"ГОСТ 34230-2017. Межгосударственный стандарт. Продукция соковая. Определение свободных аминокислот методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(введен в действие Приказом Росстандарта от 12.12.2017 N 1903-ст)

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены в ГОСТ 1.0-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

1 РАЗРАБОТАН Некоммерческой организацией "Российский союз производителей соков" (РСПС) при участии Акционерного общества "Мултон" (АО "Мултон") и Федерального государственного бюджетного учреждения науки "Федеральный исследовательский центр питания, биотехнологии и безопасности пищи" (ФГБУН "ФИЦ питания и биотехнологии")

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 30 ноября 2017 г. N 52-2017)

За принятие проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 12 декабря 2017 г. N 1903-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 34230-2017 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2019 г.

5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)

Настоящий стандарт распространяется на соковую продукцию из фруктов и овощей и устанавливает метод высокоэффективной жидкостной обращенно-фазовой хроматографии для определения массовой концентрации (массовой доли) свободных аминокислот:

- L-Аспарагиновой кислоты;

- L-Глутамина;

- L-Глутаминовой кислоты;

- L-Серина;

- L-Гистидина;

- L-Треонина;

- L-Аспарагина;

- L-Аланина;

- L-Аргинина;

- L-Тирозина;

- кислоты;

- L-Метионина;

- L-Валина;

- L-Изолейцина;

- L-бета-Фенилаланина;

- L-Лейцина;

- L-Лизина;

- Глицина;

- L-Пролина;

- L(+)-Орнитина.

Диапазон измерений массовой концентрации (массовой доли) свободных аминокислот составляет от 5,0 до 20,0 мг/дм³ (млн^-1) без учета разбавления и концентрирования проб.

Примечание - 1 млн^-1 соответствует 1 мг/кг.

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019-79 <*> Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

--------------------------------

<*> В Российской Федерации действует ГОСТ Р 12.1.019-2009.

ГОСТ 61-75 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия

ГОСТ OIML R 76-1-2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 199-78 Реактивы. Натрий уксуснокислый 3-водный. Технические условия

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ ISO 3696-2013 <**> Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы контроля

--------------------------------

<**> В Российской Федерации действует ГОСТ Р 52501-2005 (ИСО 3696:1987) "Вода для лабораторного анализа. Технические условия".

ГОСТ 4199-76 Реактивы. Натрий тетраборнокислый 10-водный. Технические условия

ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ ИСО 5725-6-2003 <***> Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике

--------------------------------

<***> В Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002.

ГОСТ 5962-2013 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ ISO 7886-1-2011 Шприцы инъекционные однократного применения стерильные. Часть 1. Шприцы для ручного использования

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий

ГОСТ 21400-75 Стекло химико-лабораторное. Технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 22967-90 Шприцы медицинские инъекционные многократного применения. Общие технические требования и методы испытаний

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26313-2014 Продукты переработки фруктов и овощей. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ 28311-89 Дозаторы медицинские лабораторные. Общие технические требования и методы испытаний

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

Метод основан на переводе свободных аминокислот во флуоресцирующие соединения предколоночной дериватизацией и количественном анализе полученных производных с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на обращенно-фазовых хроматографических колонках, заполненных сорбентом C18 с размером частиц менее 5 мкм с использованием флуориметрического детектора.

4.1 Хроматограф жидкостный с флуориметрическим детектором (диапазон длин волн возбуждения 200 - 890 нм, эмиссии 210 - 900 нм), относительным среднеквадратическим отклонением выходного сигнала, не более:

- по площади пика - 1%;

- по времени удерживания - 0,3%;

- по площади пика за 8 ч непрерывной работы - 2%;

- по времени удерживания за 8 ч непрерывной работы - 2%.

4.2 Колонка хроматографическая C18 <*> длиной 250 мм и внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная обращенно-фазовым сорбентом C18 с энд-кэпингом с размером частиц менее 5 мкм.

