ГОСУДАРСТВЕННОЕ
САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЕ
НОРМИРОВАНИЕ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ГОСУДАРСТВЕННЫЕ
САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЕ
ПРАВИЛА И НОРМАТИВЫ
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Метод
микробиологического измерения
концентрации клеток микроорганизма
Streptomyces cinnamonensis
НИЦБ 109 - продуцента монензина
в воздухе рабочей зоны
Методические указания
МУК 4.2.1067-01
Минздрав России
Москва 2002
1. Разработаны к.б.н. Бару Р.В.,
к.б.н. Лапчинской А.В. (Государственный научный центр по антибиотикам).
2. Утверждены и введены в
действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации -
Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации 20 сентября
2001 г.
3. Введены впервые.
СОДЕРЖАНИЕ
УТВЕРЖДАЮ
Главный государственный
санитарный врач Российской
Федерации - Первый
заместитель
Министра здравоохранения
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
20 сентября 2001 г.
МУК 4.2.1067-01
Дата
введения: с момента
утверждения
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Метод микробиологического измерения концентрации
клеток микроорганизма Streptomyces cinnamonensis
НИЦБ 109 - продуцента монензина
в воздухе рабочей зоны
Настоящие методические
указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного
анализа концентрации клеток штамма Streptomyces cinnamonensis НИЦБ 109-продуцента монензина в воздухе рабочей зоны в диапазоне
концентраций от 100 до 3000 клеток в 1 м3 воздуха.
Методические указания
разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ
12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические
требования» и ГОСТ Р 8.563-96 «Методики выполнения измерений».
Методические указания
предназначены для применения в лабораториях предприятий, организаций и
учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения
микробиологических исследований.
Микроорганизм Streptomyces cinnamonensis НИЦБ 109 является
продуцентом антибиотика монензина. Штамм растет на различных агаризованных и
жидких средах. Культура образует цепочки спор, обычно прямые или слегка
извилистые, с гладкой оболочкой. На твердой питательной среде ISP на 3
сутки роста при температуре 28 °С образует округлые радиально-складчатые
морщинистые колонии с кремовым или сероватым налетом, фестончатым краем и
выпуклым более темным центром, диаметром 1-2 мм. На шестые сутки инкубации
размеры колонии достигают 3-5 мм, конфигурация и складчатость колоний не
изменяется, образуется воздушный мицелий со спорами бежевато-серого цвета, в
среду выделяет коричневый пигмент. Штамм устойчив к следующим антибиотикам:
левомицетину (30 мкг/мл), линкомицину (15 мкг/мл), полимиксину М (100 мкг/мл),
эритромицину (мкг/мл), тетрациклину (30 мкг/мл) и олеандомицину (15 мкг/мл).
ПДКр.з. 3000 кл/м3.
Методика обеспечивает
выполнение измерений количества клеток продуцента монензина в воздухе рабочей
зоны в диапазоне концентраций от 100 до 5000 клеток в 1 м3 воздуха
при доверительной вероятности 0,95.
Метод основан на аспирации
из воздуха клеток продуцента монензина на поверхность плотной питательной среды
и подсчета выросших колоний по типичным морфологическим признакам.
При выполнении измерений
применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.
5.1. Средства измерений, вспомогательные
устройства, материалы
Прибор для
бактериологического анализа воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова) ТУ
64-12791-77
Термостаты
электрические суховоздушные или водяные
Автоклав
электрический ГОСТ
9586-75
Бокс,
оборудованный бактерицидными лампами
Холодильник
бытовой
Весы
лабораторные, аналитические типа ВЛА-200
Микроскоп
биологический с иммерсионной системой типа «Биолам» Л-211
Лупа с
увеличением х10 ГОСТ
25706-83
Чашки Петри
бактериологические плоскодонные стеклянные, диаметром 100 мм
Пробирки
биологические, вместимостью 20 и 35 мл ГОСТ
10515-75
Пипетки
мерные на 1,5 и 10 мл ГОСТ
10515-75
Пипетки
мерные на 1,5, и 10 мл ГОСТ
1770-74
Колбы
конические, вместимостью 250 и 500 мл ГОСТ
1770-74
Секундомер ГОСТ
9586-75
Барометр ГОСТ
24696-79
Марля
медицинская ГОСТ
9412-77
Вата
медицинская гигроскопическая ГОСТ
25556-81
5.2. Реактивы, растворы
Антибиотики: левомицетин, линкомицин,
полимиксин М, эритромицин, тетрациклин, олеандомицин и нистатин
Спирт
этиловый ректификат ГОСТ
5962-67
Селективная
среда для штамма-продуцента
Среда ISP:
Мальт-экстракт (Difco) - 1,5 %, дрожжевой экстракт (Difco) - 0,5 %, крахмал
растворимый - 0,5 %, мел химический осажденный - 0,3 %, Бакто-агар (Difco) -
2,0 %, вода дистиллированная - 100 мл, рН 7,2-7,4.
