"ГОСТ Р 57029-2016. Национальный стандарт Российской Федерации. Продукты пищевые специализированные, специи, пряности, продукты их переработки и биологически активные добавки к пище. Определение непищевых красителей Судан I, Судан II, Судан III, Судан IV и Пара Ред (Para Red)"
(утв. и введен в действие Приказом Росстандарта от 30.08.2016 N 965-ст)

1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением науки "Федеральный исследовательский центр питания и биотехнологии" (ФГБУН "ФИЦ питания и биотехнологии")

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 036 "Продукция пищевая специализированная"

3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 30 августа 2016 г. N 965-ст

4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Настоящий стандарт распространяется на пищевые специализированные продукты, специи, пряности и продукты их переработки, а также на биологически активные добавки к пище (БАД) и другие пищевые продукты (в состав которых входят специи и пряности) и устанавливает метод качественного определения непищевых красителей Судан I, Судан II, Судан III, Судан IV и Пара Ред (Para Red) (далее - красители) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Предел обнаружения настоящего метода для указанных красителей составляет 0,5 млн^-1 (мг/кг).

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 12.1.004 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.4.009 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 12.4.021 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования

ГОСТ OIML R 76-1 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 1770 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 2603 Реактивы. Ацетон. Технические условия

ГОСТ 8756.0 Продукты пищевые консервированные. Отбор проб и подготовка их к испытанию

ГОСТ 9792 Колбасные изделия и продукты из свинины, баранины, говядины и мяса других видов убойных животных и птиц. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ 13341 Овощи сушеные. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб

ГОСТ 25336 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26313 Продукты переработки фруктов и овощей. Правила приемки, методы отбора проб

ГОСТ 27752 Часы электронно-механические кварцевые настольные, настенные и часы-будильники. Общие технические условия

ГОСТ 28498 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 28876 (ИСО 948-80) Пряности и приправы. Отбор проб

ГОСТ 29227 Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ Р 12.1.019 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ Р 52501 Вода для лабораторного анализа. Технические условия

ГОСТ Р 53228 Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ Р 55878 Спирт этиловый технический гидролизный ректификованный. Технические условия

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты" за текущий год. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана недатированная ссылка, то рекомендуется использовать действующую версию этого стандарта с учетом всех внесенных в данную версию изменений. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, то рекомендуется использовать версию этого стандарта с указанным выше годом утверждения (принятия). Если после утверждения настоящего стандарта в ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, внесено изменение, затрагивающее положение, на которое дана ссылка, то это положение рекомендуется применять без учета данного изменения. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, рекомендуется применять в части, не затрагивающей эту ссылку.

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1 Судан I: 1-фенилазо-бета-нафтол, нейтральный жирорастворимый синтетический краситель, практически нерастворимый в воде, хорошо растворимый в органических растворителях (хлороформе, ацетоне, эфире) и имеющий интенсивную желтую окраску.

3.2 Судан II: 1-(o-ксилилазо)-бета-нафтол, нейтральный жирорастворимый синтетический краситель, практически нерастворимый в воде, хорошо растворимый в органических растворителях (хлороформе, ацетоне, эфире) и имеющий интенсивную оранжевую окраску.

3.3 Судан III: 1-[4-(фенилазо)фенилазо]-бета-нафтол, нейтральный жирорастворимый синтетический краситель, практически нерастворимый в воде, хорошо растворимый в органических растворителях (хлороформе, ацетоне, эфире) и имеющий интенсивную оранжево-красную окраску.

3.4 Судан IV: o-толилазо-o-толилазо-бета-нафтол, нейтральный жирорастворимый синтетический краситель, практически нерастворимый в воде, хорошо растворимый в органических растворителях (хлороформе, ацетоне, эфире) и имеющий интенсивную темно-красную окраску.

3.5 Пара Ред (Para Red): 1-(4-нитрофенилазо)-бета-нафтол, нейтральный жирорастворимый синтетический краситель, практически нерастворимый в воде, хорошо растворимый в органических растворителях (хлороформе, ацетоне, эфире) и имеющий интенсивную темно-красную окраску.

Структурная формула красителей приведена на рисунке 1.

Метод основан на экстракции непищевых красителей ацетоном с их последующим определением методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с диодно-матричным детектированием (при длине волны 504 нм).

В качестве контрольного метода используют метод ВЭЖХ с масс-детектированием (по молекулярным и дочерним ионам).

Хроматограф жидкостный, оснащенный насосом высокого давления, инжектором для ручного или автоматического ввода проб, диодно-матричным детектором, позволяющим проводить измерения оптической плотности при длине волны 504 нм, масс-спектрометрическим детектором и программным обеспечением для сбора и обработки хроматографических данных.

Масс-детектор типа "ионная ловушка", оснащенный источником ионизации типа "электроспрей".

