"ГОСТ 34137-2017. Межгосударственный стандарт. Продукты пищевые, продовольственное сырье. Метод определения остаточного содержания цефалоспоринов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием"
(введен в действие Приказом Росстандарта от 04.08.2017 N 807-ст)
(ред. от 12.12.2023)

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены в ГОСТ 1.0-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением "Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" (ФГБУ "ВГНКИ")

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 14 июля 2017 г. N 101-П)

За принятие проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 4 августа 2017 г. N 807-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 34137-2017 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2018 г.

5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и продовольственное сырье: мясо (все виды животных), в том числе мясо птицы, субпродукты, мясные продукты, полуфабрикаты, яйца и продукты их переработки, молоко, молочные продукты, в том числе сыр, и устанавливает метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (далее - ВЭЖХ-МС/МС) для определения остаточного содержания цефалоспоринов в диапазоне измерений от 5 до 500 мкг/кг, в т.ч. цефтиофура и его метаболитов в диапазоне измерений от 30 до 3000 мкг/кг.

Примечание - Метаболиты цефтиофура: десфуроил цефтиофур и десфуроил цефтиофур цистеин дисульфид.

(в ред. Изменения N 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 12.12.2023 N 1559-ст)

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

ГОСТ 12.1.005 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

(в ред. Изменения N 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 12.12.2023 N 1559-ст)

--------------------------------

<*> Сноска исключена с 15.03.2024. - Изменение N 1, введенное в действие Приказом Росстандарта от 12.12.2023 N 1559-ст.

ГОСТ 12.2.085 Арматура трубопроводная. Клапаны предохранительные. Выбор и расчет пропускной способности

(в ред. Изменения N 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 12.12.2023 N 1559-ст)

ГОСТ OIML R 76-1 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 1770 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 2603 Реактивы. Ацетон. Технические условия

ГОСТ 3117 Реактивы. Аммоний уксуснокислый. Технические условия

ГОСТ 3762 Реактивы. Аммоний углекислый кислый. Технические условия

ГОСТ 4288 Изделия кулинарные и полуфабрикаты из рубленого мяса. Правила приемки и методы испытаний

ГОСТ 4328 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ ИСО 5725-6 <**> Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике

--------------------------------

<**> В Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002.

ГОСТ 5848 Реактивы. Кислота муравьиная. Технические условия

Ссылка исключена с 15.03.2024. - Изменение N 1, введенное в действие Приказом Росстандарта от 12.12.2023 N 1559-ст.

ГОСТ 6995 Реактивы. Метанол-яд. Технические условия

ГОСТ 7269 Мясо. Методы отбора образцов и органолептические методы определения свежести

ГОСТ 9293 (ИСО 2435-73) Азот газообразный и жидкий. Технические условия

ГОСТ 9792 Колбасные изделия и продукты из свинины, баранины, говядины и мяса других видов убойных животных и птиц. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ 22300 Реактивы. Эфиры этиловый и бутиловый уксусной кислоты. Технические условия

ГОСТ 24147 Аммиак водный особой чистоты. Технические условия

ГОСТ 25336 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26809.1 Молоко и молочная продукция. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу. Часть 1. Молоко, молочные, молочные составные и молокосодержащие продукты

ГОСТ 26809.2 Молоко и молочная продукция. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу. Часть 2. Масло из коровьего молока, спреды, сыры и сырные продукты, плавленые сыры и плавленые сырные продукты

ГОСТ 28311 Дозаторы медицинские лабораторные. Общие технические требования и методы испытаний

(ссылка введена Изменением N 1, введенным в действие Приказом Росстандарта от 12.12.2023 N 1559-ст)

ГОСТ 29227 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ 29245 Консервы молочные. Методы определения физических и органолептических показателей

(ссылка введена Изменением N 1, введенным в действие Приказом Росстандарта от 12.12.2023 N 1559-ст)

ГОСТ 31467 Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты из мяса птицы. Методы отбора проб и подготовка их к испытаниям

ГОСТ 31654 Яйца куриные пищевые. Технические условия

ГОСТ 31720 Пищевые продукты переработки яиц сельскохозяйственной птицы. Методы отбора проб и органолептического анализа

