"ГОСТ Р 54414-2011. Национальный стандарт Российской Федерации. Рыба и продукция из нее. Видовая идентификация рыбы методом электрофореза с додецилсульфатом натрия в полиакриламидном геле"
(утв. и введен в действие Приказом Росстандарта от 22.09.2011 N 334-ст)

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ "О техническом регулировании", а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения".

1. Разработан Открытым акционерным обществом "Научно-исследовательский и проектно-конструкторский институт по развитию и эксплуатации флота" (ОАО "Гипрорыбфлот").

2. Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 299 "Консервы и пресервы из рыбы и нерыбных объектов, тара, методы контроля".

3. Утвержден и введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22 сентября 2011 г. N 334-ст.

4. Введен впервые.

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет.

Настоящий стандарт распространяется на отварную, копченую, соленую продукцию с массовой долей поваренной соли не более 5,5% и фаршевые изделия из рыбы, а также рыбу-сырец, охлажденную, мороженую, используемую для приготовления этой продукции, и устанавливает метод электрофореза с додецилсульфатом натрия в полиакриламидном геле (далее - SDS-электрофорез) для видовой идентификации рыбы.

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р 51652-2000 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия

ГОСТ Р 52840-2007 Рыба и продукция из нее. Видовая идентификация рыбы методом изоэлектрофокусирования в полиакриламидном геле.

ГОСТ Р 53228-2008 Весы неавтоматического действия. Часть первая. Метрологические и технические требования.

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 12.4.021-75 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования

ГОСТ 83-79 Реактивы. Натрий углекислый. Технические условия

ГОСТ 244-76 Натрия тиосульфат кристаллический. Технические условия

ГОСТ 1277-75 Реактивы. Серебро азотнокислое. Технические условия

ГОСТ 1625-89 Формалин технический. Технические условия

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 6259-75 Реактивы. Глицерин. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 19814-74 Кислота уксусная синтетическая и регенерированная. Технические условия

ГОСТ 26678-85 Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда. Общие технические условия

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ 31339-2006 Рыба, нерыбные объекты и продукция из них. Правила приемки и методы отбора проб.

Примечание. При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1. SDS-электрофорез: Метод электрофоретического разделения белков в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия.

3.3. стандартные белки: Белки с известной молекулярной массой (ММ).

3.4. референс-образец: Образец продукции, используемый в качестве стандарта при оценке результатов идентификации.

Метод основан на видовой специфичности белков мышечной ткани рыб и заключается в переводе белков исследуемого образца в раствор с помощью додецилсульфата натрия и дальнейшем разделении белковых молекул в соответствии с их молекулярной массой в градиентном полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Идентификацию проводят путем сравнения картин электрофоретического распределения белковых фракций анализируемого образца с соответствующим референс-образцом.

Для проведения анализа используют следующее оборудование, материалы и реактивы:

- универсальную модульную автоматизированную систему для разделения белков с использованием готовых гелевых сред в программируемом режиме и автоматической обработкой гелей (фиксация, окрашивание, отмывка), с контролем условий разделения (температуры, параметров тока) со следующими программными параметрами: напряжение от 10 до 2000 В, сила тока от 0,1 до 50,0 мА, мощность 7,0 Вт, температура от 0 °C до 70 °C или иное электрофоретическое оборудование для разделения белков методом SDS-электрофореза (далее - система);

- центрифугу рефрижераторную с частотой вращения не менее ;

- pH-метр - милливольтметр лабораторный pH - 673 М;

- пробирки центрифужные вместимостью 10 см3;

- аппликатор с капиллярными отверстиями объемом 1 мкл для внесения образцов в гель;

- микродозатор с переменным объемом дозирования: от 0,5 до 10,0 мм3 (шаг - 0,1 мм3, точность +/- (1,5 - 5,0)%, воспроизводимость от 1,0% до 5,0%);

- наконечники для микродозаторов (микропипеток) с переменным объемом дозирования жидкостей;

- ступку фарфоровую по ГОСТ 9147;

- штамп для образца с лунками вместимостью не менее 1,5 мкл;