--------------------------------

<*> Примером является хроматографическая колонка Zorbax SB C18 компании Agilent. Информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является поддержкой указанного продукта.

4.3 Колонка защитная (предколонка), размеры защитной колонки - 10 x 4,6 мм, заполненная тем же обращенно-фазовым сорбентом.

4.4 Весы неавтоматического действия специального класса точности по ГОСТ OIML R 76-1, пределом допускаемой абсолютной погрешности измерения массы +/- 0,001 г.

4.5 Иономер (pH-метр) с пределом абсолютной погрешности измерения +/- 0,1 ед. pH.

4.6 Пипетки градуированные лабораторные стеклянные 1-1-2-1, 1-1-2-2, 1-1-2-5 и 1-1-2-10 по ГОСТ 29227.

4.7 Посуда мерная лабораторная стеклянная 2-го класса точности по ГОСТ 1770:

- цилиндр 1-1000-2;

- колбы мерные 2-50-2, 2-100-2, 2-250-2, 2-500-2, 2-1000-2.

4.8 Посуда лабораторная стеклянная по ГОСТ 25336:

- воронки В-56-80 ХС, В-75-80 ХС, В-75-110 ХС, В-100-150 ХС;

- стаканы любого типа исполнения 1 вместимостью 50, 100, 1000 см³;

- пробирки вместимостью 10 и 20 см³.

4.9 Пробирки полимерные центрифужные конические с завинчивающейся крышкой вместимостью 15 см³.

4.10 Палочки стеклянные длиной 220 мм и диаметром 5 мм, выполненные из химически стойкого стекла любого класса по ГОСТ 21400.

4.11 Фильтры мембранные с насадкой на шприц с размером пор 0,20 и 0,45 мкм.

4.12 Фильтры мембранные диаметром 47 мм с размером диаметра пор мембраны 0,20 и 0,45 мкм.

4.13 Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.

4.14 Установка для фильтрации и дегазации жидкостей.

4.15 Виалы вместимостью 2 см³ для автоматического ввода проб и вставки в виалы для микроколичеств проб.

4.16 Микрошприц вместимостью 250 мм³.

4.17 Шприц медицинский вместимостью 5 см³ многократного применения по ГОСТ 22967 или однократного применения по ГОСТ ISO 7886-1.

4.18 Микродозаторы пипеточные одноканальные переменного объема от 20 до 200 мм³ с соответствующими наконечниками (без воздушного промежутка) по ГОСТ 28311.

4.19 Склянки из темного стекла с завинчивающейся крышкой.

4.20 Центрифуга, обеспечивающая фактор разделения (g-фактор) не менее 800.

4.21 Вода дистиллированная по ГОСТ 6709 или вода по ГОСТ ISO 3696 1-й степени чистоты.

4.22 Ацетонитрил, ос.ч., имеющий оптическую плотность не более 0,02 при 200 нм.

4.23 Кислота уксусная ледяная по ГОСТ 61, х.ч.

4.24 Тетрагидрофуран (далее - ТГФ) для хроматографии, с массовой долей основного вещества не менее 99,9% и показателем преломления n_D в пределах от 1,3439 до 1,3440.

4.25 Спирт этиловый по ГОСТ 5962.

4.26 о-Фталевый альдегид с массовой долей основного вещества не менее 97%.

4.27 3-Меркаптопропионовая кислота с массовой долей основного вещества не менее 99%.

4.28 9-Флуоренилметоксикарбонилхлорид с массовой долей основного вещества не менее 97%.

4.29 Натрий тетраборнокислый 10-водный по ГОСТ 4199, х.ч.

4.30 Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, х.ч.

4.31 Натрий уксуснокислый 3-водный по ГОСТ 199, ч.д.а.

