"ГОСТ Р 52830-2007 (ИСО 7251:2005). Национальный стандарт Российской Федерации. Микробиология пищевых продуктов и кормов. Метод обнаружения и определения количества презумптивных бактерий Escherichia coli. Метод наиболее вероятного числа"
(утв. и введен в действие Приказом Ростехрегулирования от 27.12.2007 N 457-ст)

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ "О техническом регулировании", а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения"

1. Подготовлен ОАО "ВНИИС" совместно с ГУ "Ярославская государственная испытательная лаборатория молочного сырья и продукции" на основе аутентичного перевода стандарта, указанного в пункте 4.

2. Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 335 "Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность".

3. Утвержден и введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 27 декабря 2007 г. N 457-ст.

4. Настоящий стандарт является модифицированным по отношению к международному стандарту ИСО 7251:2005 "Микробиология пищевых продуктов и кормов. Метод обнаружения и определения количества презумптивных бактерий Escherichia coli. Метод наиболее вероятного числа" (ISO 7251:2005 "Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the detection and enumeration of presumptive Escherichia coli - Most probable number technique"). При этом дополнительные слова, фразы, абзацы, включенные в текст стандарта для учета потребностей национальной экономики Российской Федерации и особенностей российской национальной стандартизации, выделены курсивом.

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного стандарта для приведения в соответствие с ГОСТ Р 1.5-2004 (подраздел 3.5).

5. Введен впервые.

#Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемых информационных указателях "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет.#

#Настоящий стандарт устанавливает метод обнаружения# и определения количества презумптивных бактерий #Escherichia coli# методом культивирования в жидких питательных средах и расчета наиболее вероятного числа (НВЧ) после инкубации при температуре 37 °C и 44 °C.

Настоящий стандарт применяется при исследовании продуктов, предназначенных для употребления в пищу человеком и для кормления животных, а также образцов окружающей среды в местах производства и оборота пищевых продуктов.

Примечание. Некоторые патогенные штаммы Escherichia coli не растут при температуре 44 °C.

#В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р 51426-99 (ИСО 6887-83) Микробиология. Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Общее руководство по приготовлению разведений для микробиологических исследований

ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96) Микробиология. Продукты пищевые. Общие правила микробиологических исследований

ГОСТ Р 51448-99 (ИСО 3100-2-88) Мясо и мясные продукты. Методы подготовки проб для микробиологических исследований

ГОСТ 26668-85 Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических анализов

ГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов#

Примечание. При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

#В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:#

3.1. Презумптивная #Escherichia coli (presumptive Escherichia coli)#: бактерия, ферментирующая при #температуре# 44 °C лактозу с образованием газа и образующая индол из триптофана при проведении опыта в соответствии с методом, указанным в настоящем стандарте.

3.2. Количество презумптивных бактерий #Escherichia coli#: наиболее вероятное число E.coli в см3 или г образца при условии проведения опыта в соответствии с методом, указанным в настоящем стандарте.

4.1. Метод #качественного определения#

4.1.1. Определенное количество первичного разведения образца вносят в пробирку с жидкой селективной обогатительной средой.

4.1.2. Пробирку инкубируют до 48 ч при #температуре# 37 °C. Для обнаружения газообразования пробирку проверяют через 24 и 48 ч инкубации.

4.1.3. При обнаружении затемнения, образования хлопьев или вспенивания среды проводят пересев в пробирку с жидкой селективной средой (ЕС-бульон).

4.1.4. После пересева согласно 4.1.3 пробирку инкубируют до 48 ч при #температуре# 44 °C. Для обнаружения газообразования пробирку проверяют через 24 и 48 ч инкубации.

4.1.5. При обнаружении вспенивания среды в пробирке после инкубации согласно 4.1.4 проводят пересев в пробирку с безиндольной пептонной водой.

4.1.6. После пересева согласно 4.1.5 пробирку инкубируют до 48 ч при #температуре# 44 °C. Пробирку проверяют для обнаружения образования индола при распаде триптофана в составе пептона.

