"ГОСТ 34743-2021. Межгосударственный стандарт. Продукция пищевая рыбная. Метод определения фикотоксинов в двустворчатых моллюсках с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием"
(введен в действие Приказом Росстандарта от 26.08.2021 N 829-ст)

Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением "Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" (ФГБУ "ВГНКИ")

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 14 июля 2021 г. N 59)

За принятие проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 26 августа 2021 г. N 829-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 34743-2021 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 декабря 2021 г.

5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Настоящий стандарт распространяется на пищевую рыбную продукцию - двустворчатых моллюсков - и устанавливает метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (далее - ВЭЖХ-МС/МС) для определения массовой доли фикотоксинов в диапазоне измерений:

- для азаспирацида-1, азаспирацида-2, азаспирацида-3, азаспирацида-4, азаспирацида-5 от 1 до 50 мкг/кг;

- для сакситоксина, декарбамоил-сакситоксина, неосакситоксина, декарбамоил-неосакситоксина, гониаутоксина-2, гониаутоксина-3, гониаутоксина-5, гониаутоксина-6, декарбамоил-гониаутоксина-2, декарбамоил-гониаутоксина-3, N-сульфокарбамоил-гониаутоксина-2, N-сульфокарбамоил-гониаутоксина-3 от 40 до 1600 мкг/кг;

- для окадаиковой кислоты, динофизистоксина-1, динофизистоксина-2 от 62,5 до 625 мкг/кг;

- для пектенотоксина-2, 13-десметилспиролида C, 13, 19-дидесметилспиролида C, 20-метилспиролида G, йессотоксина, гомойессотоксина от 50 до 500 мкг/кг;

- для бреветоксина-2 от 100 до 500 мкг/кг;

- для домоевой кислоты от 2000 до 40 000 мкг/кг.

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

ГОСТ 12.1.005 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.018 Система стандартов безопасности труда. Пожаровзрывобезопасность статического электричества. Общие требования

ГОСТ 12.1.019 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ 12.4.021 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования

ГОСТ 61 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия

ГОСТ 1770 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3118 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ 4328 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 5848 Реактивы. Кислота муравьиная. Технические условия

ГОСТ 5962 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия

ГОСТ 7636-85 Рыба, морские млекопитающие, морские беспозвоночные и продукты их переработки. Методы анализа

ГОСТ 25336 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 29227 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ 31339 Рыба, нерыбные объекты и продукция из них. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ ИСО 5725-6-2003 <*> Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике

--------------------------------

<*> В Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002.

ГОСТ ISO 7886-1 Шприцы инъекционные однократного применения стерильные. Часть 1. Шприцы для ручного использования

ГОСТ ISO/IEC 17025 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий

ГОСТ OIML R 76-1 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов и классификаторов в сети Интернет на официальном сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации (www.easc.by) или в указателях национальных стандартов, издаваемых в государствах, указанных в предисловии, или на официальных сайтах соответствующих органов по стандартизации. Если на документ дана недатированная ссылка, то следует использовать документ, действующий на текущий момент, с учетом всех внесенных в него изменений. Если заменен ссылочный документ, на который дана датированная ссылка, то следует использовать указанную версию этого документа. Если после принятия настоящего стандарта в ссылочный документ, на который дана датированная ссылка, внесено изменение, затрагивающее положение, на которое дана ссылка, то это положение применяется без учета данного изменения. Если ссылочный документ отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3.1 В настоящем стандарте применен следующий термин с соответствующим определением:

3.1.1

3.2 В настоящем стандарте применены следующие обозначения и сокращения:

- липофильные фикотоксины:

- AZA-1 - азаспирацид-1;

- AZA-2 - азаспирацид-2;

- AZA-3 - азаспирацид-3;

- AZA-4 - азаспирацид-4;

- AZA-5 - азаспирацид-5;

- BTX-2 - бреветоксин-2;

- hYTX - гомойессотоксин;

- DTX-1 - динофизистоксин-1;

- DTX-2 - динофизистоксин-2;

- YTX - йессотоксин;

- PTX-2 - пектенотоксин-2;

- OA - окадаиковая кислота;

- 13-desMeC - 13-десметилспиролид C;

- 13, 19-didesMeC - 13, 19-дидесметилспиролид C;

- SPX20G - 20-метилспиролид G;

- гидрофильные фикотоксины:

- GTX-2 - гониаутоксин-2;

- GTX-3 - гониаутоксин-3;