4.32 Аминокислоты:

- L-Аспарагиновая кислота, массовая доля основного вещества не менее 98,0%;

- L-Глутамин, массовая доля основного вещества не менее 99,0%;

- L-Глутаминовая кислота, массовая доля основного вещества не менее 99,0%;

- L-Серин, массовая доля основного вещества не менее 99,0%;

- L-Гистидин, массовая доля основного вещества не менее 99,0%;

- L-Треонин, массовая доля основного вещества не менее 98,0%;

- L-Аспарагин, массовая доля основного вещества не менее 98,0%;

- L-Аланин, массовая доля основного вещества не менее 98,0%;

- L-Аргинин, массовая доля основного вещества не менее 98,0%;

- L-Тирозин, массовая доля основного вещества не менее 98,0%;

- кислота, массовая доля основного вещества не менее 99,0%;

- L-Метионин, массовая доля основного вещества не менее 98,0%;

- L-Валин, массовая доля основного вещества не менее 98,0%;

- L-изолейцин, массовая доля основного вещества не менее 98,0%;

- L-бета-Фенилаланин, массовая доля основного вещества не менее 98,0%;

- L-Лейцин, массовая доля основного вещества не менее 98,0%;

- L-Лизин, массовая доля основного вещества не менее 98,0%;

- Глицин, массовая доля основного вещества не менее 98,5%;

- L-Пролин, массовая доля основного вещества не менее 99,0%;

- L-Орнитин моногидрохлорид, массовая доля основного вещества >= 99,0%.

Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками не ниже вышеуказанных, вспомогательного оборудования, материалов с техническими характеристиками не ниже вышеуказанных и химических реактивов аналогичной или более высокой квалификации.

Отбор проб соковой продукции проводят по ГОСТ 26313.

6.1 Подготовка хроматографа к работе

Включение и подготовку хроматографа к работе, вывод его на режим и выключение по окончании работы выполняют в соответствии с руководством по эксплуатации.

6.2 Общие положения

Для дериватизации аминокислот используют смесь реагентов: о-фталевого альдегида (далее - OPA) в присутствии нуклеофильного реагента (3-меркаптопропионовой кислоты) и 9-флуоренилметоксикарбонилхлорида (далее - FMOC).

Разделение аминокислот происходит при температуре 40 °C в градиентном режиме с использованием следующих подвижных фаз:

- ацетатный буфер с pH 7,2 ед. pH с добавкой тетрагидрофурана;

- смесь: ацетатный буфер/ацетонитрил/этанол.

Для продления срока службы и более эффективной работы колонки используют систему защиты (in-line фильтры на выходе из насоса и предколонку), периодическую промывку (не реже одного-двух раз в неделю) колонки с ацетонитрилом (в зависимости от числа проведенных анализов и концентрации органических веществ, прошедших через колонку) в течение 1 - 3 ч со скоростью 1,0 см³/мин с предварительной промывкой всей системы водой. После проведения анализа и промывки колонки во избежание образования кристаллов соли вся система также промывается водой.

Операции заполнения системы растворителями и промывка отдельных частей и системы в целом выполняют в соответствии с соответствующими руководствами по эксплуатации оборудования.

Детектирование разделенных производных аминокислот осуществляют с помощью флуориметрического детектора:

- при длине волны возбуждения 266 нм и длине волны испускания 305 нм - для производных о-фталевого альдегида;

- длине волны возбуждения 340 нм и длине волны испускания 420 нм - для производных пролина и орнитина с FMOC.

Идентификацию разделенных производных аминокислот проводят путем сравнения времен удерживания и коэффициентов удерживания со стандартной смесью аминокислот (см. приложение А).

6.3 Приготовление вспомогательных растворов

6.3.1 Приготовление раствора уксусной кислоты с массовой долей 2%

В мерную колбу вместимостью 50 см³ приливают ориентировочно 20 см³ воды, затем приливают 0,95 см³ ледяной уксусной кислоты и доводят водой до метки.

Раствор используют свежеприготовленным.