4.1.7. Пробирки с затемнением, образованием хлопьев или газообразованием в жидкой селективной обогатительной среде (см. 4.1.1), при пересеве из которых в ЕС-бульон обнаружилось газообразование и образование индола в пептонной воде при #температуре# 44 °C, расцениваются как содержащие презумптивную #Escherichia coli#. Результат выражается как "презумптивная #Escherichia coli# обнаружена" или "презумптивная #Escherichia coli# не обнаружена (отсутствует)" в #граммах# или см3 продукта.

4.2. Метод количественного определения

4.2.1. Определенное количество первичного разведения образца вносят в три пробирки с жидкой селективной обогатительной средой двойной концентрации.

4.2.2. Определенное количество первичного разведения образца вносят в три пробирки с жидкой обогатительной средой одинарной концентрации. Затем в аналогичных условиях определенные количества десятикратного разведения образца вносят в другие три пробирки с жидкой обогатительной средой одинарной концентрации.

4.2.3. Пробирки со средами двойной и одинарной концентрации инкубируют до 48 ч при #температуре# 37 °C. После 24 и 48 ч инкубации пробирки исследуют для обнаружения газообразования.

4.2.4. Из каждой пробирки со средой двойной концентрации, в которой обнаружено затемнение, образование хлопьев или вспенивание среды, а также из каждой пробирки со средой одинарной концентрации, в которой обнаружено вспенивание, #осуществляют# пересев в пробирку с жидкой селективной средой (ЕС-бульон).

4.2.5. После пересева согласно 4.2.4 пробирки инкубируют до 48 ч при #температуре# 44 °C. Для обнаружения газообразования пробирки проверяют через 24 и 48 ч инкубации.

4.2.6. При обнаружении вспенивания среды в пробирках после инкубации согласно 4.2.5 проводят пересев из них в пробирки с безиндольной пептонной водой.

4.2.7. После пересева согласно 4.2.6 пробирку инкубируют до 48 ч при температуре 44 °C. Пробирки проверяют для обнаружения образования индола при распаде триптофана в составе пептона.

4.2.8. Наиболее вероятное число #Escherichia coli# рассчитывают с помощью таблицы НВЧ (Приложение А) в зависимости от числа пробирок с селективной обогатительной средой одинарной и двойной концентрации, при пересеве из которых в ЕС-бульон обнаружилось газообразование и образование индола в пептонной воде при #температуре# 44 °C.

Для текущей лабораторной практики #применяют ГОСТ Р 51446#.

5.1. Разведения

В общем случае #согласно ГОСТ Р 51426#, для молочных продуктов - [1].

5.2. Селективная обогатительная среда (бульон с лаурилсульфатом)

5.2.1. Состав #среды - в соответствии с таблицей 1#.

5.2.2. Приготовление среды

Растворяют компоненты среды или готовую дегидратированную питательную среду в воде, при необходимости подогревают. Устанавливают уровень pH, чтобы после стерилизации он соответствовал (6,8 +/- 0,2) при #температуре# 25 °C.

Среду одинарной концентрации разливают по 9 см3 в пробирки 16 x 160 мм (см. 6.4) с пробирками-поплавками Дарема (#Уленгута#) (см. 6.6), среду двойной концентрации разливают по 10 см3 в пробирки 18 x 180 мм (см. 6.4) с пробирками-поплавками Дарема (#Уленгута#) (см. 6.6).

Стерилизуют в автоклаве (см. 6.1) 15 мин при #температуре# 121 °C.

После стерилизации пробирки-поплавки Дарема (#Уленгута#) не должны содержать пузырьков воздуха.

5.3. ЕС-бульон (селективная среда)

5.3.1. Состав:

5.3.2. Приготовление среды

Растворяют компоненты среды или готовую дегидратированную питательную среду в воде, при необходимости подогревают. Устанавливают уровень pH, при необходимости, чтобы после стерилизации он соответствовал (6,8 +/- 0,2) при температуре 25 °C.

Среду разливают по 10 см3 в пробирки 16 x 160 мм (см. 6.4) с пробирками-поплавками Дарема (#Уленгута#) (см. 6.6).

Стерилизуют в автоклаве (см. 6.1) 15 мин при #температуре# 121 °C.

После стерилизации пробирки-поплавки Дарема (#Уленгута#) не должны содержать пузырьков воздуха.

5.3.3. Проверка пригодности и обеспечение качества питательных сред #согласно# [3] и [4].

