ГОСУДАРСТВЕННОЕ
САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЕ
НОРМИРОВАНИЕ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ГОСУДАРСТВЕННЫЕ
САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЕ
ПРАВИЛА И НОРМАТИВЫ
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Метод микробиологического измерения
концентрации клеток штамма-продуцента
тилозина Streptomyces fradiae БС-1
в воздухе рабочей зоны
Методические
указания
МУК 4.2.1068-01
Минздрав России
Москва 2002
1. Разработаны д. м. н.
Ивановым Н. Г., к. б. н. Шеиной Н. И. (Российский государственный медицинский
университет).
2. Утверждены и введены в
действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации -
Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации 20 сентября
2001 г.
3. Введены впервые.
СОДЕРЖАНИЕ
УТВЕРЖДАЮ
Главный государственный
санитарный врач Российской
Федерации - Первый
заместитель
Министра здравоохранения
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
20 сентября 2001 г.
МУК 4.2.1068-01
Дата
введения: с момента
утверждения
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Метод микробиологического измерения концентрации клеток
штамма-продуцента тилозина Streptomyces fradiae БС-1 в воздухе рабочей
зоны
Настоящие методические указания
устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа
концентрации клеток штамма-продуцента тилозина Streptomyces fradiae
БС-1 в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 50000 клеток в 1
м3 воздуха.
Методические указания
разработаны с целью обеспечения микробиологического контроля штамма Streptomyces fradiae БС-1 в воздухе производственных помещений
биотехнологических производств и оценки соответствия уровня его содержания
гигиеническим нормативам на основе учета требований ГОСТ
12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические
требования» и ГОСТ 8.563-96 «ГСИ. Методики выполнения измерений».
Методические указания
предназначены для центров госсанэпиднадзора, санитарных лабораторий
биотехнологических предприятий, микробиологических лабораторий
научно-исследовательских институтов, работающих в области промышленной гигиены.
Систематическое положение штамма-продуцента
Порядок Actinomycetales
Класс Actinomycetes
Семейство Streptomycetaceae
Род Streptomyces
Вид fradiae
Штамм БС-1
Культуралъно-морфологические
особенности штамма
Штамм Streptomyces fradiae БС-1 является облигатным аэробом, растет на
различных питательных средах: СР-6, СР-15, Гаузе-1, Ваксмана путем
инкубирования в термостате при температуре 28 °С. Продолжительность развития
составляет 10-15 суток.
Четкие
культурально-морфологические свойства штамма проявляются на агаризованной среде
СР-15 на 3 день развития. На этой среде штамм образует 6 морфологических типов
колоний, из которых наиболее характерный тип составляет более 70 %. Изучаемый
штамм представлен округлыми колониями до 9 мм в диаметре (в зависимости от
плотности посева). Белый воздушный мицелий образуется в центре колонии и по
периферии в виде одной, реже двух концентрических окружностей, край колоний не
опушен. Профиль изогнутый, поверхность шероховатая, неопушенные части колоний
гладкие, блестящие, кремовые. Структура мелкозернистая, по краю неопушенной
части однородная. Консистенция плотная, пигмент с обратной стороны колоний
желтовато-коричневый.
Предельно допустимая
концентрация Streptomyces fradiae БС-1 в воздухе рабочей зоны
- 2000 кл/м3, пометка А, 3 класс опасности.
Методика обеспечивает
выполнение измерений количества клеток продуцента тилозина в воздухе рабочей
зоны в диапазоне концентраций от 100 до 50000 клеток в 1 м3 при
доверительной вероятности 0,95.
Метод измерения концентрации
штамма-продуцента Strepto-myces fradiae
БС-1 основан на аспирации аппаратом Кротова микробных клеток (спор, обрывков
мицелия) на поверхность плотной питательной среды СР-15 и подсчета выросших
колоний, которые выявляются при задержке роста тест-культуры (Bacillus subtilis), происходящего вследствие диффузии в агар
антибиотика, выделяемого штаммом-продуцентом Streptomyces fradiae
БС-1.
При данном методе на чашке
Петри после забора пробы может быть учтено до 50 колоний, т. к. большее
количество колоний на чашке могут образовывать сливающиеся зоны лизиса, что
приводит к занижению результатов.
При выполнении измерений
применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.
5.7. Средства измерений,
вспомогательные устройства, материалы
Прибор для
бактериологического анализа воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова) ТУ
64-12791-77
Термостаты электрические
суховоздушные или водяные
Автоклав электрический ГОСТ
9586-75
Бокс, оборудованный
бактерицидными лампами
Холодильник бытовой
Весы лабораторные,
аналитические типа ВЛА-200
Микроскоп биологический с
иммерсионной системой типа «Биолам» Л-211
Водяная баня или водяной
термостат
Газовая горелка или
спиртовка лабораторная
Чашки Петри
Петли бактериологические
Пробирки биологические,
вместимостью 20 и 35 мл ГОСТ
10515-75
Пипетки мерные на 1,5 и 10
мл ГОСТ
10515-75
Пипетки мерные на 1,5, и 10 мл ГОСТ
1770-74
Колбы конические, вместимостью 250 и 500 мл ГОСТ
1770-74
Секундомер ГОСТ
9586-75
Барометр ГОСТ
24696-79
Марля медицинская ГОСТ
9412-77
Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ
25556-81
5.2. Реактивы, растворы
Среда СР-15, агаризованная
питательная Среда для продуцента тилозина (состав в %: меласса - 0,5, крахмал -
0,5, соевая мука - 0,5, кукурузный экстракт - 0,5, (NH4)2SО4
- 0,1, NaCl - 0,1, MgSO4×7Н2O -
0,05. СаСО3 - 0,2, агар - 1,5. рН среды до стерилизации 7,0-7,2.