6.3.2 Приготовление подвижной фазы A

(4,080 +/- 0,001) г уксуснокислого 3-водного натрия взвешивают в стакане вместимостью 100 см³, растворяют в приблизительно 80 см³ воды, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см³, доводят водой до метки и перемешивают. Раствор переносят в мерный стакан вместимостью 1000 см³ и доводят pH до значения 7,2 ед. pH раствором уксусной кислоты, приготовленным по 6.3.1, регистрируя показания pH-метром. К полученному раствору добавляют 2 см³ тетрагидрофурана. Полученный раствор дегазируют на установке для фильтрации и дегазации жидкостей (см. 4.15) под вакуумом в течение 15 мин с одновременной фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.

Срок хранения раствора - не более трех дней при температуре 4 °C.

6.3.3 Приготовление подвижной фазы B

В цилиндр вместимостью 1000 см³ приливают 200 см³ ацетатного буфера (подвижной фазы A), приготовленного по 6.3.2, 640 см³ ацетонитрила и 160 см³ этилового спирта. Полученную смесь перемешивают и дегазируют на установке для фильтрации и дегазации жидкостей (см. 4.15) под вакуумом в течение 15 мин с одновременной фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.

Срок хранения смеси - не более трех дней при комнатной температуре.

6.3.4 Приготовление смеси дериватизирующих реагентов о-фталевого альдегида (OPA) и 3-меркаптопропионовой кислоты

(0,025 +/- 0,001) г о-фталевого альдегида растворяют в 2 см³ этанола и добавляют 20 мм³ 3-меркаптопропионовой кислоты.

Срок хранения смеси - не более 1 мес при температуре от 2 до 8 °C в склянке из темного стекла.

6.3.5 Приготовление раствора дериватизирующего реагента 9-метилхлороформиатфлуорена (FMOC)

(0,05 +/- 0,001) г 9-флуоренилметоксикарбонилхлорида растворяют в 10 см³ ацетонитрила.

Срок хранения раствора - не более 1 мес при температуре от 2 до 8 °C в склянке из темного стекла.

6.3.6 Приготовление раствора гидроксида натрия молярной концентрации 5 моль/дм³

20,0 г гидроксида натрия растворяют в 50 см³ воды, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ и доводят водой до метки.

Срок хранения раствора - не более 1 мес в сосуде из полимерного материала.

6.3.7 Приготовление боратного буферного раствора молярной концентрации 0,05 моль/дм³

4,77 г тетраборнокислого десятиводного натрия растворяют в 150 см³ воды, переносят раствор в мерную колбу вместимостью 250 см³ и доводят водой до метки. Приготовленный раствор переносят в стакан вместимостью 1000 см³ и доводят до 10,4 ед. pH раствором гидроксида натрия, приготовленного по 6.3.6, регистрируя показания pH-метром.

Срок хранения раствора - не более 1 мес.

6.4 Приготовление градуировочных растворов

6.4.1 Приготовление исходных градуировочных растворов аминокислот

Основной (раствор N 6), промежуточный (раствор N 5) и градуировочные растворы аминокислот (растворы N 1 - 4) готовят в соответствии с таблицей 2.

Примечание - При использовании в качестве солей аминокислот (например, лизина) для приготовления основного раствора необходимо пересчитывать массу навески на свободную аминокислоту.

Раствор N 4 используют в качестве одного из контрольных растворов при ежедневных анализах.

Срок хранения основного раствора N 6 - не более 5 сут при температуре от 2 до 6 °C.

Промежуточный раствор N 5 и градуировочные растворы используют свежеприготовленными.

6.4.2 Приготовление дериватизированных градуировочных растворов аминокислот

Во вставку для микроколичеств пипеточным дозатором помещают 10 мм³ градуировочного раствора (N 1 - 4 по таблице 1), 5 мм³ смеси OPA и 3-меркаптопропионовой кислоты (см. 6.3.4), 5 мм³ раствора FMOC (см. 6.3.5) и 50 мм³ боратного буферного раствора (см. 6.3.7). Смесь перемешивают и сразу же проводят хроматографический анализ аминокислот. Операцию повторяют для каждого градуировочного раствора (N 1 - 4 по таблице 1).