- GTX-5 - гониаутоксин-5;

- GTX-6 - гониаутоксин-6;

- DC-GTX-2 - декарбамоил-гониаутоксин-2;

- DC-GTX-3 - декарбамоил-гониаутоксин-3;

- DC-NEOSTX - декарбамоил-неосакситоксин;

- DC-STX - декарбамоил-сакситоксин;

- NEOSTX - неосакситоксин;

- N-SC-GTX-2 - N-сульфокарбамоил-гониаутоксин-2;

- N-SC-GTX-3 - N-сульфокарбамоил-гониаутоксин-3;

- STX - сакситоксин;

- DA - домоевая кислота;

- CAS - уникальный численный идентификатор химических соединений, полимеров, биологических последовательностей нуклеотидов или аминокислот, смесей и сплавов, внесенных в реестр Chemical Abstracts Service.

Метод основан на экстракции определяемых веществ из анализируемой пробы с последующей очисткой гидрофильных фикотоксинов с помощью твердофазной экстракции, гидролизом эфиров окадаиковой кислоты, динофизистоксинов, идентификацией и количественным определением фикотоксинов по площадям пиков реакций "ион-предшественник - ион-продукт" с помощью градуировочной характеристики, полученной при анализе матричных градуировочных растворов методом ВЭЖХ-МС/МС в режиме мониторинга множественных реакций (MRM).

5.1 При определении содержания фикотоксинов должны быть соблюдены следующие условия:

Помещения и условия окружающей среды должны быть пригодными для осуществления лабораторной деятельности и не должны оказывать негативное влияние на достоверность получаемых результатов.

5.2 Применяемые в работе реактивы относятся к веществам 1-го и 2-го классов опасности, при работе с ними необходимо соблюдать общие требования безопасности обращения с вредными веществами, установленные ГОСТ 12.1.007. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать норм, установленных ГОСТ 12.1.005.

5.3 Помещения, в которых проводят анализ и подготовку проб, должны быть оборудованы приточно-вытяжной вентиляцией в соответствии с ГОСТ 12.4.021.

5.4 Приготовление и использование градуировочных растворов проводят в вытяжном шкафу при включенной вентиляции.

5.5 При работе с электроприборами следует соблюдать правила электробезопасности в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.019, пожаровзрывобезопасности - по ГОСТ 12.1.018 и инструкции по эксплуатации приборов.

5.6 К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих высшее образование, прошедших соответствующий инструктаж, владеющих техникой хромато-масс-спектрометрии и руководствующихся требованиями эксплуатации используемых приборов.

6.1 Для определения содержания фикотоксинов применяют следующие средства измерений, вспомогательное оборудование, материалы и посуду:

- весы специального (I) класса точности по ГОСТ OIML R 76-1 с пределами допускаемой абсолютной погрешности взвешивания не более +/- 0,3 мг;

- весы лабораторные высокого (II) класса точности с пределами допускаемой абсолютной погрешности взвешивания не более +/- 0,03 г;

- жидкостный хроматограф с тандемным масс-спектрометрическим детектором, включающий: жидкостный насос высокого давления, автоматический пробоотборник, термостат колонки, тройной квадрупольный масс-спектрометр с диапазоном измерений от 100 до 1160 а. е. м.;

- компьютер с установленным программным обеспечением для управления масс-спектрометром и обработки результатов измерений;

- колонку хроматографическую <*> длиной не более 150 мм, диаметром не более 2,1 мм, заполненную обращенно-фазным сорбентом C₁₈ с диаметром частиц не более 5,0 мкм;

--------------------------------

<*> Например, типа Pursuit C18. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не исключает возможность использования других колонок с аналогичными характеристиками.

- колонку хроматографическую <**> длиной не более 150 мм, диаметром не более 2,1 мм, заполненную силикагелем, модифицированным для гидрофильной хроматографии (HILIC) с диаметром частиц не более 5,0 мкм;

--------------------------------

<**> Например, типа ZIC-HILIC. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не исключает возможность использования других колонок с аналогичными характеристиками.

