"ГОСТ 31708-2012 (ISO 7251:2005). Межгосударственный стандарт. Микробиология пищевых продуктов и кормов. Метод обнаружения и определения количества презумптивных бактерий Escherichia coli. Метод наиболее вероятного числа"
(введен в действие Приказом Росстандарта от 29.11.2012 N 1761-ст)

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены".

1. Подготовлен Открытым акционерным обществом "Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации (ОАО "ВНИИС") совместно с Государственным учреждением "Ярославская государственная испытательная лаборатория молочного сырья и продукции" на основе аутентичного перевода стандарта, указанного в пункте 4.

2. Внесен Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (ТК 335).

3. Принят Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (Протокол N 51 от 1 октября 2012 г.).

За принятие проголосовали:

4. Настоящий стандарт модифицирован по отношению к международному стандарту ISO 7251:2005 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the detection and enumeration of presumptive Escherichia coli - Most probable number technique (Микробиология пищевых продуктов и кормов. Метод обнаружения и определения количества презумптивных бактерий Escherichia coli. Метод наиболее вероятного числа) путем изменения отдельных фраз (слов, значений показателей, ссылок), которые выделены в тексте курсивом.

Международный стандарт разработан подкомитетом ISO/ТС 34/SC 9 "Микробиология" технического комитета по стандартизации ISO/TC 34 "Пищевые продукты" Международной организации по стандартизации (ISO).

Перевод с английского языка (en).

Официальные экземпляры международного стандарта, на основе которых подготовлен настоящий межгосударственный стандарт, и межгосударственных стандартов, на которые даны ссылки, имеются в Федеральном агентстве по техническому регулированию и метрологии Российской Федерации.

Степень соответствия - модифицированная (MOD).

Настоящий стандарт подготовлен на основе применения ГОСТ Р 52830-2007.

5. Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 ноября 2012 г. N 1761-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 31708-2012 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2013 г.

6. Введен впервые.

Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта публикуется в указателе "Национальные стандарты".

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в указателе "Национальные стандарты", а текст изменений - в информационных указателях "Национальные стандарты". В случае пересмотра или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована в информационном указателе "Национальные стандарты".

Настоящий стандарт устанавливает метод обнаружения и определения количества презумптивных бактерий Escherichia coli методом культивирования в жидких питательных средах и расчета наиболее вероятного числа (НВЧ) после инкубации при температуре 37 °C и 44 °C.

Настоящий стандарт применяют при исследовании продуктов, предназначенных для употребления в пищу человеком и для кормления животных, а также образцов окружающей среды в местах производства и оборота пищевых продуктов.

Примечание. Некоторые патогенные штаммы Escherichia coli не растут при температуре 44 °C.

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

Примечание. При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов по указателю "Национальные стандарты", составленному по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1. Презумптивная Escherichia coli (presumptive Escherichia coli): бактерия, ферментирующая при температуре 44 °C лактозу с образованием газа и образующая индол из триптофана при проведении опыта в соответствии с методом, указанным в настоящем стандарте.

3.2. Количество презумптивных бактерий Escherichia coli: наиболее вероятное число E. coli в см3 или г образца при условии проведения опыта в соответствии с методом, указанным в настоящем стандарте.

4.1. Метод качественного определения

4.1.1. Определенное количество первичного разведения образца вносят в пробирку с жидкой селективной обогатительной средой.

4.1.2. Пробирку инкубируют до 48 ч при температуре 37 °C. Для обнаружения газообразования пробирку проверяют через 24 и 48 ч инкубации.

4.1.3. При обнаружении затемнения, образования хлопьев или вспенивания среды проводят пересев в пробирку с жидкой селективной средой (ЕС-бульон).

4.1.4. После пересева согласно 4.1.3 пробирку инкубируют до 48 ч при температуре 44 °C. Для обнаружения газообразования пробирку проверяют через 24 и 48 ч инкубации.

4.1.5. При обнаружении вспенивания среды в пробирке после инкубации согласно 4.1.4 проводят пересев в пробирку с безиндольной пептонной водой.