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов и классификаторов на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации (www.easc.by) или по указателям национальных стандартов, издаваемым в государствах, указанных в предисловии, или на официальных сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации. Если на документ дана недатированная ссылка, то следует использовать документ, действующий на текущий момент, с учетом всех внесенных в него изменений. Если заменен ссылочный документ, на который дана датированная ссылка, то следует использовать указанную версию этого документа. Если после принятия настоящего стандарта в ссылочный документ, на который дана датированная ссылка, внесено изменение, затрагивающее положение, на которое дана ссылка, то это положение применяется без учета данного изменения. Если ссылочный документ отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

(примечание в ред. Изменения N 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 12.12.2023 N 1559-ст)

Метод основан на извлечении цефалоспоринов из анализируемой пробы с последующим количественным определением их методом ВЭЖХ-МС/МС в режиме мониторинга множественных реакций (ММР). Количественное определение проводят методом внутреннего стандарта.

4.1 Применяемые в работе реактивы относятся к веществам 1-го и 2-го класса опасности по ГОСТ 12.1.007, при работе с ними необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005.

4.2 Помещения, в которых проводят анализ и подготовку проб, должны быть оборудованы приточно-вытяжной вентиляцией.

4.3 Приготовление градуировочных растворов проводят в вытяжном шкафу.

4.4 При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдают правила по электробезопасности по ГОСТ 12.1.019 и правила безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением по ГОСТ 12.2.085.

4.5 Применяемые при определении остаточных содержаний цефалоспоринов средства измерений должны иметь свидетельства о поверке, вспомогательное оборудование - свидетельства об аттестации, оформленные в соответствии с требованиями национального законодательства в области обеспечения единства измерений, действующего на территории государства, принявшего стандарт.

4.6 К выполнению измерений методом ВЭЖХ-МС/МС допускаются лица, владеющие техникой ВЭЖХ-МС/МС и изучившие инструкции по эксплуатации применяемого оборудования.

4.7 При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

5.1 Для определения остаточного содержания цефалоспоринов применяют следующие средства измерений, вспомогательное оборудование, материалы и посуду:

- весы неавтоматического действия высокого класса точности по ГОСТ OIML R 76-1 с пределами допускаемой погрешности не более +/- 0,03 г;

- весы специального (I) класса точности с пределами допускаемой абсолютной погрешности не более +/- 0,5 мг;

- pH-метр или универсальный иономер диапазоном измерения от 4 до 9 ед. pH с погрешностью измерения не более +/- 0,05 ед. pH;

- масс-спектрометр, оснащенный источником ионизации с электрораспылением, квадрупольными анализаторами, с диапазоном измерений от 25 до 1050 атомных единиц массы (а.е.м.) и относительным средним квадратическим отклонением выходного сигнала по площади пика не более 10%, с режимом получения и анализа фрагментных ионов (режим МС/МС);

(в ред. Изменения N 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 12.12.2023 N 1559-ст)

- систему высокоэффективной жидкостной хроматографии, оснащенную бинарным насосом со смесителем, системой фильтрования и дегазации подвижных фаз, термостатом хроматографической колонки, обеспечивающим температуру нагрева до (50 +/- 1) °C;

- колонку хроматографическую <*>, заполненную обращенно-фазным сорбентом C18 с размером частиц не более 5,0 мкм, длиной 150 мм и внутренним диаметром 2,1 мм;

(в ред. Изменения N 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 12.12.2023 N 1559-ст)

--------------------------------

<*> Допускается применение хроматографических колонок, заполненных обращенно-фазным сорбентом C8 или C18 с диаметром частиц не более 5 мкм, длиной не менее 50 мм.