К массовой концентрации аминокислот в полученном дериватизированном градуировочном растворе дополняют значение, равное массовой концентрации аминокислот в соответствующем градуировочном растворе, приведенной в таблице 1.

6.5 Условия проведения измерений

При подготовке к проведению измерений и проведении измерений соблюдают следующие условия:

6.6 Условия хроматографического анализа

При проведении хроматографического анализа создают и поддерживают следующие условия:

- температура колонки - 40 °C;

- рабочие длины волн флуориметрического детектора:

266 нм (возбуждение)/305 нм (регистрация) - для производных о-фталевого альдегида,

340 нм (возбуждение)/420 нм (регистрация) - для производных пролина и орнитина с FMOC;

- объем вводимой пробы - 10 мм³;

- режим элюирования - градиентный, скорость потока 0,75 см³/мин (ориентировочное значение).

Параметры градиентного режима приведены в таблице 2.

6.7 Градуировка хроматографа

Градуировку хроматографа проводят в соответствии с руководством по эксплуатации оборудования и руководством пользователя программным обеспечением.

Дозируют в хроматограф дериватизированные градуировочные растворы (см. 6.4.2) после дериватизации и регистрируют площадь пиков производных соответствующих аминокислот. Площадь пиков производных аминокислот S, е.о.п.·с <*> и их массовая концентрация в градуировочных растворах c, мг/дм³, находятся в линейной зависимости

где k - градуировочный коэффициент (угол наклона), мг·дм^-3·(е.о.п.·с)^-1.

--------------------------------

<*> е.о.п. - единицы оптической плотности.

Коэффициенты k вычисляют по результатам анализа градуировочных растворов с помощью программно-аппаратного комплекса сбора и обработки данных или при его отсутствии в составе хроматографа по методу наименьших квадратов

где c_i - массовая концентрация аминокислоты в i-м градуировочном растворе, мг/дм³;

S_i - площадь пика соответствующей аминокислоты при анализе i-го градуировочного раствора, е.о.п.·с.

Градуировочную характеристику устанавливают при смене оборудования, колонок, условий хроматографического анализа или при выявлении несоответствий по результатам оперативного контроля или внутреннего аудита.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят, используя в качестве контрольных заново приготовленные по 6.4.2 дериватизированные градуировочные растворы из растворов N 3 и N 4 (см. таблицу 2) перед выполнением измерений.

Результаты контроля стабильности градуировочной характеристики признаются удовлетворительными при выполнении для каждого контрольного раствора следующего условия

где X_изм - результат измерения массовой концентрации аминокислоты в контрольных растворах, мг/дм³;

C_ст - фактическое значение массовой концентрации аминокислоты в контрольных растворах, мг/дм³;

G - норматив контроля стабильности градуировочной характеристики, %.

Во всем диапазоне градуировочной характеристики G принимают равным , где - границы относительной погрешности измерений массовой концентрации аминокислот (см. таблицу 3), %.

Если условие (3) не выполняется хотя бы для одного контрольного раствора, то градуировочную характеристику устанавливают заново во всем диапазоне измерений.

6.8 Мониторинг характеристик хроматографических колонок проводят в соответствии с приложением А.

7.1 Подготовка проб для измерений

7.1.1 При анализе каждой пробы проводят два параллельных измерения.

7.1.2 Осветленные соки, нектары и сокосодержащие напитки, не содержащие нерастворимые в воде вещества, разбавляют в 100 раз. Для этого 1 см³ пробы сока (см. раздел 5) помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³ и доводят водой до метки. Далее проводят дериватизацию аминокислот. Для этого во вставку для микроколичеств пипеточным дозатором помещают 10 мм³ разбавленной пробы, 5 мм³ смеси OPA и 3-меркаптопропионовой кислоты (см. 6.3.4), 5 мм³ раствора FMOC (см. 6.3.5) и 50 мм³ боратного буферного раствора (см. 6.3.7). Смесь перемешивают и сразу же проводят хроматографический анализ по 7.2.3.