- шейкер вортексного типа вибрационный (вортекс) со скоростью вращения от 0 до 2500 об/мин;

- шейкер переворачивающего типа со скоростью вращения от 20 до 100 об/мин, с адаптерами для пробирок вместимостью 15 и 50 см³;

- центрифугу лабораторную рефрижераторную со скоростью вращения не менее 4500 об/мин и диапазоном задаваемых температур от 4 °C до 20 °C, с ротором и адаптерами для пробирок вместимостью 15 и 50 см³;

- центрифугу лабораторную рефрижераторную со скоростью вращения не менее 15 000 об/мин и диапазоном задаваемых температур от 4 °C до 20 °C, с угловым ротором и адаптером для микроцентрифужных пробирок вместимостью 2 см³;

- баню ультразвуковую с рабочей частотой не менее 20 кГц и объемом не менее 1 дм³;

- баню водяную лабораторную с диапазоном рабочих температур от 5 °C до 100 °C;

- измельчитель-гомогенизатор лабораторный;

- систему получения деионизированной воды высокой чистоты с удельным сопротивлением 18 МОм·см при температуре 20 °C;

- шкаф сушильный с максимальной температурой нагрева не менее 110 °C и погрешностью поддержания заданной температуры +/- 5 °C;

- холодильник бытовой с рабочим диапазоном температур от 2 °C до 8 °C;

- камеру лабораторную морозильную с рабочим диапазоном температур от минус 18 °C до минус 25 °C;

- пробы, не содержащие фикотоксины, подготовленные и проанализированные ранее в соответствии с требованиями разделов 8 и 9 ("чистые" пробы <***>);

--------------------------------

<***> Срок хранения "чистых" проб при температуре от минус 15 °C до минус 25 °C - не более 6 мес.

- пробирки полипропиленовые вместимостью 15 и 50 см³ с навинчиваемыми пластмассовыми крышками;

- пробирки полипропиленовые микроцентрифужные вместимостью 2 см³;

- виалы (флаконы) стеклянные для автосамплера вместимостью 2 см³ с навинчиваемыми крышками и тефлоновыми прокладками диаметром 9 мм;

- картриджи для твердофазной экстракции <*4> вместимостью 3 см³, массой сорбента 100 мг;

--------------------------------

<*4> Например, картриджи твердофазной экстракции Evolute ABN. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не исключает возможность использования других картриджей с аналогичными характеристиками.

- фильтры мембранные диаметром не более 25 мм с размером пор не более 0,45 мкм;

- дозаторы пипеточные одноканальные переменного объема 0,5 - 10, 0, 5 - 50, 10 - 100, 100 - 1000, 500 - 5000 мм³;

- пипетка 1-2-1-25 по ГОСТ 29227;

- пробирки мерные градуированные П-2-5-14/23, П-2-10-14/23 по ГОСТ 1770;

- колбы П-1-100-29/34 ТС, П-1-1000-45/40 ТС по ГОСТ 25336;

- колбы 1-50(100, 1000)-2 по ГОСТ 1770;

- цилиндры 1-100(500, 1000)-1 по ГОСТ 1770;

- шприцы полипропиленовые медицинские одноразовые вместимостью 2 см³ по ГОСТ ISO 7886-1;

- бутыли стеклянные с горловиной под крышку с винтовой резьбой вместимостью 1000 см³.

6.2 При определении содержания фикотоксинов применяют следующие реактивы:

- ацетонитрил для ВЭЖХ (HPLC);

- аммония гидроксид водный 30%-ный раствор;

- аммония формиат с содержанием основного вещества не менее 99%;

- воду деионизированную для ВЭЖХ;

- кислоту муравьиную по ГОСТ 5848, ч. д. а.;

- кислоту соляную по ГОСТ 3118, х. ч.;

- кислоту уксусную ледяную по ГОСТ 61, х. ч.;

- метанол для ВЭЖХ с содержанием основного вещества не менее 99,5%;

- натрия гидроокись по ГОСТ 4328, х. ч.;

- спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962.

6.3 При определении содержания фикотоксинов применяют стандартные образцы растворов (в скобках приведены регистрационные номера CAS):

- AZA-1 (214899-21-5) с массовой концентрацией основного вещества 1,1 мкг/см³;

- AZA-2 (265996-92-7) с массовой концентрацией основного вещества 1,1 мкг/см³;

- AZA-3 (265996-93-8) с массовой концентрацией основного вещества 1,0 мкг/см³;

- AZA-4 (344422-49-7) с массовой концентрацией основного вещества 1,2 мкг/см³;

- AZA-5 (344422-51-1) с массовой концентрацией основного вещества 1,2 мкг/см³;

- STX (35554-08-6) с массовой концентрацией основного вещества 24,7 мкг/см³;