(сноска введена Изменением N 1, введенным в действие Приказом Росстандарта от 12.12.2023 N 1559-ст)

- компьютер с установленным программным обеспечением для управления масс-спектрометром и обработки результатов измерений;

- модуль термостатируемый нагревательный с системой отдувки растворителей инертным газом, позволяющий проводить концентрирование при температуре до 40 °C;

(в ред. Изменения N 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 12.12.2023 N 1559-ст)

- устройство вакуумное для твердофазной экстракции;

- картриджи готовые или набивные для твердофазной экстракции вместимостью не менее 3 см³, заполненные обращенно-фазным сорбентом с диаметром частиц сорбента от 20 до 50 мкм;

(в ред. Изменения N 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 12.12.2023 N 1559-ст)

- баню ультразвуковую с рабочей частотой не менее 20 Гц и объемом не менее 1 дм³;

- баню водяную лабораторную;

- встряхиватель (шейкер) для пробирок вибрационного, ротационного, линейного или орбитального типа;

(в ред. Изменения N 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 12.12.2023 N 1559-ст)

- генератор азота с объемной долей азота не менее 99,999% и воздушным компрессором. Допускается применение баллонного газа с характеристиками не ниже указанных;

(в ред. Изменения N 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 12.12.2023 N 1559-ст)

- измельчитель-гомогенизатор лабораторный;

- камеру лабораторную морозильную с рабочим диапазоном температур от минус 15 °C до минус 25 °C;

- систему получения деионизированной воды высокой чистоты с удельным сопротивлением 18 МОм·см;

- холодильник бытовой с рабочим диапазоном температур от 2 °C до 8 °C;

- центрифугу лабораторную рефрижераторную со скоростью вращения не менее 6000 об/мин и диапазоном температур от 4 °C до 20 °C с адаптерами для пробирок вместимостью 15 см³;

- центрифугу лабораторную с центробежным ускорением не менее 20 000 g и с адаптерами для пробирок вместимостью 1,5 см³;

- шкаф сушильный;

(в ред. Изменения N 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 12.12.2023 N 1559-ст)

- пробы, не содержащие цефалоспоринов, подготовленные и проанализированные ранее в соответствии с требованиями разделов 7 и 8, в зависимости от типа исследуемой матрицы ("чистые" пробы <*>);

--------------------------------

<*> Срок хранения "чистых" проб при температуре от минус 15 °C до минус 25 °C - не более 3 мес.

- фильтры нейлоновые мембранные с размером диаметра пор 0,2 мкм;

- виалы (флаконы) для автоматического устройства ввода проб, вместимостью 2 см³, с завинчивающимися крышками;

- виалы (флаконы) или пробирки полипропиленовые вместимостью 15 см³ с завинчивающимися крышками;

- пробирки микроцентрифужные полипропиленовые вместимостью 1,5 см³;

- колбы мерные 2-25(100,250,1000) - 2 по ГОСТ 1770;

- пипетки 2-2-1-2(5,10) по ГОСТ 29227;

- дозаторы механические одноканальные переменной вместимости 10 - 100, 20 - 200, 100 - 1000 мм³, 1 - 5 см³ по ГОСТ 28311;

(в ред. Изменения N 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 12.12.2023 N 1559-ст)

- пробирки П-2-10-14/23 ХС по ГОСТ 1770;

- стакан В-1-1000 ТС по ГОСТ 25336;

- цилиндры 1-25(100,1000)-2 по ГОСТ 1770;

(в ред. Изменения N 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 12.12.2023 N 1559-ст)

- систему получения инертного газа для концентрирования жидкостей.

(введено Изменением N 1, введенным в действие Приказом Росстандарта от 12.12.2023 N 1559-ст)

5.2 При определении остаточного содержания цефалоспоринов применяют следующие реактивы:

- азот газообразный технический 1-го сорта по ГОСТ 9293;

(в ред. Изменения N 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 12.12.2023 N 1559-ст)

- аммиака раствор концентрированный 32% по ГОСТ 24147, ос.ч.;

- аммоний уксуснокислый по ГОСТ 3117, ч.д.а.;

- аммоний углекислый кислый по ГОСТ 3762, ч.д.а.;

- ацетон по ГОСТ 2603;

- ацетонитрил для ВЭЖХ с массовой долей основного вещества не менее 99,9%;

- воду деионизированную для ВЭЖХ, полученную с использованием системы производства ультрачистой воды;

(в ред. Изменения N 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 12.12.2023 N 1559-ст)

- 1,4-дитиоэритритол с массовой долей основного вещества не менее 95,0%;

- изооктан, ч.д.а.;

- йодацетамид с массовой долей основного вещества не менее 95,0%;

- кислоту муравьиную по ГОСТ 5848, ч.д.а.;

- метанол по ГОСТ 6995, х.ч.;

- натрия гидроксид по ГОСТ 4328, ч.д.а.;

- эфир этиловый уксусной кислоты (этилацетат) по ГОСТ 22300, ч.д.а.