- весы неавтоматического действия II класса точности с допускаемой погрешностью взвешивания не более +/- 0,001 г по ГОСТ Р 53228;

- холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда по ГОСТ 26678;

- колбы стеклянные мерные 2-50-2, 2-100-2 и 2-1000-2 по ГОСТ 1770;

- цилиндры стеклянные мерные лабораторные 1-50-2, 1-100-2 по ГОСТ 1770;

- пипетки стеклянные 1-1-2-5, 1-1-2-10 по ГОСТ 29227;

- полоски буферные из агарозы;

- гели градиентные полиакриламидные с додецилсульфатом натрия, 10% - 15%;

- пленку парафиновую;

- бумагу фильтровальную лабораторную по ГОСТ 12026;

- кислоту уксусную по ГОСТ 19814, х.ч.;

- спирт этиловый ректификованный по ГОСТ Р 51652, х.ч.;

- глицерин по ГОСТ 6259, ч.д.а.;

- 2-меркаптоэтанол, ч.д.а.;

- додецилсульфат натрия, х.ч.;

- краситель бромфеноловый синий, ч.д.а.;

- краситель кумасси R 250, ч.д.а.;

- трис(гидроксиметил)аминометан гидрохлорид, х.ч.;

- трис(гидроксиметил)аминометан, х.ч.;

- воду дистиллированную по ГОСТ 6709;

- альдегид глутаровый с содержанием основного компонента не менее 25%;

- серебро азотнокислое по ГОСТ 1277;

- натрий углекислый 12,5%-ный;

- натрия тиосульфат кристаллический по ГОСТ 244;

- формальдегид 37%-ный по ГОСТ 1625;

- набор стандартных белков для градуировки с известными молекулярными массами в диапазоне от 14400 до 97000 а.е.м.

Допускается использование других средств измерений и вспомогательного оборудования по метрологическим, техническим характеристикам и качеству не ниже указанных в настоящем стандарте.

Допускается использование других реактивов, в том числе импортных, по качеству и чистоте не ниже вышеуказанных.

Отбор проб проводят по ГОСТ 31339.

7.1. Экстрагирующий раствор

В мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 2 г додецилсульфата натрия и доводят объем до метки дистиллированной водой.

7.2. Буферный раствор

В мерную колбу вместимостью 50 см3 вносят 5 см3 водного раствора трис-буфера по 7.2.1, добавляют 4 см3 глицерина, 8 см3 10%-ного водного раствора додецилсульфата натрия, 2 см3 2-меркаптоэтанола и 2 см3 0,1%-ного водного раствора бромфенолового синего.

7.2.1. Приготовление водного раствора трис-буфера: в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 3 см3 раствора трис(гидроксиметил)аминометана молярной концентрацией 0,5 моль/дм3 и доводят объем до метки водным раствором трис(гидроксиметил)аминометан гидрохлорида молярной концентрацией 0,5 моль/дм3. Значение pH водного раствора трис-буфера должно составлять 6,8 +/- 0,01.

7.2.1.1. Приготовление водного раствора трис(гидроксиметил)аминометан гидрохлорида молярной концентрацией 0,5 моль/дм3: в мерную колбу вместимостью 1000 см3 вносят 78,5 г трис(гидроксиметил)аминометан гидрохлорида и доводят объем до метки дистиллированной водой.

7.2.1.2. Приготовление водного раствора трис(гидроксиметил)аминометана молярной концентрацией 0,5 моль/дм3: в мерную колбу вместимостью 1000 см3 вносят 60,5 г трис(гидроксиметил)аминометана и доводят объем до метки дистиллированной водой.

7.2.2. Приготовление 10%-ного водного раствора додецилсульфата натрия: в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 10 г додецилсульфата натрия и доводят объем до метки дистиллированной водой.

7.2.3. Приготовление 0,1%-ного водного раствора бромфенолового синего: в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 0,1 г бромфенолового синего и доводят объем до метки дистиллированной водой.

7.3. Растворы для обработки гелей при окрашивании раствором кумасси

7.3.1. Приготовление промывного раствора: в мерную колбу вместимостью 1000 см3 вносят 300 см3 96%-ного этилового спирта, добавляют 600 см3 дистиллированной воды и 100 см3 уксусной кислоты.