4.1.6. После пересева согласно 4.1.5 пробирку инкубируют до 48 ч при температуре 44 °C. Пробирку проверяют для обнаружения образования индола при распаде триптофана в составе пептона.

4.1.7. Пробирки с затемнением, образованием хлопьев или газообразованием в жидкой селективной обогатительной среде (см. 4.1.1), при пересеве из которых в ЕС-бульон обнаружилось газообразование и образование индола в пептонной воде при температуре 44 °C, расценивают как содержащие презумптивную Escherichia coli. Результат выражается как "презумптивная Escherichia coli обнаружена" или "презумптивная Escherichia coli не обнаружена (отсутствует)" в граммах или см3 продукта.

4.2. Метод количественного определения

4.2.1. Определенное количество первичного разведения образца вносят в три пробирки с жидкой селективной обогатительной средой двойной концентрации.

4.2.2. Определенное количество первичного разведения образца вносят в три пробирки с жидкой обогатительной средой одинарной концентрации. Затем в аналогичных условиях определенные количества десятикратного разведения образца вносят в другие три пробирки с жидкой обогатительной средой одинарной концентрации.

4.2.3. Пробирки со средами двойной и одинарной концентрации инкубируют до 48 ч при температуре 37 °C. После 24 и 48 ч инкубации пробирки исследуют для обнаружения газообразования.

4.2.4. Из каждой пробирки со средой двойной концентрации, в которой обнаружено затемнение, образование хлопьев или вспенивание среды, а также из каждой пробирки со средой одинарной концентрации, в которой обнаружено вспенивание, осуществляют пересев в пробирку с жидкой селективной средой (ЕС-бульон).

4.2.5. После пересева согласно 4.2.4 пробирки инкубируют до 48 ч при температуре 44 °C. Для обнаружения газообразования пробирки проверяют через 24 и 48 ч инкубации.

4.2.6. При обнаружении вспенивания среды в пробирках после инкубации согласно 4.2.5 проводят пересев из них в пробирки с безиндольной пептонной водой.

4.2.7. После пересева согласно 4.2.6 пробирку инкубируют до 48 ч при температуре 44 °C. Пробирки проверяют для обнаружения образования индола при распаде триптофана в составе пептона.

4.2.8. Наиболее вероятное число Escherichia coli рассчитывают с помощью таблицы НВЧ (Приложение А), в зависимости от числа пробирок с селективной обогатительной средой одинарной и двойной концентрации, при пересеве из которых в ЕС-бульон обнаружилось газообразование и образование индола в пептонной воде при температуре 44 °C.

Для текущей лабораторной практики применяют ГОСТ ISO 7218.

5.1. Разведения

В общем случае согласно ГОСТ ISO 7218, для молочных продуктов - [1].

5.2. Селективная обогатительная среда (бульон с лаурилсульфатом)

5.2.1. Состав среды - в соответствии с таблицей 1.

5.2.2. Приготовление среды

Растворяют компоненты среды или готовую дегидратированную питательную среду в воде, при необходимости подогревают. Устанавливают уровень pH, чтобы после стерилизации он соответствовал 6,8 +/- 0,2 при температуре 25 °C.

Среду одинарной концентрации разливают по 9 см3 в пробирки 16 x 160 мм (см. 6.4) с пробирками-поплавками Дарема (Уленгута) (см. 6.6), среду двойной концентрации разливают по 10 см3 в пробирки 18 x 180 мм (см. 6.4) с пробирками-поплавками Дарема (Уленгута) (см. 6.6).

Стерилизуют в автоклаве (см. 6.1) 15 мин при температуре 121 °C.

После стерилизации пробирки-поплавки Дарема (Уленгута) не должны содержать пузырьков воздуха.

5.3. ЕС-бульон (селективная среда)

5.3.1. Состав:

5.3.2. Приготовление среды

Растворяют компоненты среды или готовую дегидратированную питательную среду в воде, при необходимости подогревают. Устанавливают уровень такой pH, чтобы после стерилизации он соответствовал 6,8 +/- 0,2 при температуре 25 °C.

Среду разливают по 10 см3 в пробирки 16 x 160 мм (см. 6.4) с пробирками-поплавками Дарема (Уленгута) (см. 6.6).