Колонка хроматографическая длиной 250 мм и внутренним диаметром 4,6 мм, сорбент - силикагель с привитыми группами C18 с размером частиц 5 мкм.

Баня ультразвуковая лабораторная рабочим объемом не менее 1000 см³.

Емкости для жидких проб (виалы) с завинчивающимися крышками вместимостью 2,0 см³.

Весы неавтоматического действия по ГОСТ Р 53228 специального класса точности с пределом допускаемой абсолютной погрешности +/- 0,0005 г.

Установка для вакуумного фильтрования и дегазирования подвижной фазы.

pH-метр с погрешностью измерения не более +/- 0,05 ед. pH, в диапазоне измерения pH от 4 до 9 ед. pH.

Центрифуга настольная с относительным ускорением 5400 g, снабженная адаптерами для пробирок вместимостью 15 см³.

Пробирки полимерные центрифужные конические с завинчивающейся крышкой вместимостью 15 см³.

Стаканы лабораторные В-1-50, В-1-100, и В-1-1000 по ГОСТ 25336.

Мембранный фильтр из нейлона с диаметром пор 0,45 мкм.

Шприцы медицинские вместимостью 5 см³ с разъемом типа Luer-Lock.

Фильтры мембранные одноразовые политетрафторэтиленовые с насадкой для шприца с диаметром пор 0,45 мкм.

Часы электронно-механические по ГОСТ 27752.

Пипетки 2-1-2-1 или 1-1-2-1, 2-1-2-10 или 2-2-2-10 или 3-2-2-10 по ГОСТ 29227.

Термометры жидкостные стеклянные по ГОСТ 28498 с диапазоном измеряемых температур 0 - 100 °C и ценой деления 1 °C.

Флаконы стеклянные с завинчивающейся крышкой объемом 20 см³.

Колбы мерные 1-50-2, 1-100-2 по ГОСТ 1770.

Вода для лабораторного анализа по ГОСТ Р 52501, первой степени чистоты.

Ацетонитрил для жидкостной хроматографии с коэффициентом пропускания на 220 нм не менее 95% или выше (относительно дистиллированной воды), массовая доля воды - не более 0,03%.

Кислота трифторуксусная с массовой долей основного вещества не менее 99,8%.

Ацетон по ГОСТ 2603, х.ч.

Спирт этиловый ректификованный (этанол) по ГОСТ Р 55878.

Стандартные вещества красителей:

- Судан I (CAS <**> 842-07-9) с содержанием основного вещества не менее 90%;

- Судан II (CAS <*> 3118-97-6) с содержанием основного вещества не менее 90%;

- Судан III (CAS <*> 85-86-9) с содержанием основного вещества не менее 90%;

- Судан IV (CAS <*> 85-83-6) с содержанием основного вещества не менее 90%;

- Пара Ред (Para Red) (CAS <*> 6410-10-2) с содержанием основного вещества не менее 90%.

--------------------------------

<*> Идентификатор химического соединения в реестре химической реферативной службы (Chemical Abstracts Service, CAS).

Допускается применение других средств измерения и вспомогательного оборудования с техническими и метрологическими характеристиками не ниже указанных, а также реактивов и материалов не ниже указанной степени чистоты и по качеству не ниже указанных.

Отбор проб продовольственного сырья и пищевых продуктов проводят по ГОСТ 9792, ГОСТ 26313, ГОСТ 13341, ГОСТ 28876, ГОСТ 8756.0.

Пробу массой 1,000 г помещают во флакон вместимостью 20 см³ с завинчивающейся крышкой, добавляют 10 см³ ацетона, интенсивно встряхивают в течение 2 мин и выдерживают на ультразвуковой бане в течение 5 мин. Затем образец снова встряхивают и центрифугируют с относительным ускорением 5400 g. После центрифугирования надосадочную жидкость отбирают и фильтруют с помощью шприца в виалу через политетрафторэтиленовый (ПТФЭ) фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.

(0,0200 +/- 0,0005) г чистого вещества помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, добавляют 30 см³ этанола, интенсивно встряхивают, при необходимости выдерживают на ультразвуковой бане до полного растворения вещества. После этого объем доводят до метки этанолом. Полученный раствор содержит вещество в концентрации 0,2 мг/см³.

В мерную колбу на 50 см³ помещают по 1,25 см³ каждого основного раствора и доводят объем до метки 95% этанолом. Раствор фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм. Полученный раствор содержит каждое вещество в концентрации 5 мкг/см³.

В мерную колбу на 50 см³ помещают 0,5 см³ раствора с концентрациями 4 мкг/см³ и доводят объем до метки 95% этанолом. Полученный раствор содержит каждое вещество в концентрации 0,05 мкг/см³.

Приготовленные растворы хранят в прохладном месте в течение 1 мес.

Фаза А - ацетонитрил для жидкостной хроматографии. Срок и условия хранения - в соответствии с инструкцией изготовителя.

