"ГОСТ Р 54684-2011. Национальный стандарт Российской Федерации. Продукция соковая. Определение органических кислот методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(утв. и введен в действие Приказом Росстандарта от 13.12.2011 N 843-ст)

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ "О техническом регулировании", а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения".

1. Разработан Некоммерческой организацией "Российский союз производителей соков" (РСПС) при участии Федерального государственного бюджетного учреждения "Научно-исследовательский институт питания" Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИ питания" РАМН) и Закрытого акционерного общества "Мултон" (ЗАО "Мултон").

2. Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 93 "Продукты переработки фруктов, овощей и грибов".

3. Утвержден и введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 13 декабря 2011 г. N 843-ст.

4. Введен впервые.

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемых информационных указателях "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет.

Настоящий стандарт распространяется на фруктовые и овощные соки, нектары, морсы и сокосодержащие напитки, фруктовые и овощные концентрированные соки, пюре и концентрированные пюре, морсы и концентрированные морсы, соковую продукцию из фруктов и овощей обогащенную и для детского питания (далее - соковая продукция) и устанавливает метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) для определения массовой концентрации или массовой доли суммы свободных форм и солей следующих органических кислот: щавелевой, винной, хинной, яблочной, изолимонной, лимонной, молочной, шикимовой, янтарной и фумаровой в диапазонах измерений, приведенных в таблице 6. Органические кислоты, имеющие оптические изомеры, детектируются в виде суммы их энантиомеров (D- и L-форм). Измерение отдельных форм оптических изомеров не входит в область применения настоящего стандарта.

ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения

ГОСТ Р 53228-2008. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ Р 53693-2009. Продукция соковая. Определение аскорбиновой кислоты методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

ГОСТ Р 12.1.019-2009. Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ 12.1.004-91. Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005-88. Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007-76. Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.018-93. Система стандартов безопасности труда. Пожаровзрывобезопасность статического электричества. Общие требования

ГОСТ 245-76. Реактивы. Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный. Технические условия

ГОСТ 908-2004. Кислота лимонная моногидрат пищевая. Технические условия

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80). Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 2493-75. Реактивы. Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный. Технические условия

ГОСТ 6552-80. Реактивы. Кислота ортофосфорная. Технические условия

ГОСТ 6709-72. Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 12026-76. Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 21400-75. Стекло химико-лабораторное. Технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 22967-90 (СТ СЭВ 2486-80, СТ СЭВ 3399-81). Шприцы медицинские инъекционные многократного применения. Общие технические требования и методы испытаний

ГОСТ 25336-82. Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26313-84. Продукты переработки плодов и овощей. Правила приемки, методы отбора проб.

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

Метод основан на применении обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Массовая концентрация (массовая доля) органических кислот в соковой продукции определяется спектрофотометрическим или диодноматричным детектором при длине волны 210 нм.

4.1. Хроматограф жидкостный со спектрофотометрическим или диодноматричным детектором (рабочий диапазон длин волн поглощения от 200 до 600 нм), хроматографической колонкой и программно-аппаратным комплексом сбора и обработки результатов.

4.2. Детектор спектрофотометрический, позволяющий проводить измерения оптической плотности при длине волны 210 нм с проточной кюветой рабочим объемом не более 20 мм3 со следующими метрологическими характеристиками:

или диодноматричный детектор с метрологическими характеристиками:

4.3. Колонки хроматографические:

- колонка аналитическая длиной 250 мм и размером внутреннего диаметра 4,6 мм, заполненная силикагелем, химически связанным с октадецилсиланом (RP или C18), с размером частиц 5 мкм <1>;

- колонка аналитическая длиной 300 мм и размером внутреннего диаметра 4,6 мм, заполненная силикагелем с привитыми группами C18, с блокированными остаточными силанольными группами (энд-кэппинг), привитыми дополнительно полярными группами C3 (замещенный аминопропил), с размером частиц 5 мкм <2>.

--------------------------------

<1> Сорбенты марок "Phenomenex Luna (2)", "Atlantis dC18" апробированы и обеспечивают требуемую эффективность хроматографического разделения. Данная информация не является рекламой указанных сорбентов и не исключает возможность применения других сорбентов.

