"ГОСТ Р 71138-2023. Национальный стандарт Российской Федерации. Ферментные препараты для пищевой промышленности. Метод определения молокосвертывающей активности"
(утв. и введен в действие Приказом Росстандарта от 06.12.2023 N 1525-ст)

1 РАЗРАБОТАН Ассоциацией "Технологическая платформа БиоТех2030" (Ассоциация "ТП БиоТех2030")

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 326 "Биотехнологии"

3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 6 декабря 2023 г. N 1525-ст

4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Настоящий стандарт распространяется на ферментные препараты, предназначенные для свертывания молока или молочной смеси для производства молочных продуктов, и устанавливает метод определения молокосвертывающей активности химозина.

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 12.1.004 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ 12.4.009 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 12.4.021 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования

ГОСТ 61 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия

ГОСТ 199 Реактивы. Натрий уксуснокислый 3-водный. Технические условия

ГОСТ 450 Кальций хлористый технический. Технические условия

ГОСТ 1770 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 25336 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 27752 Часы электронно-механические кварцевые настольные, настенные и часы-будильники. Общие технические условия

ГОСТ 28498 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 29169 (ИСО 648-77) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой

ГОСТ 29227 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ 33629 Консервы молочные. Молоко сухое. Технические условия

ГОСТ 34353 Препараты ферментные молокосвертывающие животного происхождения сухие. Технические условия

ГОСТ OIML R 76-1 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ Р 57248 Препараты ферментные. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ Р 58144 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ ИСО 5725-6-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты" за текущий год. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана недатированная ссылка, то рекомендуется использовать действующую версию этого стандарта с учетом всех внесенных в данную версию изменений. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, то рекомендуется использовать версию этого стандарта с указанным выше годом утверждения (принятия). Если после утверждения настоящего стандарта в ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, внесено изменение, затрагивающее положение, на которое дана ссылка, то это положение рекомендуется применять без учета данного изменения. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, рекомендуется применять в части, не затрагивающей эту ссылку.

В настоящем стандарте применены термины по ГОСТ 34353 и [1].

Метод основан на сравнении периода времени, необходимого для свертывания молочного субстрата при внесении пробы анализируемого ферментного препарата, и периода времени, необходимого для свертывания молочного субстрата при внесении контрольного образца фермента, и последующем вычислении молокосвертывающей активности в Международных молокосвертывающих единицах (IMCU) на грамм (кубические сантиметры) анализируемого ферментного препарата.

Отбор проб - по ГОСТ 34353, ГОСТ Р 57248.

При выполнении измерений в лаборатории необходимо соблюдать следующие условия:

Весы с пределом допускаемой абсолютной погрешности не более +/- 0,003 г по ГОСТ OIML R 76-1.

Анализатор потенциометрический диапазоном измерения 1 - 14 ед. pH погрешностью не более +/- 0,05 ед. pH.

Секундомер.

Термометр жидкостный (не ртутный) диапазоном измерения от 0 °C до 100 °C ценой деления шкалы 1 °C по ГОСТ 28498.

Часы 2-го класса точности по ГОСТ 27752.

Баня водяная лабораторная, обеспечивающая поддержание температуры (32,0 +/- 1,0) °C.

Мешалка магнитная лабораторная.

Испаритель роторный лабораторный.

Колбы мерные 1-50-2, 1-1000-2 по ГОСТ 1770.

Пипетки градуированные 1-1-2-1, 1-1-2-5 по ГОСТ 29227.

Пипетки с одной отметкой 2-2-25 по ГОСТ 29169.

Цилиндры 1-10-2, 1-25-2, 1-100-2, 1-500-2 по ГОСТ 1770.

Стаканы В-1-50, В-1-250, В-1-400, В-1-600 ТС по ГОСТ 25336.

Колба круглодонная К-1-50-29/32 ТС по ГОСТ 25336.

Кальций хлористый по ГОСТ 450, сорт 1.

Кислота уксусная по ГОСТ 61, х.ч., ледяная.

Контрольный образец химозина ферментной активностью в Международных молокосвертывающих единицах (IMCU) 1000 IMCU/г (см³).

Молоко сухое обезжиренное по ГОСТ 33629.

Натрий уксуснокислый 3-водный по ГОСТ 199, ч.д.а.

Вода дистиллированная по ГОСТ Р 58144.

Допускается применение других средств измерений и вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающих необходимую точность измерений, а также реактивов по качеству не ниже вышеуказанных.

Для удаления диоксида углерода дистиллированную воду кипятят не менее 20 мин и переносят в стеклянную бутыль с завинчивающейся крышкой.

Срок хранения кипяченой дистиллированной воды при комнатной температуре - не более 10 сут.