5.3 При определении остаточного содержания цефалоспоринов в качестве образцов сравнения применяют следующие соединения.

5.3.1 Для приготовления исходных растворов с массовой долей основного вещества не менее 85,0%:

- цефацетрил;

- цефалексин;

- цефалоним;

- цефоперазон;

- цефкином;

- цефапирин;

- дезацетил цефапирин;

- цефадроксил;

- цефсулодин;

- цефотаксим;

- цефтибутен;

- цефподоксим;

- цефпиром сульфат;

- цефотиам;

- цефаклор;

- цефетамет;

- цефепим;

- цефтиофур.

5.3.2 Для приготовления исходных растворов внутренних стандартов с массовой долей основного вещества не менее 85,0%:

- цефетамет-Д3;

- десфуроил цефтиофур-Д3.

5.4 Допускается применение других средств измерений и посуды, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающим необходимую точность измерения, а также вспомогательного оборудования, реактивов и материалов по качеству не ниже вышеуказанных.

6.1.1 Мойку и сушку посуды проводят в отдельном помещении, оборудованном приточно-вытяжной вентиляцией. Для сушки лабораторной посуды и подготовки реактивов необходимо использовать отдельные сушильные шкафы.

6.1.2 Стеклянную посуду подвергают стандартной процедуре очистки лабораторной посуды с последующей последовательной промывкой органическими растворителями: этилацетатом (однократно), ацетоном (дважды).

6.1.3 Процедуру промывки органическими растворителями следует проводить в вытяжном шкафу. Рекомендуется на стадиях промывки использовать ультразвуковую баню. Окончательную сушку посуды проводят в сушильном шкафу, установленном в вытяжном шкафу, при температуре от 105 °C до 110 °C.

6.1.4 Каждую новую партию реактивов проверяют на отсутствие контаминации анализируемыми соединениями путем проведения холостого опыта в соответствии с процедурой анализа.

6.2.1.1 Для приготовления подвижной фазы А в мерную колбу вместимостью 1000 см³ приливают 600 см³ деионизированной воды, 5,0 см³ муравьиной кислоты, перемешивают и доводят объем раствора деионизированной водой до метки на колбе.

6.2.1.2 Для приготовления подвижной фазы Б в мерную колбу вместимостью 1000 см³ приливают 600 см³ метанола, 5,0 см³ муравьиной кислоты, перемешивают и доводят объем раствора метанолом до метки на колбе.

Срок хранения растворов при температуре от 15 °C до 25 °C - не более 2 мес.

В стакан вместимостью 1000 см³ помещают 0,79 г аммония углекислого кислого и 900 см³ деионизированной воды, перемешивают до полного растворения соли. Измеряют pH и доводят его значение до (9,0 +/- 0,1) ед. pH с помощью концентрированного раствора аммиака. Полученный раствор помещают в мерную колбу вместимостью 1000 см³, доводят объем буферного раствора деионизированной водой до метки на колбе и перемешивают.

Срок хранения раствора при температуре 4 °C - не более 1 мес.

В стакан вместимостью 1000 см³ помещают 0,76 г уксуснокислого аммония и 900 см³ деионизированной воды, перемешивают до полного растворения соли. Измеряют pH и доводят его значение до (7,0 +/- 0,1) ед. pH с помощью концентрированного раствора аммиака. Полученный раствор помещают в мерную колбу вместимостью 1000 см³, доводят объем буферного раствора деионизированной водой до метки на колбе и перемешивают.

Срок хранения раствора при температуре 4 °C - не более 1 мес.