<2> Сорбент марок "Allure Organic acids" апробирован и обеспечивает требуемую эффективность хроматографического разделения. Данная информация не является рекламой указанного сорбента и не исключает возможность применения других сорбентов.

4.4. Посуда мерная лабораторная стеклянная по ГОСТ 1770:

- цилиндры 1-50-2 и 1-1000-2;

- колбы мерные 4-25-2, 4-50-2, 4-100-2, 4-500-2 и 4-1000-2;

- пробирки 1-10-0,1 ХС и 1-20-0,1 ХС.

4.5. Емкости для жидких проб (виалы) вместимостью 2 - 6 см3.

4.6. Установка для дегазации растворителей и подвижной фазы (элюента).

4.7. Мини-насос лабораторный (к установке для дегазации элюента).

4.8. Фильтры мембранные с размером диаметра пор 0,20 и 0,45 мкм для фильтрования подвижной фазы и проб.

4.9. Посуда лабораторная стеклянная по ГОСТ 25336:

- колбы плоскодонные П-2-1000;

- колбы конические Кн-2-1000;

- стаканы В-1-50, В-1-100 и В-2-1000;

- воронки лабораторные.

4.10. Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.

4.11. Шприц медицинский вместимостью 5 см3 по ГОСТ 22967.

4.12. Центрифуга лабораторная с величиной фактора разделения (g-фактор) 800 - 1000.

4.13. Магнитная мешалка ММ-01 лабораторная.

4.14. Иономер (pH-метр) с погрешностью измерения +/- 0,01 ед. pH.

4.15. Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

4.16. Калий фосфорнокислый двузамещенный (дигидрофосфат) , безводный.

4.17. Калий фосфорнокислый двузамещенный (дигидрофосфат) по ГОСТ 2493.

4.18. Кислота ортофосфорная массовой долей основного вещества 98%, ч.д.а., по ГОСТ 6552.

4.19. Ацетонитрил, ч.д.а.

4.20. Моногидрат лимонной кислоты массовой долей основного вещества 99,5%, ч.д.а., по ГОСТ 908.

4.21. Органические кислоты:

- винная кислота массовой долей основного вещества не менее 99,5%, ч.д.а., или по [1];

- хинная кислота массовой долей основного вещества не менее 98,0%, ч.д.а., или по [1];

- шикимовая кислота массовой долей основного вещества не менее 97,0%, ч.д.а., или по [1];

- L-молочная кислота массовой долей основного вещества не менее 90,5%, ч.д.а., или по [1];

- D, L-изолимонной кислоты тринатриевая соль массовой долей основного вещества не менее 93,0%, ч.д.а., или по [1];

- фумаровая кислота массовой долей основного вещества не менее 99,5%, ч.д.а., или по [1];

- яблочная кислота массовой долей основного вещества не менее 99,5%, ч.д.а., или по [1];

- кислота щавелевая, 2-водная массовой долей основного вещества не менее 99,0%, ч.д.а., или по [1];

- кислота янтарная массовой долей основного вещества не менее 99,0%, ч.д.а., или по [1].

4.22. Весы по ГОСТ Р 53228, обеспечивающие точность однократного взвешивания с пределами абсолютной допускаемой погрешности не более +/- 0,08 мг.

Допускается применение средств измерений и вспомогательного оборудования с метрологическими и техническими характеристиками, а также реактивов и материалов по качеству не ниже вышеуказанных.

5.1. Отбор проб - по ГОСТ 26313.

6.1. Приготовление подвижной фазы для жидкостной хроматографии

Для приготовления фосфатного буферного раствора молярной концентрации 0,1 моль/дм3 13,6 г дигидрофосфата калия безводного по 4.16 или 3-водного дигидрофосфата калия по 4.17, в пересчете на безводный, помещают в коническую колбу по 4.9 вместимостью 1000 см3 и растворяют в дистиллированной воде при перемешивании на магнитной мешалке по 4.13. Затем доводят кислотность полученного раствора до значения 2,2 - 2,6 ед. pH, прибавляя по каплям концентрированную ортофосфорную кислоту по 4.18 при непрерывном перемешивании на магнитной мешалке по 4.13.