При выполнении измерений
концентрации клеток продуцента монензина в воздухе рабочей зоны соблюдают:
·
правила
техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ
12.1.005-88;
·
правила
электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ
12.1.019-79 и инструкцию по эксплуатации прибора;
·
положения
«Инструкций по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе
в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической
промышленности» (1977).
Все виды работ с реактивами
проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с
биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.
К выполнению измерений и
обработке их результатов допускаются лица с высшим или средним специальным
образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющие навыки работы в
области микробиологических исследований.
Процессы приготовления
растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при
температуре воздуха (20 ± 5) °С, атмосферном давлении 630-800 мм рт. ст. и
влажности воздуха не более 80 %.
9.1. Условия отбора проб воздуха
Для определения продуцента
монензина воздух аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин
на поверхность плотной питательной среды. Время аспирации воздуха (1-10 мин)
зависит от предполагаемой концентрации клеток продуцента.
Аппарат Кротова перед каждым
отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно
обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную
и внутреннюю стенку крышки. На подвижный диск устанавливают подготовленную
чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают.
Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы
воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и
закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают
точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
9.2. Выполнение анализа
Метод предполагает учет
количества типичных по морфологическим признакам колоний выросших на 3-6-е сутки
после посева воздуха. Прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний
продуцента.
Селективную среду
расплавляют, остужают до 60 °С, добавляют свежеприготовленный в стерильной
дистиллированной воде раствор одного из антибиотиков (левомицитин, линкомицин,
цефалотин или другой, указанные в разделе 2) для подавления посторонней
бактериальной микрофлоры и нистатина (10 мкг/мл) для подавления грибковой
флоры, тщательно перемешивают и разливают по 10-15 мл в стеклянные чашки Петри
на горизонтальной поверхности. Чашки с застывшей средой помещают в термостат на
сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные
чашки используют для контроля воздуха.
После отбора проб воздуха
чашки Петри помешают в термостат при 28 °С. Через 72 ч производят подсчет
выросших типичных колоний продуцента. При необходимости культуру подвергают
микроскопированию.
Расчет концентрации клеток
продуцента в пересчете на 1 м3 воздуха производят по формуле:
кг/м3, где
Х - концентрация клеток
продуцента в воздухе;
N
-
количество колоний продуцента, выросших на чашке;
1000 - коэффициент пересчета
на 1 м3 воздуха;
V - объем воздуха, л
(произведение скорости на время аспирации).
В случае невозможности использования
аппарата Кротова рекомендуется применять метод седиментации клеток продуцента
из воздуха непосредственно на чашки Петри с плотной питательной средой. Время
отбора проб воздуха может составлять до 60 мин. При этом пользуются следующим
расчетом концентрации клеток продуцента:
эмпирически установлено, что
за 5 мин на площадь 100 см2 оседает количество бактерий,
содержащееся в 10 л воздуха, за 1 мин - 2 л воздуха. Площадь чашки Петри
диаметром 100 мм равна 78,54 см2.
Составляем пропорцию:
на 100 см2
за 1 мин оседает 2 л воздуха
на 78,54 см2 - Х л
Х= 1,57 л/мин.
Следовательно, на стеклянную
чашку Петри за 1 мин оседает количество бактерий, содержащееся в 1,57 л
воздуха.
Надо определить количество
клеток в 1 м3 воздуха. На 1 чашку (диаметр 100 мм) за 1 мин оседает
количество микробов, содержащееся в 1,57 л воздуха, за Т мин - 1,57×Т л.
В этом количестве содержится
N колониеобразующих единиц (микробных клеток - спор, обрывков мицелия), а в 1 м3
воздуха содержится
Пример: за 30 мин
седиментации выросло 12 колоний микроорганизма. В 1 м3 воздуха
содержится
=253 клетки
Результаты измерений
оформляют протоколом по форме.
Протокол №
количественного
микробиологического анализа штамма Streptomyces cinnamonensis НИЦБ 109 - продуцента монензина в воздухе рабочей зоны
Дата
проведения анализа
Место отбора
пробы
Название
лаборатории
Юридический
адрес организации
Результаты микробиологического
анализа
Шифр или № пробы
|
Определяемый
микроорганизм
|
Концентрация, кл/м3
|
|
|
|
Ответственный исполнитель
Научный руководитель
1. ГОСТ
12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические
требования».
2. ГОСТ 8.563-96 «ГСИ.
Методики выполнения измерений».
3. Положение об организации
работы по технике безопасности в микробиологической промышленности (М., 1980,
27 с.).
4. Инструкции по устройству,
требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических
лабораториях предприятий микробиологической промышленности (М., 1977, 7 с.).