5.4. Пептонная вода безиндольная

5.4.1. Состав:

5.4.2. Растворяют компоненты среды или готовую дегидратированную питательную среду в воде, при необходимости подогревают. Доводят pH, если необходимо, до такого значения, чтобы после стерилизации оно составляло (7,3 +/- 0,2) при #температуре# 25 °C.

Среду разливают по 5 - 10 см3 в пробирки 16 x 160 мм (см. 6.4).

Стерилизуют в автоклаве (см. 6.1) 15 мин при #температуре# 121 °C.

5.5. Реактив для определения индола (реактив Ковача)

5.5.1. Состав:

5.5.2. Приготовление реактива

Растворяют 4-диметиламинобензальдегид в 2-метилбутан-1-оле или пентан-1-оле при нагревании на водяной бане, поддерживающей температуру #от# 50 °C #до# 55 °C.

Охлаждают и добавляют соляную кислоту.

Хранят #реактив#, защищенный от света, при температуре около 4 °C (#ГОСТ Р 51446#).

Цвет реактива должен быть от светло-желтого до светло-коричневого.

Примечание. Допускается использовать готовые коммерческие реактивы.

Примечание. При одинаковой спецификации одноразовое оборудование предпочтительнее многоразового.

Обычное лабораторное оборудование, а #также# следующее:

6.1. Стерилизаторы сухожаровые (печи) или паровые (автоклавы) по ГОСТ Р 51446.

6.2. Термостат, поддерживающий температуру (37 +/- 1) °C и (44 +/- 1) °C.

6.3. Водяная баня, поддерживающая температуру (44 +/- 1) °C.

6.4. Пробирки размерами 16 x 160 мм и 18 x 180 мм или 20 x 200 мм.

6.5. Бактериологическая петля из платино-иридиевого или никель-хромового сплава #диаметром# около 3 мм, #вмещающая за один раз около 10 мм3 среды.#

6.6. Пробирки-поплавки Дарема (#Уленгута#), свободно помещающиеся в пробирки (см. 6.4).

6.7. Пипетки с полным сливом номинальным объемом от 1 до 10 см3.

6.8. pH-метр с разрешением 0,01 единиц pH и точностью +/- 0,1 pH при #температуре# 25 °C.

#В лабораторию направляется представительный образец. #Образец не должен быть поврежден или изменен в #процессе# транспортирования или хранения.

#Отбор проб проводят в соответствии с ГОСТ 26668. Рекомендуется достижение соглашения заинтересованных сторон по отбору проб конкретного продукта при отсутствии соответствующего стандарта.#

Подготовку проб проводят в соответствии с #ГОСТ Р 51448 и ГОСТ 26669.# Рекомендуется достижение соглашения заинтересованных сторон по подготовке проб конкретного продукта при отсутствии #соответствующего# стандарта.

9.1. Метод #качественного определения#

9.1.1. #Приготовление пробы и первичного разведения в зависимости от вида продукта согласно ГОСТ Р 51426, ГОСТ Р 51448, ГОСТ 26669, [5], [6] или [7].#

#Состав ЕС-бульона с лаурилсульфатом при определенной концентрации согласно таблице 1 a) и b)#.

Добавляют 1 см3 первичного разведения к 9 см3 бульона с лаурилсульфатом одинарной концентрации (0,1 г или 0,1 см3 образца) или 10 см3 первоначального разведения к 10 см3 бульона с лаурилсульфатом двойной концентрации (1 г или 1 см3 образца). Для больших объемов пробы первичное разведение приготавливают добавлением #0,1# см3 или #0,1# г к 9 см3 разбавителя (#ГОСТ Р 51426# или [7]), затем добавляют весь объем первичного разведения к 90 см3 бульона с лаурилсульфатом одинарной концентрации. Например, добавляют 5 см3 или 5 г образца к 45 см3 разбавителя, и весь объем начальной суспензии вносят в 450 см3 бульона с лаурилсульфатом одинарной концентрации или вносят пробу в равный объем.

9.1.2. Инкубация селективного обогатительного бульона (бульона с лаурилсульфатом)

Инокулированный бульон с лаурилсульфатом одинарной или двойной концентрации (см. 5.2) инкубируют в термостате (см. 6.2), при #температуре# 37 °C в течение (24 +/- 2) ч. Если на этой стадии не обнаруживают ни газообразования, ни замутнения среды, затрудняющего определение газообразования, продолжают инкубацию до (48 +/- 2) ч.