Готовый буферный раствор переносят в мерную колбу по 4.4 вместимостью 1000 см3, доводят до метки и тщательно перемешивают. Полученный раствор отфильтровывают и дегазируют на установке 4.6 через мембранный фильтр с размером диаметра пор 0,45 мкм.

Срок хранения готового буферного раствора при комнатной температуре - 3 сут.

6.2. Подготовка проб для измерений

Подготовка проб для измерений - в соответствии с ГОСТ Р 53693 (подраздел 6.2).

6.3. Приготовление стандартных градуировочных растворов органических кислот

Приготовление стандартных градуировочных растворов анализируемого ряда органических кислот делят на три группы в соответствии с диапазоном определяемых кислот, приведенных в таблице 1.

6.3.1. Приготовление основных стандартных градуировочных растворов органических кислот группы А

6.3.1.1. Приготовление основного стандартного раствора N 1А

Взвешивают на лабораторных весах по 1,25 г лимонной, яблочной, хинной и винной кислот с точностью до второго десятичного знака, растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе на 250 см3.

Массовая концентрация полученного основного стандартного раствора кислот 1А составляет 5,0 г/дм3.

6.3.2. Приготовление основных стандартных градуировочных растворов органических кислот групп Б и В

6.3.2.1. Приготовление основных стандартных растворов N 1Б и N 1В

Взвешивают на лабораторных весах по 0,25 г щавелевой, изолимонной, молочной и янтарной кислот (с точностью до второго десятичного знака), по 0,025 г шикимовой и фумаровой кислот (с точностью до третьего десятичного знака), растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе объемом 250 см3.

Массовая концентрация полученных основных стандартных растворов 1Б (щавелевой, изолимонной, молочной, янтарной кислот) составляет по 1,0 г/дм3, а растворов 1В (шикимовой и фумаровой кислот) - по 0,1 г/дм3 соответственно.

Основные стандартные градуировочные растворы хранят при температуре от 2 °C до 6 °C в течение одного месяца.

6.3.3. Приготовление стандартных градуировочных растворов органических кислот

Стандартные градуировочные растворы органических кислот готовят для одновременного построения четырех градуировочных зависимостей по четырем точкам, от меньшей массовой концентрации (массовой доли) определяемой кислоты к большей, из основного стандартного раствора по 6.3.1.1 и 6.3.2.1 в соответствии с таблицами 2 - 4.

Стандартные градуировочные растворы органических кислот готовят непосредственно перед проведением измерений.

6.4. Построение градуировочной зависимости

Процедуры построения градуировочной зависимости выполняют в соответствии с руководством по эксплуатации оборудования и руководством пользователя программным обеспечением.

Хроматограммы обрабатывают в соответствии с руководством пользователя программно-аппаратным комплексом сбора и обработки данных.

Регистрируется площадь пиков соответствующих кислот. Площадь пиков рассматриваемых кислот стандартных растворов S (mAU x с или AU x с) и их массовая концентрация (массовая доля) , находятся в соответствующей функциональной зависимости

где k - градуировочный коэффициент, mAU x с/г/дм3.

Градуировочные коэффициенты k рассчитывают по результатам анализа стандартных растворов с помощью программно-аппаратного комплекса сбора и обработки данных или при его отсутствии в составе хроматографа по методу наименьших квадратов, полагая свободный член в уравнении регрессии равным нулю:

где - площадь пика соответствующей кислоты при анализе i-го стандартного раствора;

- массовая концентрация (массовая доля) кислоты при анализе i-го стандартного раствора, г/дм3 

Градуировочная зависимость строится при смене оборудования, колонок, условий хроматографического анализа или при выявлении несоответствия метрологическим требованиям результатов оперативного контроля или внутреннего аудита.

Проверку градуировочной зависимости по стандартным растворам, соответствующим двум точкам диапазона измерений, проводят в день выполнения анализов перед началом работ. В случае обнаружения отклонения результатов измерения массовой концентрации (массовой доли) кислот в стандартных растворах более чем на 3,2% строят новую градуировочную зависимость во всем диапазоне измерений.

7.1. Условия хроматографического анализа

Элюент: фосфатный буферный раствор молярной концентрации 0,1 моль/дм3 с 2,2 - 2,6 ед. pH по 6.1.

Температура колонки: 20 °C или температура окружающего воздуха (25 +/- 5) °C.

