"ГОСТ Р 54685-2011. Национальный стандарт Российской Федерации. Продукция соковая. Определение фумаровой кислоты методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(утв. и введен в действие Приказом Росстандарта от 12.12.2011 N 844-ст)

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ "О техническом регулировании", а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения".

1. Разработан Некоммерческой организацией "Российский союз производителей соков" (РСПС).

2. Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 93 "Продукты переработки фруктов, овощей и грибов".

3. Утвержден и введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 13 декабря 2011 г. N 844-ст.

4. В настоящем стандарте учтены:

- основные положения международного стандарта CODEX-STAN 247-2005 "Общий стандарт на фруктовые соки и нектары" (CODEX-STAN 247-2005 "Codex general standard for fruit juices and nectars") в части методов анализа и отбора проб соковой продукции;

- основные нормативные положения и метрологические характеристики документа ИФУ 72 (1998) "Метод определения фумаровой кислоты с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии" (Международная федерация производителей фруктовых соков) [IFU-Analyses Nr. 72 (1998) "Fumaric acid (HPLC)", (International Federation of Fruit Juice Produces)].

5. Введен впервые.

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемых информационных указателях "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет.

Настоящий стандарт распространяется на фруктовые и овощные соки, нектары, морсы и сокосодержащие напитки, фруктовые и овощные концентрированные соки, пюре и концентрированные пюре, морсы и концентрированные морсы, соковую продукцию из фруктов и овощей обогащенную и для детского питания (далее - соковая продукция) и устанавливает метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) для определения массовой концентрации или массовой доли фумаровой кислоты.

Нижний предел измерений массовой концентрации (массовой доли) фумаровой кислоты составляет . Верхний предел измерений массовой концентрации (массовой доли) фумаровой кислоты - .

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р 12.1.019-2009 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения

ГОСТ Р 52501-2005 Вода для лабораторного анализа. Технические условия

ГОСТ Р 53228-2008 Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ Р 53693-2009 Продукция соковая. Определение аскорбиновой кислоты методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.018-93 Система стандартов безопасности труда. Пожаровзрывобезопасность статического электричества. Общие требования

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 4204-77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26313-84 Продукты переработки плодов и овощей. Правила приемки, методы отбора проб

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

Примечание. При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

Метод основан на применении высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Массовую концентрацию или массовую долю фумаровой кислоты в соковой продукции определяют с применением спектрофотометрического детектора в ультрафиолетовой области спектра при длине волны 210 нм.

Отбор проб - по ГОСТ 26313.

5.1. Хроматограф жидкостный со спектрофотометрическим детектором (рабочий диапазон длин волн поглощения от 200 до 600 нм) или УФ-детектором, аналитической колонкой и программно-аппаратным комплексом сбора и обработки результатов.

5.2. Колонка аналитическая, длиной 300 мм и внутренним размером диаметра 7,8 мм, заполненная сорбентом на основе сополимера стирола с дивинилбензолом с привитыми сульфокислотными группами, снабженная предколонкой длиной 30 мм и внутренним диаметром 4,6 мм, заполненной тем же сорбентом.

5.3. Детектор спектрофотометрический, позволяющий производить измерения оптической плотности при длине волны 210 нм с проточной кюветой рабочим объемом не более 10 мм3 со следующими метрологическими характеристиками:

- пределы допускаемой абсолютной погрешности измерений по шкале длин волн +/- 0,2 нм; пределы допускаемой воспроизводимости измерений по шкале длин волн +/- 0,08 нм ;

- пределы допускаемой абсолютной погрешности измерений по фотометрической шкале +/- 0,002 при оптической плотности 0,3 и +/- 0,003 при оптической плотности 1;

- пределы допускаемой воспроизводимости измерений по фотометрической шкале +/- 0,0008 при оптической плотности 1.

5.4. Весы по ГОСТ Р 53228, обеспечивающие точность взвешивания с пределами абсолютной допускаемой погрешности +/- 0,1 мг.

5.5. Пипетки градуированные 1-2-2-1, 1-2-2-2, 1-2-2-5 и 1-2-2-10 по ГОСТ 29227.

5.6. Посуда мерная лабораторная стеклянная 2-го класса точности по ГОСТ 1770:

- цилиндры 1-50-2 и 1-1000-2;

- колбы мерные с притертой пробкой 4-50-2, 4-500-2 и 4-1000-2;

- пробирки стеклянные 1-10-0,1 ХС и 1-20-0,1 ХС.