Примечание. Время инкубации проб живых моллюсков должно составлять (48 +/- 2) ч.

При исследовании некоторых молочных продуктов (например, казеина) пробирки-поплавки Дарема могут застревать на дне пробирки с селективной обогатительной средой. Если после 48 ч инкубации в пробирке обнаруживается лишь помутнение без газообразования, то также осуществляют пересев в ЕС-бульон согласно 9.1.3.

9.1.3. Инокуляция и инкубация селективной среды (ЕС-бульона)

При обнаружении помутнения, выпадения осадка или видимого газообразования после инкубации (см. 9.1.2) селективной среды двойной концентрации или при обнаружении видимого газообразования после инкубации селективной среды одинарной концентрации с помощью бактериологической петли (см. 6.5) проводят пересев в пробирку с ЕС-бульоном. Инокулированный ЕС-бульон инкубируют на водяной бане (см. 6.3) или в термостате (см. 6.2) (24 +/- 2) ч при температуре 44 °C. Если на этой стадии не обнаруживают видимого газообразования в ЕС-бульоне (см. 5.3), то общее время инкубации продлевают до (48 +/- 2) ч.

Примечание. Общее время инкубации проб живых моллюсков должно составлять (24 +/- 2) ч.

9.1.4. Инокуляция и инкубация пептонной воды

При обнаружении видимого газообразования после инкубации согласно 9.1.3 с помощью бактериологической петли (см. 6.5) производят пересев в пробирку с пептонной водой (см. 5.4), предварительно прогретой до #температуры# 44 °C. Инкубируют (48 +/- 2) ч при #температуре# 44 °C.

9.1.5. Обнаружение образования индола

В пробирку с пептонной водой (см. 5.4) после инкубации согласно 9.1.4 добавляют 0,5 см3 реактива на индол (см. 5.5). После интенсивного перемешивания через 1 мин проводят оценку реакции. Красное окрашивание в спиртовой фазе свидетельствует о наличии индола.

9.1.6. Оценка результатов

#При обнаружении# видимого газообразования в пробирке с ЕС-бульоном и образования индола в пробирке с пептонной водой (см. 9.1.2 - 9.1.4) селективную обогатительную среду оценивают как положительную (презумптивная #Escherichia coli# обнаружена).

9.2. Метод количественного определения

9.2.1. #Приготовление пробы и первичного разведения в зависимости от вида продукта согласно ГОСТ Р 51426, ГОСТ Р 51448, ГОСТ 26669, [5], [6] или [7].#

Подготавливают достаточное число разведений, чтобы в максимальном разведении с уверенностью получить отрицательный результат.

9.2.2. Инокуляция и инкубация селективного обогатительного бульона (бульона с лаурил-сульфатом)

9.2.2.1. Подготавливают ряд последовательных разведений, по три пробирки на каждое разведение. Для проб живых моллюсков и некоторых других особых продуктов, а также для получения большей точности результатов необходимо использовать по пять пробирок на каждое разведение (см. Приложение А).

9.2.2.2. Берут три пробирки с селективной обогатительной средой двойной концентрации [см. #таблицу 1# a)] и, используя стерильную пипетку (см. 6.7), в каждую пробирку вносят по 10 см3 первичного разведения. Таким образом, каждая пробирка этого ряда будет содержать по 1 г образца.

9.2.2.3. Берут три пробирки с селективной обогатительной средой одинарной концентрации [см. #таблицу 1# b)] и, используя новую стерильную пипетку (см. 6.7), в каждую пробирку вносят по 1 см3 первичного разведения. Таким образом, каждая пробирка этого ряда будет содержать по 0,1 г образца.

9.2.2.4. Для каждого последующего разведения (соответствующего 0,01 г, 0,001 г и т.д. продукта на пробирку) повторяют процедуру, как в 9.2.2.3, используя для каждого разведения новую пипетку. Инокулят и среду тщательно перемешивают.