Длина волны спектрофотометрического детектора: 210 нм.

Диапазон длин волн диодноматричного детектора: 200 - 600 нм.

Скорость потока подачи элюента: 0,8 - 1 см3/мин (ориентировочное значение).

Объем вводимой пробы: 5 - 10 мкл.

Время выхода органических кислот при ВЭЖХ характеризуется коэффициентом емкости K', который не зависит от скорости подачи элюента. Коэффициенты емкости рассчитывают по формуле:

где - время удерживания аналита, мин,

- мертвый объем колонки, мин.

Примерные значения коэффициентов емкости основных органических кислот, определяемых в соковой продукции, представлены в таблице 5.

Примечание - Вводимые объемы стандартного градуировочного раствора при градуировке и анализируемой пробы должны быть одинаковыми.

7.2. Условия проведения измерений

Измерения проводят при следующих лабораторных условиях:

- температура окружающего воздуха (25 +/- 5) °C;

- атмосферное давление (97 +/- 10) кПа;

- относительная влажность (65 +/- 15)%;

- частота переменного тока (50 +/- 5) Гц;

- напряжение в сети (220 +/- 10) В.

7.3. Анализ проб

Проводят хроматографический анализ проб, подготовленных по 6.2. Анализ проводят на двух параллельных пробах при соблюдении всех остальных условий повторяемости в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 5725-1 (подраздел 3.14). Регистрируют площадь пиков органических кислот. В случае если массовая концентрация (массовая доля) органической кислоты в пробе настолько максимальна, что площадь соответствующего пика выходит за верхнюю границу диапазона градуировки хроматографа, то подготавливают новую пробу с другим разбавлением и измерение повторяют.

Перед проведением анализа хроматографическую систему кондиционируют подвижной фазой до установления стабильной базовой линии.

В случае взаимного влияния отдельных кислот друг на друга для более эффективного разделения допускается последовательное соединение двух колонок по 4.3 для хроматографического разделения всего перечня органических кислот по 4.21. В этом случае требуется построение дополнительной градуировочной зависимости для данной системы последовательно соединенных колонок.

Хроматографическая система должна обеспечивать удовлетворительное разделение основных пиков.

Примеры хроматограмм основных органических кислот приведены в Приложении А.

Массовую концентрацию (массовую долю) органических кислот рассчитывают по градуировочным зависимостям с учетом степени разведения пробы. Вычисления массовой концентрации или массовой доли проводят до третьего десятичного знака.

Обработку хроматограмм и определение массовой концентрации (массовой доли) определяемой органической кислоты c(X), г/дм3 , проводят с помощью программно-аппаратного комплекса сбора и обработки данных, с использованием градуировочной зависимости

или по формулам с использованием стандартного раствора с массовой концентрацией (массовой долей) определяемой органической кислоты, наиболее близкой к ожидаемой в анализируемой пробе:

где - площадь пика органической кислоты, mAU x с или U x с;

- вместимость мерной колбы, взятой для разбавления, см3;

k - градуировочный коэффициент, 

- объем пробы, отобранный для анализа, см3;

- масса анализируемой пробы после разбавления, г;

m(x) - масса анализируемой пробы до разбавления, г;

- массовая концентрация или массовая доля органической кислоты в стандартном растворе, г/дм3 ;

- площадь пика органической кислоты в стандартном растворе, mAU x с или U x с.

Все результаты обработки (с помощью программно-аппаратного комплекса или расчетные) должны сходиться.

Расхождение результатов между двумя параллельными определениями (в процентах от среднего значения), выполненными в условиях повторяемости, не должно превышать предела повторяемости (сходимости) , приведенного в таблицах 7 - 9, при вероятности P = 0,95.

При соблюдении этого условия за окончательный результат определения принимают среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений , округленное до второго десятичного знака, при определении фумаровой кислоты в диапазоне измерений от 0,001 до 0,010 мг/дм3 за окончательный результат принимают среднеарифметическое значение двух параллельных определений, округленное до третьего десятичного знака.

Диапазоны измерений массовой концентрации или массовой доли органических кислот в соковой продукции приведены в таблице 6.