5.7. Посуда лабораторная стеклянная по ГОСТ 25336:

- воронки лабораторные;

- стаканы В-1-50, В-1-100 и В-2-1000.

5.8. Фильтры мембранные с размером диаметра пор 0,45 мкм для фильтрования подвижной фазы и проб.

5.9. Фильтры обеззоленные по [1].

5.10. Центрифуга лабораторная с величиной фактора разделения (g-фактор) 1000 - 4000.

5.11. Баня ультразвуковая.

5.12. Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.

5.13. Вода для лабораторного анализа по ГОСТ Р 52501 первой степени чистоты.

5.14. Кислота фумаровая, массовой долей основного вещества не менее 99,5%.

5.15. Кислота серная по ГОСТ 4204, х.ч.

Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающих необходимую точность измерения, а также реактивов и материалов по качеству не хуже вышеуказанных.

6.1. Приготовление подвижной фазы для жидкостной хроматографии

В качестве подвижной фазы используют водный раствор серной кислоты молярной концентрации , который необходимо предварительно профильтровать через мембранный фильтр.

Срок хранения раствора в плотно укупоренной посуде при комнатной температуре - не более 7 сут.

6.2. Подготовка проб для измерений

Раствор пробы для хроматографического анализа готовят в соответствии с ГОСТ Р 53693 (подраздел 6.2).

6.3. Приготовление стандартных градуировочных растворов фумаровой кислоты

6.3.1. Приготовление основного стандартного раствора фумаровой кислоты

50 мг фумаровой кислоты помещают в мерную колбу вместимостью 500 см3, на 2/3 объема наполненную водой для лабораторного анализа по 5.13. Содержимое колбы тщательно перемешивают, после чего доводят до метки водой по 5.13 и вновь тщательно перемешивают. Получают основной стандартный раствор массовой концентрацией фумаровой кислоты 100 мг/дм3.

Срок хранения раствора в плотно укупоренной емкости при температуре 4 °C - не более 6 мес.

6.3.2. Приготовление градуировочных растворов фумаровой кислоты

Градуировочные растворы фумаровой кислоты готовят непосредственно перед использованием.

Из основного стандартного раствора фумаровой кислоты массовой концентрацией 100 мг/дм3 готовят пять градуировочных растворов в диапазоне массовых концентраций фумаровой кислоты от 1,0 до 10,0 мг/дм3 при помощи разведения основного стандартного раствора (0,5; 1,0; 3,0; 4,0; 5,0 см3) водой по 5.13 в мерных колбах вместимостью по 50 см3. Аликвоты основного стандартного раствора дозируют с помощью пипеток и далее содержимое колб доводят до метки водой по 5.13. Приготовленные градуировочные растворы фильтруют через мембранные фильтры с размером диаметра пор 0,45 мкм.

7.1. Условия хроматографического анализа

Колонка аналитическая по 5.2.

Элюент: раствор серной кислоты молярной концентрации 0,005 моль/дм3 по 6.1.

Температура колонки: 40 °C.

Длина волны детектора: 210 нм.

Скорость потока подачи элюента: 0,6 см3/мин (ориентировочное значение).

Объем вводимой пробы: 15 мкл.

Время удерживания фумаровой кислоты: 14 мин (ориентировочное значение).

Продолжительность анализа: примерно 20 мин.

7.2. Условия проведения измерений

Измерения проводят при следующих лабораторных условиях:

7.3. Построение градуировочной зависимости

Проводят хроматографический анализ всех градуировочных растворов. Регистрируют время удерживания и площади пиков фумаровой кислоты и строят градуировочный график - зависимость площади пика от массовой концентрации фумаровой кислоты в градуировочном растворе.

Процедуры построения градуировочной зависимости выполняют в соответствии с руководством по эксплуатации оборудования и руководством пользователя программным обеспечением.

Площадь пика фумаровой кислоты S, мм2, и ее концентрация в градуировочном растворе c, мг/дм3, находятся в функциональной зависимости вида

где K - градуировочный коэффициент, мг/(дм3мм2).