9.2.2.5. Инокулированные среды с лаурилсульфатом двойной по 9.2.2.1 или одинарной концентрации по 9.2.2.3 и 9.2.2.4 инкубируют в термостате (см. 6.2) при #температуре# 37 °C в течение (24 +/- 2) ч. Если на этой стадии не обнаруживают ни газообразования, ни замутнения среды, затрудняющего определение газообразования, продолжают инкубацию до (48 +/- 2) ч.

Примечание. Время инкубации проб живых моллюсков должно составлять (48 +/- 2) ч.

При исследовании некоторых молочных продуктов (например, казеина) пробирки-поплавки Дарема могут застревать на дне пробирки с селективной обогатительной средой. Если после 48 ч инкубации в пробирке обнаруживается лишь помутнение без газообразования, то также осуществляют пересев в ЕС-бульон согласно 9.2.3.

9.2.3. Инокуляция и инкубация селективной среды (ЕС-бульона)

9.2.3.1. При обнаружении помутнения, выпадения осадка или видимого газообразования после инкубации селективной среды двойной концентрации [см. #таблицу# 1 a)] согласно 9.2.2.5 или при обнаружении видимого газообразования после инкубации селективной среды одинарной концентрации [см. #таблицу# 1 b)] согласно 9.2.2.5 с помощью бактериологической петли (см. 6.5) проводят пересев в пробирку с ЕС-бульоном (см. 5.3).

9.2.3.2. Инокулированный согласно 9.2.3.1 ЕС-бульон инкубируют на водяной бане (см. 6.3) или в термостате (см. 6.2) (24 +/- 2) ч при температуре 44 °C. Если на этой стадии не обнаруживают видимого газообразования в ЕС-бульоне (см. 5.3), то общее время инкубации продлевают до (48 +/- 2) ч.

Примечание. Общее время инкубации проб живых моллюсков должно составлять (24 +/- 2) ч.

9.2.4. Инокуляция и инкубация пептонной воды

При обнаружении видимого газообразования после инкубации согласно 9.2.3.2 с помощью бактериологической петли (см. 6.5) производят пересев в пробирку с пептонной водой (см. 5.4), предварительно прогретой до #температуры# 44 °C. Инкубируют (48 +/- 2) ч #при температуре# 44 °C.

9.2.5. Обнаружение образования индола

В пробирку с пептонной водой (см. 5.4) после инкубации согласно 9.2.4 добавляют 0,5 см3 реактива на индол (см. 5.5). После интенсивного перемешивания через 1 мин проводят оценку реакции. Красное окрашивание в спиртовой фазе свидетельствует о наличии индола.

9.2.6. Оценка результатов

#При обнаружении# видимого газообразования в пробирке с ЕС-бульоном и образования индола в пробирке с пептонной водой (см. 9.2.2 - 9.2.4) селективную обогатительную среду #оценивают# как положительную (презумптивная #Escherichia coli# обнаружена).

Для каждого разведения определяют число положительных результатов для среды двойной концентрации [см. #таблицу 1# a)] и одинарной концентрации [см. #таблицу 1# b)].

10.1. Метод #качественного определения#

Исходя из оценки результатов (см. 9.1.6), конечный результат #определения# выражают как "презумптивная #Escherichia coli# обнаружена" или "не обнаружена (отсутствует)" в данном объеме пробы, указывая массу пробы в граммах или объем пробы в см3.

10.2. Метод #количественного определения#

Расчет НВЧ проводят согласно Приложению А.

#Пример. При исследовании твердого образца и использовании трех пробирок на разведение для 95% случаев доверительный интервал составляет от 13 до 200 презумптивных Escherichia coli в грамме при НВЧ 7,4 x 10 презумптивных Escherichia coli в грамме и от 4 до 99 презумптивных Escherichia coli в грамме при НВЧ 2,4 x 10 презумптивных Escherichia coli в грамме.#

В протоколе испытания указывают:

- всю информацию, необходимую для полной идентификации образца;

- метод отбора пробы, если известен;

- использованный метод испытания со ссылкой на настоящий стандарт;

- все детали исследования, не оговариваемые в настоящем стандарте, или рассматриваемые как необязательные, а также детали иного свойства, могущие оказать влияние на результаты исследований;

- полученные результаты.

А.1. Расчет НВЧ при использовании трех пробирок - по ГОСТ Р 51446.

А.2. Расчет НВЧ при использовании пяти пробирок представлен в таблице А.1