Стерилизуют в автоклаве (см. 6.1) 15 мин при температуре 121 °C.

После стерилизации пробирки-поплавки Дарема (Уленгута) не должны содержать пузырьков воздуха.

5.3.3. Проверка пригодности и обеспечение качества питательных сред согласно ГОСТ ISO 11133-1 и ГОСТ ISO 11133-2.

5.4. Пептонная вода безиндольная

5.4.1. Состав:

5.4.2. Растворяют компоненты среды или готовую дегидратированную питательную среду в воде, при необходимости подогревают. Доводят pH, если необходимо, до такого значения, чтобы после стерилизации оно составляло (7,3 +/- 0,2) при температуре 25 °C.

Среду разливают по 5 - 10 см3 в пробирки 16 x 160 мм (см. 6.4).

Стерилизуют в автоклаве (см. 6.1) 15 мин при температуре 121 °C.

5.5. Реактив для определения индола (реактив Ковача)

5.5.1. Состав:

5.5.2. Приготовление реактива

Растворяют 4-диметиламинобензальдегид в 2-метилбутан-1-оле или пентан-1-оле при нагревании на водяной бане, поддерживающей температуру от 50 °C до 55 °C.

Охлаждают и добавляют соляную кислоту.

Хранят реактив, защищенный от света, при температуре около 4 °C.

Цвет реактива должен быть от светло-желтого до светло-коричневого.

Примечание. Допускается использовать готовые коммерческие реактивы.

Примечание. При одинаковой спецификации одноразовое оборудование предпочтительнее многоразового.

Обычное лабораторное оборудование, а также следующее:

6.1. Стерилизаторы сухожаровые (печи) или паровые (автоклавы).

6.2. Термостат, поддерживающий температуру (37 +/- 1) °C и (44 +/- 1) °C.

6.3. Водяная баня, поддерживающая температуру (44 +/- 1) °C.

6.4. Пробирки размерами 16 x 160 мм и 18 x 180 мм или 20 x 200 мм.

6.5. Бактериологическая петля из платиноиридиевого или никельхромового сплава диаметром около 3 мм, вмещающая за один раз около 10 мм3 среды.

6.6. Пробирки-поплавки Дарема (Уленгута), свободно помещающиеся в пробирки (см. 6.4).

6.7. Пипетки с полным сливом номинальным объемом от 1 до 10 см3.

6.8. pH-метр с разрешением 0,01 единиц pH и точностью +/- 0,1 pH при температуре 25 °C.

В лабораторию направляют представительный образец. Образец не должен быть поврежден или изменен в процессе транспортирования или хранения.

Отбор проб проводят в соответствии с ГОСТ 26668. Рекомендуется достижение соглашения заинтересованных сторон по отбору проб конкретного продукта при отсутствии соответствующего стандарта.

Подготовку проб проводят в соответствии ГОСТ 26669. Рекомендуется достижение соглашения заинтересованных сторон по подготовке проб конкретного продукта при отсутствии соответствующего стандарта.

9.1. Метод качественного определения

9.1.1. Приготовление пробы и первичного разведения в зависимости от вида продукта согласно ГОСТ 26669, [3], [4], [5], [6] или [7].

Состав ЕС-бульона с лаурилсульфатом при определенной концентрации согласно таблице 1 a) и b).

Добавляют 1 см3 первичного разведения к 9 см3 бульона с лаурилсульфатом одинарной концентрации (0,1 г или 0,1 см3 образца) или 10 см3 первоначального разведения к 10 см3 бульона с лаурилсульфатом двойной концентрации (1 г или 1 см3 образца). Для объемов пробы первичное разведение приготавливают добавлением 0,1 см3 или 0,1 г к 9 см3 разбавителя ([3], [4] или [7]), затем добавляют весь объем первичного разведения к 90 см3 бульона с лаурилсульфатом одинарной концентрации. Например, добавляют 5 см3 или 5 г образца к 45 см3 разбавителя и весь объем начальной суспензии вносят в 450 см3 бульона с лаурилсульфатом одинарной концентрации или вносят пробу в равный объем.