7.1.3 Соки, нектары и сокосодержащие напитки с мякотью или содержащие нерастворимые в воде вещества разбавляют объемным методом в 100 раз. Для этого 1 см³ пробы сока (см. раздел 5) помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³ и доводят водой до метки. Далее разбавленную пробу центрифугируют со скоростью не менее 9000 об/мин в течение 10 мин и проводят все операции, предусмотренные 7.1.2, начиная с отбора аликвоты пробы во вставку для микроколичеств.

7.1.4 Концентрированные соки и пюре различных фруктов, ягод и овощей разбавляют водой в 500 раз весовым методом. Для этого взвешивают ориентировочно 0,15 г концентрированного сока в стакане вместимостью 100 см³ с погрешностью +/- 0,001 г и доводят водой до 75 г, проводя взвешивание также с погрешностью +/- 0,001 г. Далее проводят все операции, описанные в 7.1.2.

7.1.5 При подготовке пробы по 7.1.4 результат измерений выражают в единицах массовой доли (млн^-1), по 7.1.2, 7.1.3 - в единицах массовой концентрации (мг/дм³).

7.2 Порядок проведения измерений

7.2.1 Включение и вывод хроматографической системы на рабочий режим, включая кондиционирование колонки, проводят в соответствии с руководствами по эксплуатации оборудования, колонки, и 6.2, 6.5.

7.2.2 Выключение хроматографической системы после выполнения анализов проводят в соответствии с руководством по эксплуатации оборудования и руководством пользователя программно-аппаратным комплексом сбора и обработки данных.

7.2.3 Подготовленную по 7.1.2 - 7.1.4 пробу вводят в хроматограф и анализируют в тех же условиях, что и дериватизированные градуировочные растворы (см. 6.6). Идентифицируют пики аминокислот по временам удерживания, используя при этом программное обеспечение к хроматографу. Для всех идентифицированных аминокислот вычисляют массовую концентрацию c_изм, мг/дм³, используя градуировочные характеристики по 6.7.

Примеры хроматограмм приведены в приложении Б.

8.1 Если подготовку пробы проводили по 7.1.2 или 7.1.3, то массовую концентрацию аминокислот в пробе C, мг/дм³, вычисляют по формуле

где c_изм - измеренное по 7.2.3 значение массовой концентрации соответствующей аминокислоты в подготовленной пробе, мг/дм³;

V₂ - объем мерной колбы, взятой для разбавления пробы, см³;

V₁ - объем пробы, отобранный для анализа, см³.

За результат измерений массовой концентрации аминокислот в пробе принимают среднеарифметическое значение , мг/дм³, результатов двух параллельных измерений C₁ и C₂, мг/дм³, при выполнении условия

где r_отн - предел повторяемости (см. таблицу 3), %.

8.2 Если подготовку пробы проводили по 7.1.4, то массовую долю аминокислот в пробе X, млн^-1, вычисляют по формуле

где X_изм - значение массовой доли аминокислоты в растворе, подготовленном по 7.1.4, принимаемое численно равным измеренному по 7.2.3 значению массовой концентрации, млн^-1;

m_общ - масса пробы анализируемой пробы с добавкой воды (см. 7.1.3), г;

m_X - масса анализируемой пробы, г.

8.3 За результат измерений массовой доли аминокислот в пробе принимают среднеарифметическое значение , млн^-1, результатов двух параллельных измерений X₁ и X₂, млн^-1, при выполнении условия

где r_отн - предел повторяемости (см. таблицу 3), %.

При невыполнении условий (5) и (7) получают еще два результата измерений в соответствии с разделом 7 и затем используют методы проверки приемлемости четырех результатов параллельных измерений и установления результата измерений согласно ГОСТ ИСО 5725-6 (подраздел 5.2).

8.4 Относительное расхождение между результатами измерений, полученными в двух лабораториях, не должно превышать предела значения критической разности CD_0,95

или

где и ( и ) - результаты измерений массовой концентрации (массовой доли) аминокислот, полученные в первой и второй лабораториях соответственно, мг/дм³ (млн^-1);

0,01 - коэффициент пересчета от процентов к абсолютным величинам;

CD_0,95 - критическая разность, %.