- DC-STX (58911-04-09) с массовой концентрацией основного вещества 19,4 мкг/см³;

- NEOSTX (64296-20-4) с массовой концентрацией основного вещества 20,5 мкг/см³;

- DC-NEOSTX (68683-58-9) с массовой концентрацией основного вещества 10,1 мкг/см³;

- смесь растворов GTX-2 (60508-89-6) и GTX-3 (60537-65-7) с массовыми концентрациями основного вещества GTX-2 - 22,2 мкг/см³ и GTX-3 - 8,2 мкг/см³;

- GTX-5 (64296-25-9) с массовой концентрацией основного вещества 21,0 мкг/см³;

- смесь растворов GTX-5 (64296-25-9) и GTX-6 (82810-44-4) с массовыми концентрациями основного вещества GTX-5 - 1,1 мкг/см³ и GTX-6 - 4,9 мкг/см³;

- смесь растворов DC-GTX-2 (86996-87-4) и DC-GTX-3 (87038-53-7) с массовыми концентрациями основного вещества DC-GTX-2 - 35,1 мкг/см³ и DC-GTX-3 - 8,0 мкг/см³;

- смесь растворов N-SC-GTX-2 (80173-30-4) и N-SC-GTX-3 (80226-62-6) с массовыми концентрациями основного вещества N-SC-GTX-2 - 40,1 и N-SC-GTX-3 - 11,5 мкг/см³;

- OA (78111-17-8) с массовой концентрацией основного вещества 16,0 мкг/см³;

- DTX-1 (81720-10-7) с массовой концентрацией основного вещества 6,4 мкг/см³;

- DTX-2 (139933-46-3) с массовой концентрацией основного вещества 2,0 мкг/см³;

- PTX-2 (97564-91-5) с массовой концентрацией основного вещества 7,16 мкг/см³;

- 13-desMeC (334974-07-1) с массовой концентрацией основного вещества 6,3 мкг/см³;

- 13, 19-didesMeC (908118-02-5) с массовой концентрацией основного вещества 11,7 мкг/см³;

- SPX20G (849215-95-8) с массовой концентрацией основного вещества 7,0 мкг/см³;

- YTX (112574-50-2) с массовой концентрацией основного вещества 7,4 мкг/см³;

- hYTX (196309-94-1) с массовой концентрацией основного вещества 6,1 мкг/см³;

- BTX-2 (79580-28-2) с массовой концентрацией основного вещества 100,0 мкг/см³;

- DA (14277-97-5) с массовой концентрацией основного вещества 44,5 мкг/см³.

6.4 Допускается применение других средств измерений и посуды, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающим необходимую точность измерения, а также оборудования, реактивов и материалов по качеству не ниже вышеуказанных.

7.1.1 Мойку и сушку посуды проводят в отдельном помещении, оборудованном приточно-вытяжной вентиляцией. Для сушки лабораторной посуды и подготовки реактивов необходимо использовать отдельные сушильные шкафы.

7.1.2 Стеклянную посуду подвергают стандартной процедуре очистки лабораторной посуды с последующей последовательной промывкой: однократно смесью спирт этиловый/деионизированная вода в объемном соотношении 1:1, после чего дважды - деионизированной водой.

7.1.3 Рекомендуется на стадиях промывки использовать ультразвуковую баню. Окончательную сушку посуды проводят в сушильном шкафу при температуре от 100 °C до 110 °C.

7.1.4 Каждую новую партию реактивов проверяют на отсутствие контаминации анализируемыми соединениями путем проведения холостого опыта в соответствии с процедурой анализа.

7.2.1 Приготовление растворов подвижных фаз А₁ и Б₁ для определения липофильных фикотоксинов и DA

7.2.1.1 Для приготовления подвижной фазы А₁ в мерную колбу вместимостью 1000 см³ вносят 100 см³ деионизированной воды, 2 см³ муравьиной кислоты, добавляют 0,128 г формиата аммония, перемешивают и доводят объем до метки деионизированной водой. Полученный раствор переносят в стеклянную бутыль.

7.2.1.2 Для приготовления подвижной фазы Б₁ в мерную колбу вместимостью 1000 см³ вносят 950 см³ ацетонитрила, добавляют 2 см³ муравьиной кислоты и 0,128 г формиата аммония, перемешивают и доводят объем до метки ацетонитрилом. Полученный раствор переносят в стеклянную бутыль.

Срок хранения подвижных фаз А₁ и Б₁ при температуре от 15 °C до 25 °C - не более 3 мес.