9.1.2. Инкубация селективного обогатительного бульона (бульона с лаурилсульфатом)

Инокулированный бульон с лаурилсульфатом одинарной или двойной концентрации (см. 5.2) инкубируют в термостате (см. 6.2) при температуре 37 °C в течение (24 +/- 2) ч. Если на этой стадии не обнаруживают ни газообразования, ни замутнения среды, затрудняющего определение газообразования, продолжают инкубацию до (48 +/- 2) ч.

Примечание. Время инкубации проб живых моллюсков должно составлять (48 +/- 2) ч.

При исследовании некоторых молочных продуктов (например, казеина) пробирки-поплавки Дарема могут застревать на дне пробирки с селективной обогатительной средой. Если после 48 ч инкубации в пробирке обнаруживают лишь помутнение без газообразования, то также осуществляют пересев в ЕС-бульон согласно 9.1.3.

9.1.3. Инокуляция и инкубация селективной среды (ЕС-бульона)

При обнаружении помутнения, выпадения осадка или видимого газообразования после инкубации (см. 9.1.2) селективной среды двойной концентрации или при обнаружении видимого газообразования после инкубации селективной среды одинарной концентрации с помощью бактериологической петли (см. 6.5) проводят пересев в пробирку с ЕС-бульоном. Инокулированный ЕС-бульон инкубируют на водяной бане (см. 6.3) или в термостате (см. 6.2) (24 +/- 2) ч при температуре 44 °C. Если на этой стадии не обнаруживают видимого газообразования в ЕС-бульоне (см. 5.3), то общее время инкубации продлевают до (48 +/- 2) ч.

Примечание. Общее время инкубации проб живых моллюсков должно составлять (24 +/- 2) ч.

9.1.4. Инокуляция и инкубация пептонной воды

При обнаружении видимого газообразования после инкубации согласно 9.1.3 с помощью бактериологической петли (см. 6.5) производят пересев в пробирку с пептонной водой (см. 5.4), предварительно прогретой до температуры 44 °C. Инкубируют (48 +/- 2) ч при температуре 44 °C.

9.1.5. Обнаружение образования индола

В пробирку с пептонной водой (см. 5.4) после инкубации согласно 9.1.4 добавляют 0,5 см3 реактива на индол (см. 5.5). После интенсивного перемешивания через 1 мин проводят оценку реакции. Красное окрашивание в спиртовой фазе свидетельствует о наличии индола.

9.1.6. Оценка результатов

При обнаружении видимого газообразования в пробирке с ЕС-бульоном и образования индола в пробирке с пептонной водой (см. 9.1.2 - 9.1.4) селективную обогатительную среду оценивают как положительную (презумптивная Escherichia coli обнаружена).

9.2. Метод количественного определения

9.2.1. Приготовление пробы и первичного разведения в зависимости от вида продукта по ГОСТ 26669.

Подготавливают достаточное число разведений, чтобы в максимальном разведении с уверенностью получить отрицательный результат.

9.2.2. Инокуляция и инкубация селективного обогатительного бульона (бульона с лаурилсульфатом)

9.2.2.1. Подготавливают ряд последовательных разведений, по три пробирки на каждое разведение. Для проб живых моллюсков и некоторых других особых продуктов, а также для получения большей точности результатов необходимо использовать по пять пробирок на каждое разведение (см. Приложение А).

9.2.2.2. Берут три пробирки с селективной обогатительной средой двойной концентрации [см. таблицу 1 a)] и, используя стерильную пипетку (см. 6.7), в каждую пробирку вносят по 10 см3 первичного разведения. Таким образом, каждая пробирка этого ряда будет содержать по 1 г образца.

9.2.2.3. Берут три пробирки с селективной обогатительной средой одинарной концентрации [см. таблицу 1 b)] и, используя новую стерильную пипетку (см. 6.7), в каждую пробирку вносят по 1 см3 первичного разведения. Таким образом, каждая пробирка этого ряда будет содержать по 0,1 г образца.

9.2.2.4. Для каждого последующего разведения (соответствующего 0,01 г, 0,001 г и т.д. продукта на пробирку) повторяют процедуру, как в 9.2.2.3, используя для каждого разведения новую пипетку. Инокулят и среду тщательно перемешивают.