В мерную колбу вместимостью 250 см³ вносят 1 г 1,4-дитиоэритритола, приливают 200 см³ аммонийного буферного раствора (см. 6.2.2), перемешивают и, после полного растворения 1,4-дитиоэритритола, доводят объем полученного раствора этим же растворителем до метки на колбе.

Раствор используют свежеприготовленным.

В мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 14 г йодацетамида, приливают 80 см³ ацетатного буферного раствора (см. 6.2.3), перемешивают и, после полного растворения йодацетамида, доводят объем полученного раствора этим же растворителем до метки на колбе.

Раствор используют свежеприготовленным.

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ вносят 0,4 г гидроксида натрия, приливают 800 см³ деионизированной воды, перемешивают и, после полного растворения основания, доводят объем полученного раствора деионизированной водой до метки на колбе.

Срок хранения раствора при температуре 4 °C - не более 1 мес.

6.3.1.1 Приготовление исходных стандартных растворов цефалоспоринов, не содержащих цефтиофур (растворы C₀) и исходного раствора внутреннего стандарта D₀ с массовыми концентрациями 200 мкг/см³

Внутренний стандарт для цефалоспоринов, не содержащих цефтиофур - цефетамет-Д3.

Для приготовления исходных стандартных растворов C₀ и D₀ рассчитывают необходимую массу i-го вещества, эквивалентную 5,0 мг, с учетом содержания основного вещества для каждого определяемого аналита и внутреннего стандарта по формуле

где C - массовая концентрация i-го аналита в стандартном растворе, мкг/см³;

V - объем мерной колбы, см³;

P_i - массовая доля основного вещества в i-м стандартном образце, %;

M_i - молярная масса основного вещества в i-м стандартном образце, г/моль;

M_{аналита i} - молярная масса i-го аналита, г/моль.

В мерные колбы вместимостью 25 см³ по отдельности вносят рассчитанные массы исходных веществ (взвешивание проводят с точностью до первого десятичного знака). Приливают по 15 см³ метанола, перемешивают и, после полного растворения сухого вещества, доводят объем растворов метанолом до метки на колбе. Помещают в ультразвуковую баню на 5 мин в режиме перемешивания.

Срок хранения растворов при температуре от минус 15 °C до минус 25 °C - не более одного года.

Перед применением растворы выдерживают при комнатной температуре в темном месте не менее 30 мин.

6.3.1.2 Приготовление рабочих стандартных растворов цефалоспоринов, не содержащих цефтиофур (растворы C₁ - C₃) и внутреннего стандарта цефетамета - Д3 (растворы D₁, D₂)

Рабочие растворы C₁ - C₃, D₁, D₂ готовят в мерных пробирках вместимостью 10 см³ в соответствии с рисунком 1.

Растворы хранят при температуре от минус 15 °C до минус 25 °C.

Срок хранения растворов C₁, D₁ - не более 6 мес, C₂, D₂ - не более 3 мес, C₃ - не более одной недели.

Перед применением растворы выдерживают при комнатной температуре в темном месте не менее 30 мин.

6.3.1.3 Приготовление матричных градуировочных растворов (растворы G₁ - G₅)

Матричные градуировочные растворы G₁ - G₅ готовят в виалах или пропиленовых пробирках вместимостью 15 см³ из "чистых" проб массой 1,0 г, в которые вносят рабочий раствор внутреннего стандарта D₂ и рабочие растворы определяемых аналитов C₁, C₂, C₃ в соответствии с таблицей 1.

Пробирки встряхивают в шейкере в течение 1 - 2 мин, выдерживают в темноте при комнатной температуре в течение 10 мин и проводят дальнейшую обработку растворов согласно разделу 7.

Срок хранения растворов G₁ - G₅ при температуре от 2 °C до 8 °C - не более 1 сут.

6.3.2.1 Приготовление исходного стандартного раствора цефтиофура (раствор ) и исходного раствора внутреннего стандарта с массовыми концентрациями 200 мкг/см³

Внутренний стандарт для цефтиофура - десфуроил цефтиофур-Д3.