7.3.2. Окрашивающий раствор состоит из основного и рабочего.

7.3.2.1. Приготовление основного раствора: в мерную колбу вместимостью 300 см3 помещают 0,4 г кумасси, добавляют 80 см3 дистиллированной воды и перемешивают в течение 5 - 10 мин. Добавляют 120 см3 96%-ного этилового спирта и перемешивают еще 2 мин.

7.3.2.2. Приготовление рабочего раствора: в мерной колбе вместимостью не менее 100 см3 смешивают 50 см3 основного раствора с 50 см3 раствора 20%-ной уксусной кислоты.

7.3.2.3. Приготовление раствора 20%-ной уксусной кислоты: 20 см3 уксусной кислоты растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью 100 см3 и доводят до метки.

7.3.3. Приготовление консервирующего раствора: в мерную колбу вместимостью 1000 см3 вносят 40 см3 глицерина, 40 см3 уксусной кислоты и доводят объем до метки дистиллированной водой.

7.4. Растворы для обработки гелей при окрашивании серебром

7.4.1. Приготовление промывного раствора: в мерную колбу вместимостью 1000 см3 вносят 100 см3 96%-ного этилового спирта, добавляют 850 см3 дистиллированной воды и 50 см3 уксусной кислоты.

7.4.2. Приготовление окрашивающего раствора: в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят (0,15 +/- 0,001) г азотнокислого серебра и доводят объем дистиллированной водой до метки.

7.4.3. Приготовление раствора, усиливающего окраску: в мерной колбе вместимостью 100 см3 смешивают 30 см3 25%-ного глутарового альдегида и 60 см3 дистиллированной воды.

7.4.4. Приготовление раствора, развивающего окраску: в мерную колбу вместимостью 1000 см3 вносят 200 см3 12,5%-ного раствора углекислого натрия, 800 см3 дистиллированной воды и 0,4 см3 37%-ного формальдегида.

7.4.5. Приготовление раствора, останавливающего окраску: в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят (1,60 +/- 0,01) г тиосульфата натрия и (3,70 +/- 0,01) г трис(гидроксиметил)аминометан гидрохлорида и доводят объем дистиллированной водой до метки.

7.4.6. Приготовление консервирующего раствора: в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 10 см3 глицерина и доводят объем до метки дистиллированной водой.

7.5. Растворы могут храниться в течение месяца при комнатной температуре. Рабочий раствор готовят в день использования.

В качестве референс-образца для видовой идентификации рыбы, в том числе в составе рыбной продукции, в соответствии с областью применения настоящего стандарта могут быть использованы: соответствующий образец рыбы-сырца (для однокомпонентных продуктов) или образец, приготовленный по технологии аналогичной технологии изготовления анализируемого образца (для одно- и многокомпонентных продуктов).

9.1. Подготовка образцов к анализу

Пробы анализируемого образца и референс-образца готовят в идентичных условиях.

9.1.1. Мышечную ткань анализируемого образца массой не менее 1 г измельчают в ступке.

9.1.2. Пробу анализируемую образца по 9.1.1 отбирают массой (0,50 +/- 0,01) г в центрифужные пробирки вместимостью 10 см3 и заливают 2 см3 2%-ного водного раствора додецилсульфата натрия по 7.1, смесь периодически перемешивают в течение 30 мин.

9.1.3. Смесь, полученную по 9.1.2, центрифугируют при частоте вращения при температуре 20 °C в течение 15 мин.

9.1.4. Надосадочную жидкость, полученную по 9.1.3, фильтруют через бумажный фильтр и отбирают в стеклянные пробирки вместимостью 10 см3 по 0,25 см3 фильтрата.

9.1.5. К раствору, полученному по 9.1.4, добавляют 1,5 см3 буферного раствора, приготовленного по 7.2, и нагревают на кипящей водяной бане в течение 5 мин. Полученный раствор охлаждают до комнатной температуры, при необходимости фильтруют и используют для проведения электрофореза.