Границы относительной погрешности определения массовой концентрации (массовой доли) анализируемых кислот при соблюдении условий, регламентированных настоящей методикой, при вероятности P = 0,95 не должны превышать значений, приведенных в таблицах 7 - 9.

Расхождение между двумя результатами измерений (в процентах среднего значения), полученными в условиях воспроизводимости, не должно превышать предела воспроизводимости , приведенного в таблицах 7 - 9 при P = 0,95.

Окончательный результат определения массовой концентрации или массовой доли органической кислоты представляют в следующем виде

где - среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений массовой концентрации или массовой доли органической кислоты, г/дм3 или ;

- границы абсолютной погрешности определений массовой концентрации или массовой доли органической кислоты, г/дм3 или , рассчитанные по формуле

где - границы относительной погрешности в соответствии с таблицами 7 - 9.

9.1. Контроль повторяемости (сходимости) результатов определений

Контроль повторяемости (сходимости) результатов определений проводят при получении каждого результата определения путем сравнения расхождения между результатами двух параллельных определений с пределом повторяемости (сходимости), приведенным в таблицах 7 - 9.

Сходимость результатов определения признают удовлетворительной при условии

При превышении предела повторяемости (сходимости) определение повторяют. При повторном превышении указанного предела выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и их устраняют.

9.2. Контроль погрешности (точности) результатов определений

Контроль погрешности (точности) результатов определений осуществляют методом добавок с использованием реальных проб продукции. Масса пробы должна соответствовать удвоенному количеству, необходимому для проведения определения. Пробу делят на две равные части. В одну из них добавляют стандарты органических кислот в таких количествах, чтобы добавка составляла 50% - 150% исходного содержания компонента в пробе, но не превышала верхней границы диапазона определения массовой концентрации (массовой доли) компонента с учетом границ погрешности определения (таблицы 7 - 9). Обе части пробы анализируют в точном соответствии с методом.

Результаты контрольных определений признают удовлетворительными, если погрешность определения массовых концентраций (массовых долей) кислот в добавке не превышает норматива контроля погрешности (точности), то есть выполняется условие

где - среднеарифметическое значение двух параллельных определений пробы с добавкой, г/дм3 или ;

- среднеарифметическое значение двух параллельных определений пробы без добавки, г/дм3 или ;

- величина добавки, г/дм3 или ;

- норматив контроля погрешности, г/дм3 или .

При проведении внутрилабораторного контроля (P = 0,95) значение рассчитывают по формуле:

При проведении внешнего контроля (P = 0,95) значение рассчитывают по формуле:

где - границы относительной погрешности определения массовых концентраций кислот, указанные в таблицах 7 - 9, %.

При превышении норматива контроля погрешности проводят повторные контрольные определения. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и их устраняют.

Периодичность контроля погрешности (точности) устанавливается самой лабораторией с учетом фактического состояния работ. При смене партий реактивов, экземпляров средств измерений и стандартов проведение контроля погрешности обязательно.

10.1. Условия безопасного проведения работ

При работе с химическими реактивами следует соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами, по ГОСТ 12.1.005 и ГОСТ 12.1.007. При подготовке проб к анализу и выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдают правила пожаровзрывобезопасности по ГОСТ 12.1.018, электробезопасности - по ГОСТ Р 12.1.019 и инструкции по эксплуатации прибора.

10.2. Требования к квалификации операторов

К выполнению испытаний и обработке результатов допускается инженер-химик, техник или лаборант, имеющий высшее или специальное образование, опыт работы в химической лаборатории и изучивший инструкцию по эксплуатации жидкостного хроматографа. Первое применение метода в лаборатории должно проводиться под руководством специалиста, владеющего теорией высокоэффективной жидкостной хроматографии и имеющего практические навыки в этой области.

А.1. Примеры хроматограмм органических кислот приведены на рисунках А.1 - А.3.

Условия хроматографирования: 0,1 М фосфатный буфер, 2,4 ед. pH, скорость элюирования 1,0 мл/мин.

Условия хроматографирования: 0,2 М фосфатный буфер = 2,2 ед. pH.

Массовая концентрация кислот на хроматограмме: хинная - 1,2 мг/см3, яблочная - 0,8 мг/см3, шикимовая - 1,8 мг/см3, лимонная - 2,1 мг/см3.