Для приготовления исходных стандартных растворов и рассчитывают необходимую массу i-го вещества, эквивалентную 5,0 мг основного вещества для цефтиофура и внутреннего стандарта, исходя из массовой доли в исходном веществе по формуле 1.

В мерные колбы вместимостью 25 см³ вносят по отдельности рассчитанные массы исходных веществ (взвешивание проводят с точностью до первого десятичного знака). Приливают по 15 см³ метанола, перемешивают и после полного растворения сухого вещества доводят объем растворов метанолом до метки на колбе. Помещают в ультразвуковую баню на 5 мин в режиме перемешивания.

Срок хранения растворов при температуре от минус 15 °C до минус 25 °C - не более одного года.

Перед применением растворы выдерживают при комнатной температуре в темном месте не менее 30 мин.

6.3.2.2 Приготовление рабочих стандартных растворов цефтиофура (раствор - ) и внутреннего стандарта (растворы , )

Рабочие растворы - , , готовят в пробирках вместимостью 10 см³ в соответствии с рисунком 2.

Растворы хранят при температуре от минус 15 °C до минус 25 °C.

Срок хранения растворов , - не более 6 мес, , - не более 3 мес, - не более одной недели.

Перед применением растворы выдерживают при комнатной температуре в темном месте не менее 30 мин.

6.3.2.3 Приготовление матричных градуировочных растворов - 

Матричные градуировочные растворы - готовят в виалах или полипропиленовых пробирках вместимостью 15 см³ из "чистых" проб массой 1,0 г, в которые вносят рабочий раствор внутреннего стандарта и рабочие растворы определяемого аналита , , в соответствии с таблицей 2.

Пробирки встряхивают в шейкере в течение 1 мин, выдерживают в темноте при комнатной температуре в течение 10 мин и проводят дальнейшую обработку пробы согласно разделу 7.

Срок хранения растворов - при температуре от 2 °C до 8 °C - не более 1 сут.

7.1.1 Отбор проб мяса, субпродуктов - по ГОСТ 7269.

7.1.2 Отбор проб мяса и печени птицы - по ГОСТ 31467.

7.1.3 Отбор проб мясных продуктов - по ГОСТ 4288, ГОСТ 9792.

7.1.4 Отбор проб молока и молочных продуктов по ГОСТ 26809.1, сыра - по ГОСТ 26809.2.

7.1.5 Отбор проб яиц - по ГОСТ 31654, пищевых яичных продуктов - по ГОСТ 31720.

7.1.6 Пробы, отобранные по 7.1.1, 7.1.2, при отсутствии возможности анализа в день отбора замораживают и хранят при температуре от минус 15 °C до минус 25 °C до проведения анализа.

7.2.1.1 Подготовку проб молока и молочных продуктов проводят по ГОСТ 26809.1, сыра - по ГОСТ 26809.2, восстановление сухих молочных продуктов - по ГОСТ 29245. Мышечную ткань предварительно очищают от грубой соединительной ткани. Мясо, субпродукты, мясные продукты измельчают на гомогенизаторе. Подготовка проб яиц, восстановление сухих яичных продуктов - по ГОСТ 31720. Обработку проб проводят в соответствии с рисунком 3.

(в ред. Изменения N 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 12.12.2023 N 1559-ст)

7.2.1.2 Очистка подготовленных проб методом ТФЭ

Картриджи для твердофазной экстракции предварительно кондиционируют, последовательно пропуская 2 см³ метанола и 2 см³ деионизированной воды (вакуум или избыточное давление не применяют). Затем пропускают через картридж пробу, полученную в соответствии с 7.2.1.1. Промывают картридж 2 см³ деионизированной воды и сушат в вакууме водоструйного насоса в течение 10 мин. Элюируют определяемые вещества в новую полипропиленовую пробирку вместимостью 15 см³ с помощью 3 см³ ацетонитрила. Упаривают элюат до 0,1 - 0,2 см³ в токе азота при температуре не более 40 °C, добавляют 0,5 см³ подвижной фазы А (см. 6.2.1.1), перемешивают и переносят в полипропиленовую пробирку вместимостью 1,5 см³. Доводят объем раствора до 1,0 см³ подвижной фазой А, центрифугируют при 15 000 об/мин и температуре 4 °C в течение 10 мин. Затем фильтруют через мембранный фильтр в виалу вместимостью 2 см³ и используют для измерения методом ВЭЖХ-МС/МС.