9.2.2.5. Инокулированные среды с лаурилсульфатом двойной по 9.2.2.1 или одинарной концентрации по 9.2.2.3 и 9.2.2.4 инкубируют в термостате (см. 6.2) при температуре 37 °C в течение (24 +/- 2) ч. Если на этой стадии не обнаруживают ни газообразования, ни замутнения среды, затрудняющего определение газообразования, продолжают инкубацию до (48 +/- 2) ч.

Примечание. Время инкубации проб живых моллюсков должно составлять (48 +/- 2) ч.

При исследовании некоторых молочных продуктов (например, казеина) пробирки-поплавки Дарема могут застревать на дне пробирки с селективной обогатительной средой. Если после 48 ч инкубации в пробирке обнаруживают лишь помутнение без газообразования, то также осуществляют пересев в ЕС-бульон согласно 9.2.3.

9.2.3. Инокуляция и инкубация селективной среды (ЕС-бульона)

9.2.3.1. При обнаружении помутнения, выпадения осадка или видимого газообразования после инкубации селективной среды двойной концентрации [см. таблицу 1 a)] согласно 9.2.2.5 или при обнаружении видимого газообразования после инкубации селективной среды одинарной концентрации [см. таблицу 1 b)] согласно 9.2.2.5 с помощью бактериологической петли (см. 6.5) проводят пересев в пробирку с ЕС-бульоном (см. 5.3).

9.2.3.2. Инокулированный согласно 9.2.3.1 ЕС-бульон инкубируют на водяной бане (см. 6.3) или в термостате (см. 6.2) (24 +/- 2) ч при температуре 44 °C. Если на этой стадии не обнаруживают видимого газообразования в ЕС-бульоне (см. 5.3), то общее время инкубации продлевают до (48 +/- 2) ч.

Примечание. Общее время инкубации проб живых моллюсков должно составлять (24 +/- 2) ч.

9.2.4. Инокуляция и инкубация пептонной воды

При обнаружении видимого газообразования после инкубации согласно 9.2.3.2 с помощью бактериологической петли (см. 6.5) производят пересев в пробирку с пептонной водой (см. 5.4), предварительно прогретой до температуры 44 °C. Инкубируют (48 +/- 2) ч при температуре 44 °C.

9.2.5. Обнаружение образования индола

В пробирку с пептонной водой (см. 5.4) после инкубации согласно 9.2.4 добавляют 0,5 см3 реактива на индол (см. 5.5). После интенсивного перемешивания через 1 мин проводят оценку реакции. Красное окрашивание в спиртовой фазе свидетельствует о наличии индола.

9.2.6. Оценка результатов

При обнаружении видимого газообразования в пробирке с ЕС-бульоном и образования индола в пробирке с пептонной водой (см. 9.2.2 - 9.2.4) селективную обогатительную среду оценивают как положительную (презумптивная Escherichia coli обнаружена).

Для каждого разведения определяют число положительных результатов для среды двойной концентрации [см. таблицу 1 a)] и одинарной концентрации [см. таблицу 1 b)].

10.1. Метод качественного определения

Исходя из оценки результатов (см. 9.1.6), конечный результат определения выражают как "презумптивная Escherichia coli обнаружена" или "не обнаружена (отсутствует)" в данном объеме пробы, указывая массу пробы в граммах или объем пробы в см3.

10.2. Метод количественного определения

Расчет НВЧ проводят согласно Приложению А.

В протоколе испытания указывают:

- всю информацию, необходимую для полной идентификации образца;

- метод отбора пробы, если известен;

- использованный метод испытания со ссылкой на настоящий стандарт;

- все детали исследования, не оговариваемые в настоящем стандарте, или рассматриваемые как необязательные, а также детали иного свойства, могущие оказать влияние на результаты исследований;

- полученные результаты.

А.1. Расчет НВЧ при использовании трех пробирок - по ГОСТ ISO 7218.

А.2. Расчет НВЧ при использовании пяти пробирок представлен в таблице А.1.