7.2.2 Приготовление растворов подвижных фаз А₂ и Б₂ для определения гидрофильных фикотоксинов

7.2.2.1 Для приготовления подвижной фазы А₂ в мерную колбу вместимостью 1000 см³ вносят 100 см³ деионизированной воды, 0,38 см³ муравьиной кислоты, добавляют 0,63 г формиата аммония, перемешивают и доводят объем до метки деионизированной водой. Полученный раствор переносят в стеклянную бутыль.

7.2.2.2 Для приготовления подвижной фазы Б₂ в мерную колбу вместимостью 1000 см³ вносят 800 см³ ацетонитрила, добавляют 0,5 г формиата аммония, перемешивают и доводят объем до метки ацетонитрилом. Полученный раствор переносят в стеклянную бутыль.

Срок хранения подвижных фаз А₂ и Б₂ при температуре от 15 °C до 25 °C - не более 3 мес.

В мерную колбу вместимостью 50 см³ вносят 5,0 г гидроксида натрия, доводят объем до метки деионизированной водой, перемешивают.

Срок хранения при температуре от 15 °C до 25 °C - не более 1 мес.

В мерную колбу вместимостью 50 см³ вносят около 30 см³ деионизированной воды, осторожно приливают 10,5 см³ соляной кислоты и после охлаждения смеси доводят объем раствора до метки деионизированной водой, перемешивают.

Срок хранения при температуре от 15 °C до 25 °C - не более 1 мес.

В плоскодонную колбу вместимостью 1000 см³ вносят 500 см³ метанола и 500 см³ деионизированной воды, перемешивают.

Срок хранения при температуре от 15 °C до 25 °C - не более 6 мес.

В мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 0,093 см³ раствора гидроксида аммония и доводят до метки деионизированной водой.

Срок хранения при температуре от 15 °C до 25 °C - не более 1 мес.

В плоскодонную колбу вместимостью 100 см³ вносят 1 см³ уксусной кислоты и 99 см³ деионизированной воды, перемешивают.

Срок хранения при температуре от 15 °C до 25 °C - не более 1 мес.

7.4.1.1 Приготовление рабочего стандартного раствора L1-1 липофильных фикотоксинов AZA-1, AZA-2, AZA-3, AZA-4, AZA-5, BTX-2, YTX, PTX-2, hYTX, 13-desMeC, 13, 19-didesMeC, SPX20G

Для приготовления рабочего стандартного раствора L1-1 в мерную пробирку вместимостью 5 см³ вносят аликвоты стандартных образцов липофильных фикотоксинов в количествах, указанных в таблице 1, и доводят объем раствора до метки "5 см³" метанолом.

7.4.1.2 Приготовление рабочего стандартного раствора L1-2

Для приготовления рабочего стандартного раствора L1-2 в стеклянную виалу вносят 0,1 см³ рабочего стандартного раствора L1-1 и 0,9 см³ метанола, перемешивают.

Срок хранения растворов L1-1 и L1-2 при температуре не выше минус 18 °C - не более 6 мес.

7.4.1.3 Приготовление рабочего стандартного раствора L2-1 липофильных фикотоксинов OA, DTX-1, DTX-2

Для приготовления рабочего стандартного раствора L2-1 в мерную пробирку вместимостью 5 см³ вносят аликвоты стандартных образцов липофильных фикотоксинов в количествах, указанных в таблице 2, и доводят объем раствора до метки "1 см³" метанолом.

7.4.1.4 Приготовление рабочего стандартного раствора L2-2 липофильных фикотоксинов OA, DTX-1, DTX-2

Для приготовления рабочего стандартного раствора L2-2 в стеклянную виалу вносят 0,1 см³ рабочего стандартного раствора L2-1 и 0,9 см³ метанола, перемешивают.

Срок хранения растворов L2-1 и L2-2 при температуре не выше минус 18 °C - не более 6 мес.

7.4.2.1 Приготовление рабочего стандартного раствора H1 гидрофильных фикотоксинов STX, DC-STX, DC-NEOSTX, NEOSTX, GTX-2, GTX-3, GTX-5, GTX-6, DC-GTX-2, DC-GTX-3, N-SC-GTX-2, N-SC-GTX-3

Для приготовления рабочего стандартного раствора H1 в мерную пробирку вместимостью 10 см³ вносят аликвоты стандартных образцов гидрофильных фикотоксинов в количествах, указанных в таблице 3, и доводят объем раствора до метки "5 см³" 1%-ным раствором уксусной кислоты, приготовленным по 7.3.5.

