил 1:32 и выше, и специфическая сыворотка тормозит гемагглютинацию в исследуемом материале не менее чем на 4 разведения (в 16 раз), т.е. если титр гемагглютининов в первом ряду с отрицательной сывороткой составил 1:128, то во втором ряду со специфической антигемагглютинирующей сывороткой он должен быть не выше 1:8 (рис. 25).

При выявлении неактивности диагностикумов или получении неспецифических реакций применение наборов данной серии прекращают и, в соответствии с указанием Главного управления ветеринарии Госагропрома СССР от 19 сентября 1987 г. N 432-3 "О порядке предъявления рекламаций на ветеринарные препараты отечественного производства и закупаемые по импорту", сообщают об этом ВГНКИ ветпрепаратов Госагропрома СССР (123022, Москва, Звенигородское шоссе, 5) и предприятию-изготовителю. Одновременно во ВГНКИ ветпрепаратов направляют с нарочным не менее 2 наборов серии, оказавшейся слабо активной или неспецифичной.