Режим стерилизации 1,1-1,2 атм., 40-50 мин)
Агаризованная среда
Хоттингера, рН 6,8-7,0
Спирт этиловый ректификат ГОСТ
5962-67
Хлороформ
Тетрациклина гидрохлорид
Амфотерицин В для
внутривенного введения
Тест-культура Вас. subtilis
вариант Л2 музейный штамм, споры хранят в виде водной суспензии при
температуре 4 °С.
При выполнении измерений
концентрации клеток продуцента Биовита и хлортетрациклина в воздухе рабочей
зоны соблюдают:
·
правила
техники безопасности при работе с химическими реактивами в соответствии с ГОСТ
12.1.005-88;
·
правила
электробезопасности при работе с электроустановками в соответствии с ГОСТ
12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации приборов;
·
требования,
изложенные в руководстве «Положение об организации работы по технике
безопасности в микробиологической промышленности» (1980);
·
положения
«Инструкций по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе
в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической
промышленности» (1977).
К выполнению измерений и
обработке их результатов допускаются лица с высшим или средним специальным
образованием, прошедшие соответствующую подготовку и имеющие навыки работы в
области микробиологических исследований.
Процессы приготовления
растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях в
соответствии с ГОСТ
15150-69 при температуре воздуха (20±5) °С, атмосферном давлении 630-800 мм
рт. ст. и влажности воздуха не более 80 %.
9.1. Условия отбора проб воздуха
Для определения концентрации
Streptomyces fradiae БС-1 воздух
производственных помещений аспирируют со скоростью 10 л/мин на поверхность
плотной питательной среды СР-15 в чашку Петри, помещенную в аппарат Кротова.
Аппарат Кротова перед каждым
отбором воздуха тщательно протирают спиртом. На подвижный диск устанавливают
чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Крышку прибора
закрывают. После отбора пробы воздуха и остановки диска открывают крышку
прибора, снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. В период
отбора проб воздуха крышку чашки Петри хранят в стерильном пакете из бумаги,
полиэтилена или других стерильных емкостях.
Время аспирации воздуха
(1-10 мин) зависит от предполагаемой концентрации клеток штамма-продуцента в
воздухе рабочей зоны.
Отбор проб сопровождается
составлением акта отбора с указанием места, времени и условий отбора.
9.2. Выполнение анализа
Агаризованную среду СР-15
расплавляют и остужают до 50-60 °С. Затем добавляют свежеприготовленный в стерильной
дистиллированной воде амфотерицин для инъекций из расчета 20 мкг на 1 л среды
для подавления посторонней воздушной грибковой флоры, тщательно перемешивают и
разливают в стерильные чашки Петри по 10 мл. Чашки с застывшей средой помещают
в термостат при 37 °С на сутки, после чего проросшие чашки бракуют.
После отбора проб воздуха на
чашки Петри в аппарате Кротова их помещают в термостат при температуре 28-30 °С
на 48 ч.
После инкубации чашки
помещают в вытяжной шкаф. На внутреннюю поверхность наливают 1,5 мл хлороформа,
чашку с посевом вверх донышком вставляют в крышку так, чтобы выросшие колонии
бактерий находились в парах хлороформа не менее 20-30 мин. Затем каждую чашку
вынимают из крышки, выливают оставшийся хлороформ, снова закрывают крышками и
переносят в бокс. Чашки оставляют в боксе на 2 ч при комнатной температуре для
преддиффузии.
Затем чашки Петри заливают 5
мл агаризованной среды Хоттингера с тест-культурой Вас. subtilis
вариант Л2 из расчета 3 х 107 споровых клеток на 1 мл
среды (Государственная фармакопея СССР, изд. XI, 1989, с. 206).
Чашки Петри с застывшей
средой Хоттингера донышком вверх помещают в термостат при 37 °С на сутки. По
окончании инкубации, т.е. через 3 суток после отбора пробы воздуха производят
подсчет зон задержки роста тест-культуры, которые соответствуют числу проросших
клеток штамма-продуцента Streptomyces fradiae
БС-1. Учитывают зоны диаметром не менее 5 мм.
Расчет концентрации
микробных клеток Streptomyces fradiae БС-1 в 1 м3 воздуха
производят по формуле:
, где
Х - количество микробных клеток
в воздухе (1 м3);
П - число зон задержки роста
тест-культуры, что соответствует числу колоний, выросших на чашке Петри;
Т - время забора пробы воздуха,
мин;
В - скорость подачи воздуха,
л/мин;
1000 - коэффициент перевода
1 л в 1 м3.
Результаты измерений
оформляют протоколом по форме.
Протокол №
количественного
микробиологического анализа штамма-продуцента Streptomyces fradiae БС-1 в воздухе рабочей зоны
Дата
проведения анализа
Место отбора
пробы
Название
лаборатории
Юридический
адрес организации
Результаты
микробиологического анализа
Шифр или № пробы
|
Определяемый
микроорганизм
|
Концентрация, кл/м3
|
|
|
|
Ответственный исполнитель
Научный руководитель
1. ГОСТ
12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические
требования».
2. ГОСТ 8.563-96 «ГСИ.
Методики выполнения измерений».
3. Положение об организации
работы по технике безопасности в микробиологической промышленности (М., 1980,
27 с.).
4. Инструкции по устройству,
требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических
лабораториях предприятий микробиологической промышленности (М., 1977, 7 с.).
5. Государственная
фармакопея СССР, 1989, изд. XI, с. 206.