Срок хранения раствора H1 при температуре не выше минус 18 °C - не более 12 мес.

7.4.2.2 Приготовление рабочего стандартного раствора D1 домоевой кислоты

Для приготовления рабочего стандартного раствора D1 в мерную пробирку вместимостью 5 см³ вносят 0,224 см³ стандартного образца DA, доводят объем раствора до метки "5 см³" смесью метанол - деионизированная вода, приготовленной по 7.3.3, и перемешивают. Массовая концентрация DA в полученном растворе составляет 2 мкг/см³.

Срок хранения раствора D1 при температуре не выше минус 18 °C - не более 6 мес.

Примечание - В случае отличия фактических концентраций аналитов в приобретенных образцах стандартных растворов от значений, указанных в 6.3, необходимо рассчитать объемы аликвот, необходимые для получения заданных концентраций аналитов в растворах L1-1, L2-1, H1 и D1 по формуле

где V₁ - объем аликвоты стандартного раствора, см³;

V₂ - объем рабочего стандартного раствора, см³;

C₂ - массовая концентрация аналита в рабочем стандартном растворе, мкг/см³;

C₁ - массовая концентрация основного вещества в стандартном образце, мкг/см³.

Матричные градуировочные растворы фикотоксинов готовят в полипропиленовых пробирках вместимостью 15 см³ из "чистых" проб, подготовленных и проанализированных ранее в соответствии с требованиями разделов 8 и 9, и рабочих стандартных растворов в объемах, указанных в таблицах 4 - 6.

7.6.1 Установление и расчет градуировочной характеристики проводят в каждой серии анализов с помощью программного обеспечения жидкостного хроматографа с масс-спектрометрическим детектором.

7.6.2 Проводят измерения не менее трех матричных градуировочных растворов, приготовленных по 7.5, в порядке возрастания их концентраций.

Градуировочную характеристику устанавливают в координатах "площадь пика определяемого аналита" - "концентрация определяемого аналита в градуировочном растворе". При построении градуировочной характеристики используют линейную функцию вида y = a + bx, при этом квадрат коэффициента корреляции должен быть не менее 0,98.

Отбор проб пищевой рыбной продукции - двустворчатых моллюсков - по ГОСТ 31339. Подготовка проб двустворчатых моллюсков - по ГОСТ 7636-85 (пункт 2.9.2).

8.2.1 Взвешивают (2,00 +/- 0,02) г гомогенизированной пробы в полипропиленовой пробирке вместимостью 50 см³, добавляют 9 см³ метанола, закрывают пробкой и помещают пробирку в шейкер переворачивающего типа для экстракции на 10 мин. Затем центрифугируют со скоростью не менее 4500 об/мин в течение 10 мин при температуре не выше 20 °C.

После центрифугирования надосадочную жидкость переливают в чистую полипропиленовую пробирку вместимостью 50 см³, добавляют 9 см³ метанола. Пробирку с плотно закрытой крышкой помещают в ультразвуковую баню для повторной экстракции на 10 мин, а затем - в шейкер переворачивающего типа на 10 мин. После этого проводят центрифугирование со скоростью не менее 4500 об/мин в течение 10 мин при температуре не выше 20 °C. Полученные экстракты объединяют и доводят объем до 20 см³ метанолом.

8.2.2 Для определения 13-desMeC, 13, 19-didesMeC, SPX20G, AZA-1, AZA-2, AZA-3, AZA-4, AZA-5, BTX-2, PTX-2, YTX, hYTX и свободных OA, DTX-1, DTX-2 метанольный экстракт (см. 8.2.1) объемом 1 см³ фильтруют через мембранный фильтр в виалу для ВЭЖХ-МС/МС анализа.

8.2.3 Для определения суммарного содержания OA, DTX-1, DTX-2 проводят гидролиз метанольного экстракта (см. 8.2.1). В полипропиленовую пробирку вместимостью 15 см³ приливают 2 см³ метанольного экстракта (см. 8.2.1), добавляют 0,25 см³ раствора гидроксида натрия, приготовленного по 7.3.1, перемешивают на вортексе в течение 30 с. Далее пробирку с плотно закрытой крышкой помещают в водяную баню на 40 мин при температуре не менее 76 °C. После гидролиза пробирку охлаждают до комнатной температуры. Затем осторожно приливают 0,25 см³ раствора соляной кислоты, приготовленного по 7.3.2, для нейтрализации и помещают пробирку на 1 мин в шейкер переворачивающего типа и оставляют на 5 мин при комнатной температуре для уравновешивания. Далее фильтруют 1 см³ нейтрализованного метанольного экстракта через мембранный фильтр в виалу и используют для ВЭЖХ-МС/МС анализа.