9.2. Приготовление раствора стандартных белков

9.2.1. Набор стандартных белков для градуировки с известной молекулярной массой растворяют в 1,5 см3 буферного раствора, приготовленного по 7.2, и нагревают на кипящей водяной бане в течение 5 мин. Полученный раствор охлаждают до комнатной температуры и используют для проведения электрофореза.

9.2.1.1. Для видовой идентификации рыбы методом SDS-электрофореза используется набор стандартных белков для градуировки с молекулярной массой от 14400 до 97000 а.е.м. промышленного производства в виде сухой замороженной смеси.

9.2.1.2. Для автоматизированной разделительной системы используется набор белков с общей массой 100 мкг:

- фосфорилаза Б с молекулярной массой 97000 а.е.м.;

- альбумин с молекулярной массой 66000 а.е.м.;

- овальбумин с молекулярной массой 45000 а.е.м.;

- карбоангидраза с молекулярной массой 30000 а.е.м.;

- ингибитор трипсина с молекулярной массой 20100 а.е.м.;

- альфа-лактальбумин с молекулярной массой 14400 а.е.м.

9.3. Проведение SDS-электрофореза

9.3.1. Полиакриламидный гель помещают в систему в соответствии с инструкцией по эксплуатации.

9.3.2. Вставляют буферные полоски в отделения держателя буферных полосок: одну - в отделение катода и одну - в отделение анода.

9.3.3. Электроды устанавливают в верхнем положении.

9.3.4. Формируют лунки в парафиновой пленке с помощью штампа: штамп с лунками, обращенными вверх, кладут на стол, накрывают парафиновой пленкой защитным слоем вверх (по направлению линий отверстий), в парафиновой пленке, двигаясь вдоль линии лунок, делают углубления при помощи стеклянной палочки, а затем снимают защитный слой.

9.3.5. Растворы, т.е. раствор анализируемого образца и аналогично приготовленный раствор референс-образца, полученные по 9.1.5, а также раствор стандартных белков для градуировки с известной молекулярной массой, приготовленный по 9.2, вносят микродозатором в каждую лунку 1,5 мкл.

9.3.6. Аппликатор опускают на поверхность растворов (стандартных белков для градуировки, анализируемого образца и референс-образцов), помещенных в лунки по 9.3.5, сформированные в парафиновой пленке с помощью штампа по 9.3.4, нарушая поверхность капель для заполнения капилляров.

9.3.7. Аппликатор, наполненный образцами по 9.3.6, помещают в систему со стороны катода и проводят электрофорез в автоматическом режиме в соответствии с инструкцией к системе.

Условия разделения: напряжение 220 В, ток 10 мА, мощность 2,5 Вт, температура 15 °C. Когда разделение закончено, гель вынимают и переносят в камеру окрашивания. Окончанием разделения служит звуковой сигнал, подаваемый системой.

9.4. Проведение окрашивания

Полиакриламидные гели окрашивают в автоматическом режиме с применением кумасси в соответствии с таблицей 1 или азотнокислого серебра в соответствии с таблицей 2.

Процесс окрашивания занимает от 30 до 50 мин. Затем полиакриламидные гели вынимают из системы и высушивают при температуре от 20 °C до 25 °C в течение 4 ч.

10.1. Полученную картину электрофоретического распределения белковых фракций анализируемой пробы сравнивают с картиной распределения белковых фракций референс-образца.

10.2. Строят графическую зависимость значений молекулярных масс стандартных белков от расстояния каждой белковой фракции до катода.

10.3. Измеряют расстояние от катода до локализации белков анализируемого образца и референс-образца и с помощью калибровочного графика, построенного по 10.2, находят соответствующие значения молекулярных масс белков. Графическое построение и определение молекулярных масс может осуществляться или с помощью компьютерной программы после переноса изображения распределения белковых фракций с полиакриламидного геля на монитор компьютера с использованием систем видеодокументирования, или ручным способом путем измерений расстояний с помощью линейки от катода до каждой белковой фракции.