8.2 Приготовление раствора хлористого кальция массовой концентрации c(CaCl₂) 0,5 г/дм³

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают (0,500 +/- 0,003) г хлористого кальция, добавляют небольшое количество дистиллированной воды (см. 8.1) и тщательно перемешивают. Объем раствора доводят дистиллированной водой (см. 8.1) до метки и переносят в стеклянную бутыль с завинчивающейся крышкой.

Срок хранения раствора при комнатной температуре - не более 24 ч.

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 57,5 см³ уксусной кислоты, добавляют небольшое количество дистиллированной воды (см. 8.1) и тщательно перемешивают. Объем раствора доводят дистиллированной водой (см. 8.1) до метки и переносят в стеклянную бутыль с завинчивающейся крышкой.

Срок хранения раствора при комнатной температуре - не более 1 мес.

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают (10,000 +/- 0,003) г уксуснокислого натрия, добавляют 700 см³ дистиллированной воды (см. 8.1), 10 см³ уксусной кислоты молярной концентрации 1 моль/дм³ (см. 8.3) и аккуратно перемешивают. Значение pH полученного раствора доводят до 5,5 ед. pH раствором уксусной кислоты молярной концентрации 1 моль/дм³.

Затем объем раствора доводят дистиллированной водой (см. 8.1) до метки, аккуратно перемешивают и переносят в бутыль из темного стекла с завинчивающейся крышкой.

Срок хранения раствора при комнатной температуре - не более 24 ч, или при температуре от 0 °C до 5 °C - не более 1 мес.

При использовании контрольного образца фермента молокосвертывающей активностью 1000 IMCU/г (см³) в мерную колбу вместимостью 50 см³ помещают контрольный образец фермента [для жидких проб - 2,50 см³ (V₁), для порошкообразных проб - (2,500 +/- 0,003) г (m₁)]. Добавляют небольшое количество буферного раствора (см. 8.4) и тщательно перемешивают. Доводят объем буферным раствором (см. 8.4) до метки, аккуратно перемешивают и переносят в стеклянную бутыль с завинчивающейся крышкой.

Срок хранения раствора при комнатной температуре - не более 24 ч. Допускается хранить контрольный раствор фермента при температуре от 0 °C до 5 °C не более 2 сут.

Примечание - Допускается применение контрольного образца химозина другой ферментной активности, скорректировав навеску химозина при проведении измерений таким образом, чтобы время свертывания молока под действием рабочего раствора контрольного образца фермента находилось в диапазоне 350 - 550 с.

В мерную колбу вместимостью 50 см³ помещают 3,0 см³ контрольного образца фермента, приготовленного по 8.5. Добавляют небольшое количество буферного раствора (см. 8.4) и тщательно перемешивают. Доводят объем буферным раствором (см. 8.4) до метки и аккуратно перемешивают.

При этом коэффициент разбавления равен 333,33, что соответствует времени свертывания молока под действием рабочего раствора контрольного образца фермента 350 - 550 с.

Рабочий раствор контрольного образца фермента используют в день приготовления.

С помощью мерного цилиндра отмеряют 300 см³ раствора хлористого кальция массовой концентрации c(CaCl₂) 0,5 г/дм³ (см. 8.2) и помещают в сухой химический стакан вместимостью 400 - 600 см³. В другой стакан вместимостью 400 см³ помещают (33,3 +/- 0,003) г сухого обезжиренного молока, пипеткой добавляют 2,0 - 2,5 см³ раствора хлористого кальция, перемешивают, вносят еще 2,0 - 2,5 см³ раствора хлористого кальция, повторяя процедуру добавления раствора хлористого кальция до тех пор, пока не будет получена однородная масса без сгустков и комков. Оставшийся раствор хлористого кальция доливают в молочный субстрат.

Готовый раствор молочного субстрата перемешивают при помощи магнитной мешалки в течение 30 мин, не допуская образования пены, переносят в стеклянную бутыль с завинчивающейся крышкой и выдерживают при комнатной температуре в течение 30 мин.

Раствор молочного субстрата хранят при комнатной температуре не более 4 ч или в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C в течение 24 ч. Активная кислотность (pH) приготовленного субстрата должна составлять не менее 6,50 ед. pH.

8.8.1 В мерную колбу вместимостью 50 см³ помещают образец анализируемого ферментного препарата [для жидких проб - 2,5 см³ (V₂), для сухих проб - (2,500 +/- 0,003) г (m₂)]. Добавляют небольшое количество буферного раствора (см. 8.4) и тщательно перемешивают. Доводят объем буферным раствором (см. 8.4) до метки и аккуратно перемешивают.

8.8.2 Из приготовленного по 8.8.1 раствора анализируемого ферментного препарата отбирают 3 см³ раствора и переносят в мерную колбу вместимостью 50 см³. Добавляют небольшое количество буферного раствора (см. 8.4) и тщательно перемешивают. Доводят объем буферным раствором (см. 8.4) до метки и аккуратно перемешивают.