8.3.1 Взвешивают (5,00 +/- 0,05) г гомогенизированной пробы в полипропиленовой пробирке вместимостью 50 см³, добавляют 5 см³ 1%-ного раствора уксусной кислоты, приготовленного по 7.3.5, закрывают пробкой и помещают пробирку на 5 мин на водяную баню при температуре не ниже 100 °C. Затем пробу охлаждают до комнатной температуры и центрифугируют при 4500 об/мин в течение 15 мин при температуре не выше 20 °C. После центрифугирования надосадочную жидкость переливают в чистую полипропиленовую пробирку вместимостью 15 см³.

В пробирку с осадком добавляют 4 см³ 1%-ного раствора уксусной кислоты, приготовленного по 7.3.5, встряхивают в течение 1 мин в ультразвуковой бане и повторяют процедуру экстракции. Полученные экстракты объединяют и доводят объем до 10 см³ 1%-ным раствором уксусной кислоты, приготовленным по 7.3.5.

В новую полипропиленовую пробирку вместимостью 15 см³ отбирают 1 см³ экстракта, добавляют 3 см³ ацетонитрила, встряхивают в шейкере переворачивающего типа в течение 5 мин и центрифугируют при 4500 об/мин в течение 10 мин при температуре не выше 4 °C.

8.3.2 Полученный экстракт очищают методом твердофазной экстракции. Перед нанесением экстракта картридж кондиционируют 3 см³ ацетонитрила и промывают 3 см³ деионизированной воды. После этого экстракт наносят на картридж, сразу собирая в новую полипропиленовую пробирку вместимостью 15 см³. Очищенный экстракт, при необходимости, фильтруют через мембранный фильтр в виалу и используют для ВЭЖХ-МС/МС-анализа.

Взвешивают (1,00 +/- 0,01) г гомогенизированной пробы в полипропиленовой пробирке вместимостью 50 см³, добавляют 9 см³ смеси метанола и деионизированной воды, приготовленной по 7.3.3, закрывают пробкой и помещают пробирку в шейкер переворачивающего типа на 10 мин. Затем центрифугируют при 4500 об/мин в течение 10 мин при температуре не выше 4 °C. Надосадочный слой переносят в новую полипропиленовую пробирку вместимостью 50 см³. Экстракцию повторяют, экстракты объединяют и доводят объем до 20 см³ смесью метанола и деионизированной воды, приготовленной по 7.3.3.

100 мм³ экстракта переносят в пробирку вместимостью 2 см³, добавляют 900 мм³ подвижной фазы А₁, центрифугируют при 15 000 об/мин в течение 10 мин при температуре не выше 4 °C, при необходимости фильтруют через мембранный фильтр в виалу и используют для ВЭЖХ-МС/МС-анализа.

8.5 Допускается готовить растворы других номинальных объемов при условии соблюдения соотношений между объемами растворов и объемами аликвот или массами навесок реагентов, установленных в настоящем стандарте.

9.1.1 Хромато-масс-спектрометр включают в соответствии с руководством (инструкцией) по эксплуатации и устанавливают параметры рабочих режимов масс-спектрометрического детектирования и хроматографического разделения.

9.1.2 Условия хроматографического анализа:

- температура колонки - 40 °C;

- температура в отсеке устройства ввода проб - 10 °C;

- объем вводимой пробы - 20 мм³.

9.1.3 Разделение липофильных фикотоксинов и домоевой кислоты проводят на хроматографической колонке длиной не более 150 мм, диаметром не более 2,1 мм, заполненной обращенно-фазным сорбентом C₁₈ с диаметром частиц не более 5,0 мкм. Хроматографические условия для разделения приведены в таблице 7.

9.1.4 Разделение гидрофильных фикотоксинов проводят на хроматографической колонке длиной не более 150 мм, диаметром не более 2,1 мм, заполненной силикагелем, модифицированным для гидрофильной хроматографии (HILIC) с диаметром частиц не более 5,0 мкм. Хроматографические условия для разделения приведены в таблице 8.