10.4. Совпадение картин распределения белковых фракций и совпадение значений молекулярных масс маркерных белков анализируемого образца и референс-образцов свидетельствует об их идентичности и подтверждает правильность заявленного наименования анализируемого образца. Примеры результатов анализа и их компьютерной обработки для разных видов анализируемых объектов приведены в Приложениях А и Б.

10.5. Для подтверждения результатов идентификации проводят параллельное разделение белков как из одной пробы, так и из идентичных проб, полученных из двух - трех образцов анализируемого объекта.

10.6. Результаты анализа оформляют в виде протокола. Образец протокола приведен в Приложении В.

При выполнении измерений в лаборатории должны быть соблюдены следующие условия:

- температура окружающего воздуха (22 +/- 5) °C;

- атмосферное давление от 84,0 до 106,7 кПа;

- влажность воздуха не более 80% при 25 °C;

- напряжение в сети (220 +/- 10) В;

- частота переменного тока в сети питания (50 +/- 1) Гц.

12.1. При выполнении работ с химическими реактивами необходимо соблюдать требования техники безопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.007.

12.2. Помещение, в котором проводятся работы, должно быть оборудовано общей приточно-вытяжной вентиляцией по ГОСТ 12.4.021. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать норм, установленных ГОСТ 12.1.005.

12.3. При работе с электроустановками электробезопасность должна соответствовать требованиям ГОСТ 12.1.019. Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности ГОСТ 12.1.004 и быть оснащено средствами пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.

А.1. Пример картины распределения белковых фракций на электрофореграмме приведен на рисунке А.1 (разделение и окрашивание белков на геле было проведено на системе PhastSystem, перенос изображения на компьютер и обработка данных были проведены с помощью системы видеодокументирования ImageMaster VDS и компьютерной программы ImageMaster 1D).

А.2. График, полученный в результате компьютерной обработки электрофореграммы набора стандартных белков для градиентного геля 10% - 15%, приведен на рисунке А.2.

А.3. Пример компьютерной обработки электрофореграмм при анализе значений молекулярных масс белков анализируемого образца и референс-образцов приведен в таблице А.1.

А.4. Обобщение результатов анализа для определения вида рыбы в анализируемом образце рыбных палочек - по рисункам А.1, А.2 и таблице А.1.

А.4.1. В результате SDS-электрофореза выделенных белков мышечной ткани референс-образцов из разных видов рыб получены отличающиеся друг от друга картины распределения белковых фракций.

А.4.2. У анализируемого образца распределение маркерных белков и значения молекулярных масс совпадают с локализацией основных белков референс-образца из путассу и их значениями ММ. Таким образом, можно сделать вывод, что анализируемый образец рыбных палочек приготовлен из путассу.

Б.1. Пример картины распределения белковых фракций на электрофореграмме приведен на рисунке Б.1 (разделение и окрашивание белков на геле было проведено на системе PhastSystem, перенос изображения на компьютер и обработка были проведены с помощью системы видеодокументирования ImageMaster VDS и компьютерной программы ImageMaster).

Б.2. График, полученный в результате компьютерной обработки электрофореграммы набора стандартных белков для градиентного геля 10% - 15%, приведен на рисунке Б.2.

Б.3. Пример компьютерной обработки электрофореграмм при анализе значений молекулярных масс белков анализируемого образца и референс-образцов приведен в таблице Б.1.

Б.4. Обобщение результатов анализа для определения вида анализируемого образца - по рисункам Б.1, Б.2 и таблице Б.1.

Б.4.1. В результате SDS-электрофореза выделенных белков мышечной ткани референс-образцов из двух видов рыб видно, что у горбуши (так же, как и у семги) локализация маркерных белков и значение их молекулярных масс для рыбы-сырца и отварного образца совпадают.

Б.4.2. У анализируемого образца распределение маркерных белков и значения их молекулярных масс полностью совпадают с локализацией основных белков и значениями их молекулярных масс референс-образцов из горбуши-сырца и в отварном виде. Таким образом, можно сделать вывод, что анализируемый образец отварной рыбы приготовлен из горбуши.

В качестве референс-образца могут быть использованы как рыба-сырец, так и отварная рыба.

Заключение распространяется на образец, представленный на испытания.