Примечание - Если в процессе хранения в реактив попадает воздух, то ацетонитрил предварительно дегазируют под вакуумом.

Приготовление фазы Б: при постоянном перемешивании добавляют в воду по каплям трифторуксусную кислоту до значения pH = 2,4 ед. pH, регистрируя показания pH-метра, и фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.

Подвижную фазу Б хранят в холодильнике при температуре 2 - 8 °C не более 3 мес. Перед началом анализа фаза Б доводится до температуры помещения.

При подготовке к проведению анализа и проведении анализа соблюдают следующие условия:

При проведении определения принимают во внимание, что красители чувствительны к световому и тепловому воздействиям. Определение проводят в месте, защищенном от действия прямого солнечного или ультрафиолетового излучения.

Включение и подготовку хроматографа к работе, вывод его на режим и выключение по окончании работы выполняют в соответствии с руководством по эксплуатации.

Перед проведением измерений хроматографическую систему кондиционируют подвижной фазой до установления стабильной базовой линии и давления в системе.

Хроматографические измерения проводят при следующих условиях:

- температура термостата колонки: (20 +/- 5) °C;

- объем вводимой пробы - 0,005 - 0,02 см³;

- скорость потока подвижной фазы 1,0 см³/мин;

- режим элюирования - в условиях градиента подвижной фазы.

Параметры градиентного элюирования (в условиях градиента подвижной фазы) приведены в таблице 1.

Регенерация колонки занимает не менее 9 мин. Общее время хроматографического анализа, проведенного при данной программе элюирования, составляет 30 мин.

Параметры работы диодно-матричного детектора:

- аналитическая длина волны: (504 +/- 4) нм;

- диапазон регистрации спектра: 200 - 700 нм;

- скорость опроса детектора: 2,5 Гц;

- ширина оптической щели: 4 нм.

При дозировании 5 мм³ раствора смеси с массовыми концентрациями непищевых красителей (приготовленного по 7.2) на уровне 5 мкг/см³ хроматографические параметры (за исключением времени удерживания) должны быть не меньше представленных в таблице 2. При дозировании 20 мм³ раствора с массовыми концентрациями непищевых красителей на уровне 0,05 мкг/см³ соотношения сигнал/шум должны быть не менее 3/1.

Порядок выхода и хроматографические параметры непищевых красителей Судан I - IV и Para Red приведены в таблице 2.

Пример хроматограммы смеси стандартов Судан I - IV и Para Red представлен в приложении А.

В инжектор хроматографа вводят 20 мм³ раствора пробы по 7.1 и проводят анализ в условиях, указанных в 9.1.2.

Идентификацию красителей на хроматограмме пробы осуществляют путем сравнения с временами удерживания и спектрами на хроматограмме красителей, полученной в 9.1.3 (порядок выхода красителей при анализе рабочих растворов должен соответствовать описанному в приложении А, примеры спектров красителей приведены в приложении Б). В случае обнаружения непищевых красителей в пробе проводят подтверждающий анализ методом хромато-масс-спектрометрии (по молекулярным массам непищевых красителей и их дочерних ионов) согласно таблице 3.

Примечание - Идентификация красителей Судан I - IV и Para Red только по времени удерживания не будет являться достоверной ввиду сложного состава исследуемых объектов и наличия в анализируемых продуктах природных компонентов, обладающих сходными спектральными характеристиками и хроматографическим поведением.

Хромато-масс-спектрометрический анализ проводят в условиях хроматографирования по 9.1.2 с параметрами работы масс-детектора по 9.2, используется масс-спектрометрический детектор типа ионная ловушка с ионизацией электроспреем (ESI).

В таблице 3 приведены основные параметры масс-детектирования (массы молекулярных ионов, энергия разрушения (параметр является рекомендательным, поскольку может зависеть от модели детектора), масса основных дочерних ионов). При регистрации хроматографических пиков (с соотношением сигнал/шум более 3) в данных условиях с временами удерживания, совпадающими с временами удерживания красителей, результат анализа является положительным.

Результат определения присутствия непищевых красителей в анализируемом продукте представляют в документах в виде

"Обнаружено присутствие непищевого красителя.....(наименование пищевого красителя)".

11.1 При выполнении работ необходимо соблюдать следующие требования:

- помещение лаборатории должно быть оборудовано общей приточно-вытяжной вентиляцией в соответствии с ГОСТ 12.4.021. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать норм, установленных ГОСТ 12.1.005;

- требования техники безопасности при работе с химическими реактивами в соответствии с ГОСТ 12.1.007;

- требования техники безопасности при работе с электроустановками в соответствии с ГОСТ Р 12.1.019.

Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.004 и быть оснащено средствами пожаротушения в соответствии с ГОСТ 12.4.009.

Работу по указанной методике могут исполнять специалисты, обладающие необходимыми специальными навыками и познаниями в области хроматомасс-спектрометрии и аналитической химии.