9.1.5 Общие параметры настройки масс-спектрометрического детектора:

- напряжение на распыляющем капилляре (IS) 4500 В при регистрации положительных ионов (минус 4500 В при регистрации отрицательных ионов);

- температура источника - 450 °C;

- разрешение квадруполей Q1/Q3 - единичное;

- значение вспомогательного газа (CUR) - 25;

- значение газа источника (GS1) - 60;

- значение распыляющего газа (GS2) - 60;

- значение давления в ячейке столкновений (CAD) - 5.

9.1.6 Параметры метода воздействия на ионы в режиме мониторинга множественных реакций (MRM) приведены в таблицах 9 - 11.

Примечание - Приведенные выше параметры хроматографического разделения и масс-спектрометрического детектирования могут отличаться в зависимости от используемого оборудования.

9.2.1 Для измерения содержания фикотоксинов проводят ВЭЖХ-МС/МС анализ в соответствии с руководством (инструкцией) по эксплуатации применяемого оборудования в условиях хроматографических измерений с параметрами, указанными в 9.1.

9.2.2 Анализ выполняют в виде серии измерений, включающей следующие образцы:

- подвижную фазу А₁ или А₂;

- "чистую пробу";

- матричные градуировочные растворы, приготовленные по 7.5;

- экстракты анализируемых проб, подготовленных по 8.2 - 8.4.

9.2.3 Определяют и регистрируют на хроматограмме время удерживания пиков сигналов реакций "ион-предшественник" - "ион-продукт" каждого определяемого вещества, соответствующее времени удерживания, найденному при измерении градуировочных растворов, приготовленных по 7.5.

9.2.4 В соответствии с данными, полученными при измерении градуировочных растворов, проводят количественную обработку хроматограмм с использованием программного обеспечения.

9.2.5 Расчеты содержания аналита и площади пика выполняют системой обработки данных в автоматическом режиме, при этом массовую долю фикотоксина X, мкг/кг, вычисляют по формуле

где a - тангенс угла наклона градуировочной кривой, нг/см³·ед. площади;

S - площадь пика сигнала определяемого фикотоксина, ед. площади;

d - фактор разведения (отношение объема экстракта к массе пробы), указанный в таблице 12, см³/г.

10.1 Результаты измерений обрабатывают с помощью программного обеспечения и выдают в виде массовой доли анализируемого вещества. В случае выхода полученного значения за верхнюю границу диапазона измерений допускается разбавление образца путем внесения 1 см³ образца в мерную пробирку вместимостью 10 см³ и доведения объема до 10 см³ соответствующей подвижной фазой А₁ или А₂. Разбавленный образец анализируют повторно.

10.2 За результат измерений принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных измерений массовой доли фикотоксинов в анализируемой пробе, выраженное в микрограммах на килограмм (мкг/кг), если выполняется условие приемлемости:

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений массовой доли фикотоксинов, мкг/кг,

r - значение предела повторяемости, %.

Полученные среднеарифметические значения двух параллельных измерений анализируемой пробы округляют:

- в диапазоне значений от 1,0 до 100,0 мкг/кг включительно - до первого десятичного знака после запятой;

- в диапазоне значений свыше 100 мкг/кг - до целого числа.

10.3 При невыполнении условия (3) измерения повторяют.

Установленный в настоящем стандарте метод обеспечивает выполнение измерений массовой доли фикотоксинов с относительной расширенной неопределенностью результатов аналитических измерений, указанной в таблице 13, при коэффициенте охвата k = 2.

Массовую долю i-го фикотоксина, мкг/кг, представляют в виде

где - среднеарифметическое значение результатов двух параллельных измерений содержания i-го фикотоксина в анализируемой пробе, мкг/кг;

U_i - значение относительной расширенной неопределенности содержания i-го фикотоксина для соответствующего диапазона измерений, % (см. таблицу 13);

- значение расширенной неопределенности в абсолютных единицах, мкг/кг.

Контроль качества результатов измерений в пределах лаборатории рекомендуется осуществлять по ГОСТ ИСО 5725-6, используя контроль стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения повторяемости по ГОСТ ИСО 5725-6-2003 (пункт 6.2.2) и показателя правильности по ГОСТ ИСО 5725-6-2003 (пункт 6.2.4).

Периодичность контроля и процедуры контроля стабильности результатов измерений устанавливают в руководстве по качеству лаборатории в соответствии с ГОСТ ISO/IEC 17025.