Проводят два параллельных измерения.

9.1 В сухую круглодонную колбу вместимостью 50 см³ пипеткой вносят 25,0 см³ раствора молочного субстрата. Колбу подсоединяют к роторному испарителю, помещают в водяную баню температурой (32,0 +/- 1,0) °C и нагревают в течение 12 - 20 мин, вращая с частотой вращения роторного испарителя не выше 20 об/мин. По истечении времени термостатирования добавляют 0,5 см³ рабочего раствора контрольного образца ферментного препарата, одновременно включая секундомер. Содержимое колбы перемешивают, не допуская образования пены. Колбу прикрепляют к вращающемуся валу роторного испарителя. При появлении первых признаков коагуляции (появление хлопьев) на стенках колбы останавливают работу секундомера и фиксируют время свертывания.

9.2 Согласно 9.1 сразу же проводят определение продолжительности свертывания образца молочного субстрата анализируемым ферментным препаратом, используя вместо контрольного раствора фермента раствор анализируемого ферментного препарата, приготовленный по 8.8.

9.3 Вычисляют среднее арифметическое времени свертывания для контрольного образца фермента и для анализируемого ферментного препарата.

10.1 Общую молокосвертывающую активность испытуемого ферментного препарата X, IMCU/см³, вычисляют по формуле

где V₁ - объем исходного контрольного образца фермента (см. 8.5), см³;

t₁ - продолжительность свертывания молочного субстрата раствором контрольного образца фермента, с;

X₁ - общая молокосвертывающая активность контрольного образца фермента, IMCU/см³;

V₂ - объем пробы анализируемого ферментного препарата (8.8.1), см³;

t₂ - продолжительность свертывания молочного субстрата раствором анализируемого ферментного препарата, с.

10.2 Общую молокосвертывающую активность испытуемого ферментного препарата X, IMCU/г, вычисляют по формуле

где m₁ - масса исходного контрольного образца фермента (см. 8.5), г;

X₂ - общая молокосвертывающая активность контрольного образца фермента, IMCU/г;

m₂ - масса пробы анализируемого ферментного препарата (8.8.1), г;

t₁ - продолжительность свертывания молочного субстрата раствором контрольного образца фермента, с;

t₂ - продолжительность свертывания молочного субстрата раствором анализируемого ферментного препарата, с.

Метрологические характеристики метода определения молокосвертывающей активности при доверительной вероятности P = 0,95 приведены в таблице 1.

Проверку приемлемости результатов измерений, полученных в условиях повторяемости (два параллельных определения, n = 2), проводят с учетом требований ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 (пункт 5.2.2).

Результаты измерений считаются приемлемыми при условии

где X₁, X₂ - значения результатов двух параллельных измерений, полученные в условиях повторяемости;

r_отн. - предел повторяемости, значение которого приведено в таблице 1, %;

X_ср - среднее арифметическое двух параллельных измерений.

Если данное условие не выполняется, то проводят повторные измерения и проверку приемлемости результатов измерений в условиях повторяемости в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 (пункт 5.2.2).

При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам анализа.

Проверку приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости (в двух лабораториях, m = 2), проводят с учетом требований ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 (пункт 5.3.2.1).

Результаты измерений, выполненные в условиях воспроизводимости, считаются приемлемыми при условии

где , - значения результатов двух измерений, полученные в двух лабораториях в условиях воспроизводимости;

R_отн. - предел воспроизводимости, значение которого приведено в таблице 1, %;

X_ср - среднее арифметическое результатов измерений, выполненных в условиях воспроизводимости.

Если данное условие не выполняется, то проводят процедуры в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 (пункт 5.3.3).

Результат измерения представляют в документах, предусматривающих его использование, в виде

где X_ср - среднее арифметическое результатов двух параллельных измерений, удовлетворяющих условию приемлемости по 11.1;

- границы абсолютной погрешности измерений ;

- границы относительной погрешности измерений, % (см. таблицу 1).

При выполнении работ необходимо соблюдать следующие требования:

- помещение лаборатории должно быть оборудовано общей приточно-вытяжной вентиляцией в соответствии с требованиями ГОСТ 12.4.021. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать норм, установленных требованиями ГОСТ 12.1.005;

- требования техники безопасности при работе с химическими реактивами - в соответствии с ГОСТ 12.1.007;

- требования техники безопасности при работе с электроустановками - в соответствии с ГОСТ 12.1.019.

Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и быть оснащено средствами пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.

Выполнение измерений может проводить специалист, имеющий специальное образование и освоивший метод в соответствии с требованиями настоящего стандарта.