7.2.2.1 Подготовку проб проводят аналогично 7.2.1.1. Обработку пробы проводят в соответствии с рисунком 4.

7.2.2.2 Очистка подготовленных проб методом ТФЭ

Картриджи для твердофазной экстракции предварительно кондиционируют, последовательно пропуская 2 см³ метанола и 2 см³ аммонийного буферного раствора (см. 6.2.2). Затем пропускают через картридж пробу, полученную в соответствии с 7.2.2.1 (вакуум или избыточное давление не применяют). Промывают картридж 2 см³ аммонийного буферного раствора (см. 6.2.2) и 1 см³ раствора гидроксида натрия (см. 6.2.6) и сушат в вакууме водоструйного насоса в течение 5 мин. Элюируют определяемые вещества в новую полипропиленовую пробирку вместимостью 15 см³ с помощью 3 см³ ацетонитрила. Упаривают элюат до 0,1 - 0,2 см³ в токе азота при температуре не более 40 °C, добавляют 0,5 см³ подвижной фазы А (см. 6.2.1.1), перемешивают и переносят в полипропиленовую пробирку вместимостью 1,5 см³. Доводят объем раствора до 1,0 см³ подвижной фазой А (см. 6.2.1.1), центрифугируют при 15 000 об/мин и температуре 4 °C в течение 10 мин. Затем фильтруют через мембранный фильтр в виалу вместимостью 2 см³ и используют для измерения методом ВЭЖХ-МС/МС.

8.1.1 Масс-спектрометр и хроматограф включают в соответствии с руководством (инструкцией) по эксплуатации и устанавливают параметры рабочих режимов масс-спектрометрического детектирования и хроматографического разделения.

8.1.2 Например, для колонки диаметром 2,1 мм, длиной 150 мм, с обращенно-фазным сорбентом C18 с размером частиц не более 5,0 мкм, соблюдают следующие условия хроматографирования:

- температура колонки - 40 °C;

- скорость потока подвижной фазы - 0,2 см³/мин;

- объем вводимой пробы - 20 мм³.

Разделение проводят в режиме градиентного элюирования (приготовление подвижных фаз А и Б по 6.2.1) в соответствии с таблицами 3 и 4.

8.1.3 Параметры режима ММР при измерении цефалоспоринов приведены в таблице 5.

Примечание - Приведенные выше параметры хроматографического разделения и масс-спектрометрического детектирования могут отличаться в зависимости от используемого оборудования.

Параметры настройки масс-спектрометрического детектора:

- напряжение на распыляющем капилляре (IS) 5500 В при регистрации положительных ионов;

- температура источника 450 °C;

- разрешение квадруполей Q1/Q3 - единичное;

- давление газа для фрагментации (CAD) - 6 кПа.

8.1.4 Контроль чувствительности хромато-масс-спектрометрической системы осуществляют введением в инжектор хроматографа 20 мм³ матричного градуировочного раствора G₅ или (см. 6.3.1.3, 6.3.2.3) в зависимости от типа анализируемой матрицы. Полученное соотношение сигнал/шум для каждого аналита должно быть не менее 10.

Построение и расчет градуировочной характеристики проводят в каждой серии анализов с помощью программного обеспечения хромато-масс-спектрометрической системы.

8.2.1 Проводят измерения не менее четырех матричных градуировочных растворов, приготовленных по 6.3.1.3, 6.3.2.3, в порядке возрастания их концентраций. Каждый градуировочный раствор измеряют два раза. Определяют времена удерживания ион-продуктов аналитов и их внутренних стандартов.

8.2.2 Вычисление площади пика проводят для каждого иона-продукта анализируемых аналитов и их внутренних стандартов. Количественное определение цефалоспоринов проводят по одному, наиболее интенсивному, иону-продукту. Для подтверждения наличия цефалоспоринов рассчитывают отношения площади пика двух ионов-продуктов для каждого аналита в градуировочном растворе.