Градуировочный коэффициент K в формуле (1) рассчитывают по результатам анализа градуировочных растворов с помощью системы автоматизированной обработки данных или, при ее отсутствии в составе хроматографа, по методу наименьших квадратов, полагая свободный член в уравнении регрессии равным нулю, по формуле

где - площадь пика фумаровой кислоты при анализе i-го градуировочного раствора, мм2;

- массовая концентрация фумаровой кислоты в i-м градуировочном растворе, мг/дм3.

Правильность построения градуировочной зависимости контролируется значением достоверности аппроксимации :

Градуировочную зависимость строят при замене оборудования, колонок, реактивов, условий хроматографического анализа.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят ежедневно перед началом работы. В качестве контрольного образца используют раствор фумаровой кислоты в подвижной фазе массовой концентрации 5,0 мг/дм3, приготовленный в соответствии с 6.3.2. Проводят двукратный хроматографический анализ контрольного образца и идентифицируют пик фумаровой кислоты по времени удерживания. По результатам каждого анализа рассчитывают массовую концентрацию фумаровой кислоты в контрольном образце по формуле (1).

Проверяют повторяемость значений массовой концентрации фумаровой кислоты при анализе контрольного образца по формуле

где и - массовые концентрации фумаровой кислоты в контрольном образце, полученные по первой и второй хроматограммам, мг/дм3;

- среднеарифметическое значений и .

Градуировочная зависимость признается стабильной, если выполняется условие

где C - фактическая массовая концентрация фумаровой кислоты в контрольном образце, мг/дм3.

Если условие (4) не выполняется, то процедуру контроля повторяют и при получении неудовлетворительного результата контроля градуировку хроматографа проводят заново.

7.4. Анализ проб

Проводят хроматографический анализ двух параллельных проб, подготовленных по 6.2.

Регистрируют площадь пика фумаровой кислоты. В случае если массовая концентрация или массовая доля фумаровой кислоты в пробе настолько велика, что площадь соответствующего пика выходит за верхнюю границу диапазона градуировки хроматографа, то проводят повторный хроматографический анализ раствора пробы с большей степенью разбавления.

Массовую концентрацию фумаровой кислоты , рассчитывают по формуле

где S - площадь пика фумаровой кислоты на хроматограмме раствора пробы, мм2;

K - градуировочный коэффициент, мг/(дм3 · мм2);

- объем, в котором разбавлена проба для анализа, см3;

- объем пробы, взятой для анализа, см3.

При испытании соков с объемной долей мякоти более 10% результат определения выражают в виде массовой доли фумаровой кислоты , которую рассчитывают по формуле

где K - градуировочный коэффициент, мг/(дм3 · мм2);

V - объем, в котором разбавлена проба для анализа, см3;

m - масса пробы, взятая для анализа, г.

Вычисления проводят с точностью до второго десятичного знака.

За окончательный результат измерения принимают среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений , выполненных в условиях повторяемости по ГОСТ Р ИСО 5725-1, округленное до первого десятичного знака.

В справочном Приложении А приведены метрологические характеристики метода определения массовой концентрации фумаровой кислоты по данным метода ИФУ 72 "Метод определения фумаровой кислоты с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии". Значения характеристик прецизионности, указанные в таблице А.1 Приложения А, приведены для конкретных видов соковой продукции.

9.1. Условия безопасного проведения работ

При работе с химическими реактивами следует соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005 и ГОСТ 12.1.007. При подготовке проб к анализу и выполнению измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдают правила пожаровзрывобезопасности по ГОСТ 12.1.018, по электробезопасности - по ГОСТ Р 12.1.019 и инструкции по эксплуатации прибора.

9.2. Требования к квалификации оператора

К выполнению измерений, обработке и оформлению результатов допускаются инженер-химик, техник или лаборант, имеющие высшее или среднее специальное образование, опыт работы в химической лаборатории и изучившие методику измерений с применением метода высокоэффективной жидкостной хроматографии. Первое выполнение метода высокоэффективной жидкостной хроматографии в лаборатории следует проводить под руководством специалиста, владеющего теорией метода высокоэффективной жидкостной хроматографии и имеющего практические навыки в этой области.

А.1. Метрологические характеристики метода приведены в таблице А.1.

--------------------------------

<*> По данным метода ИФУ 72 (1998) "Метод определения фумаровой кислоты с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии".

[1] ТУ 6-09-1678-95 Фильтры обеззоленные ФЩ-ФС-15 "Белая лента"