Соответствие аналитов и их внутренних стандартов указано в 6.3.1.1 и 6.3.2.1.

8.2.3 Градуировочную характеристику строят в координатах "отношение площади пика определяемого соединения к площади пика внутреннего стандарта этого соединения" - "отношение концентраций аналита и внутреннего стандарта". При построении градуировочной характеристики используют линейную регрессию вида y = a + bx, при этом коэффициент корреляции должен быть не менее 0,98. Построение градуировочной характеристики проводят при каждой серии измерений заново.

8.2.4 Построение линейного градуировочного графика и расчет концентрации цефалоспоринов, цефтиофура и его метаболитов в анализируемых пробах выполняется системой обработки данных в автоматическом режиме.

8.3.1 Для измерения содержания цефалоспоринов проводят ВЭЖХ-МС/МС анализ в соответствии с руководством (инструкцией) по эксплуатации применяемого оборудования. Для каждого аналита проводят два параллельных измерения.

8.3.2 Анализ выполняют в виде серии измерений, включающей следующие образцы:

- подвижную фазу А (см. 6.2.1.1);

- "чистую" пробу (см. 5.1);

- градуировочные растворы (см. 6.3.1.3, 6.3.2.3);

- экстракты анализируемых проб, приготовленных по 7.2.

8.3.3 Определяют и регистрируют на хроматограмме время удерживания пиков двух ионов-продуктов каждого аналита, соответствующее времени удерживания, найденному при измерении градуировочных растворов по 8.1.3.

9.1 В соответствии с данными, полученными при анализе градуировочных растворов, проводят количественную обработку хроматограмм с использованием программного обеспечения, получая значения массовой концентрации цефалоспоринов, цефтиофура и его метаболитов в двух параллельных измерениях анализируемой пробы.

9.2 Содержание i-го аналита X_i, мкг/кг, вычисляют по формуле <*>

--------------------------------

<*> При оформлении результатов содержание i-го аналита в анализируемой пробе представляют в мкг/кг.

где C_i - массовая концентрация аналита в анализируемой пробе, найденная по градуировочному графику, нг/см³;

V_i - объем, до которого разбавлена проба, см³;

m_i - масса анализируемой пробы, г.

9.3 За результат измерений принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных измерений анализируемой пробы, если выполняется условие приемлемости по ГОСТ ИСО 5725-6 (пункту 5.2.2).

Установленный в настоящем стандарте метод обеспечивает выполнение определения содержания цефалоспоринов, в т.ч. метаболитов цефтиофура, с расширенной неопределенностью результатов аналитических измерений при коэффициенте охвата k = 2 и доверительной вероятности P = 0,95, указанной в таблицах 6 - 8.

Содержание i-го аналита, мкг/кг, представляют в виде

где - среднеарифметическое значение вычислений двух параллельных измерений содержания i-го аналита в анализируемой пробе (см. 9.3), мкг/кг;

U_i - значение относительной расширенной неопределенности содержания i-го аналита для соответствующего диапазона измерений (в соответствии с таблицами 6 - 8), %;

- значение расширенной неопределенности в абсолютных единицах, мкг/кг.

Числовое значение результата измерений должно оканчиваться цифрой того же разряда, что и значение расширенной неопределенности, содержащее не более четырех значащих цифр и выраженное в микрограммах на килограмм (мкг/кг).

В случае необходимости допускается представление результата измерений в мг/кг путем деления значения содержания i-го аналита, полученного в соответствии с 9.2, и значения расширенной неопределенности в абсолютных единицах (мкг/кг) на 1000 (с сохранением количества значащих цифр).

(абзац введен Изменением N 1, введенным в действие Приказом Росстандарта от 12.12.2023 N 1559-ст)

(раздел 12 в ред. Изменения N 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 12.12.2023 N 1559-ст)

Контроль стабильности результатов измерений осуществляют в соответствии с документами, утвержденными в лаборатории. Рекомендуется использование контрольных карт Шухарта в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-6.