Значение критической разности вычисляют по формуле

где R_отн - предел воспроизводимости (см. таблицу 3), %;

r_отн - предел повторяемости (см. таблицу 3), %;

n₁ и n₂ - число параллельных измерений в первой и второй лабораториях соответственно.

При выполнении условий (8) или (9) приемлемы оба результата измерений, и в качестве окончательного результата используют их среднеарифметическое значение. При невыполнении этого условия рекомендуется провести мероприятия, предусмотренные ГОСТ ИСО 5725-6 (пункты 5.3.3 и 5.3.4).

8.5 Результаты измерений регистрируют в протоколе испытаний согласно ГОСТ ИСО/МЭК 17025 с указанием настоящего стандарта в следующем виде

или

где - среднеарифметическое значение результатов двух параллельных измерений массовой концентрации аминокислот, мг/дм³;

- значение границ абсолютной погрешности измерений массовой концентрации аминокислот для доверительной вероятности P = 0,95, мг/дм³, вычисленное по формуле

где - значение границ относительной погрешности измерений массовой концентрации (массовой доли) аминокислот для доверительной вероятности P = 0,95 (см. таблицу 3), %;

- среднеарифметическое результатов двух параллельных измерений массовой доли аминокислот, млн^-1;

- значение границ абсолютной погрешности измерений массовой доли аминокислот для доверительной вероятности P = 0,95, млн^-1, вычисленное по формуле

Контроль качества результатов измерений осуществляют, используя методы контроля стабильности среднеквадратического отклонения повторяемости и контроля стабильности среднеквадратического отклонения промежуточной прецизионности с применением контрольных карт Шухарта по ГОСТ ИСО 5725-6 (пункты 6.2.2, 6.2.3).

Периодичность процедуры контроля стабильности результатов измерений регламентируют в руководстве по качеству лаборатории в соответствии с ГОСТ ИСО/МЭК 17025 (пункт 4.2).

10.1 Условия безопасного проведения работ

При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности - по ГОСТ 12.1.004.

Требования электробезопасности при работе с приборами - по ГОСТ 12.1.019 и в соответствии с руководством по эксплуатации используемого оборудования.

10.2 Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке результатов допускаются инженер-химик, техник или лаборант, имеющие высшее или специальное образование, опыт работы в химической лаборатории и изучившие инструкцию по эксплуатации жидкостного хроматографа. Первое применение метода в лаборатории должно проводиться под руководством специалиста, владеющего теорией высокоэффективной жидкостной хроматографии и имеющего практические навыки в этой области.

А.1 Проверку оптимальности хроматографических условий (хроматографических характеристик колонки) проводят по хроматограмме стандартного раствора N 4 с помощью программного обеспечения или вручную по показателям в соответствии с таблицами А.1 и А.2.

--------------------------------

<*> Данные значения получены при использовании хроматографической колонки Zorbax SB C18 фирмы Agilent. Информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является поддержкой указанного продукта.

А.2 Время удерживания (абсолютное) аминокислот определяют непосредственно из хроматограмм двух параллельных измерений одной пробы. В случае обнаружения отклонения времени удерживания более чем на 5% от стандартного значения заново устанавливают градуировочную характеристику во всем диапазоне измерений. В случае выполнения условий неравенства (4) допускается программное изменение времен удерживания компонентов.

А.3 Коэффициент удерживания (емкости) k' вычисляют по формуле

где - приведенное время удерживания, мин;

t_M - время выхода неудерживаемого компонента, мин.

Колонка считается удовлетворительной при значении коэффициента емкости, не превышающем 10% от указанного в таблице А.1.

А.4 Число теоретических тарелок вычисляют по формуле

где 16 и 5,545 - множители, вытекающие из свойств нормального распределения;

t_R - время удерживания пика, мин;

W_b - ширина пика у основания, мин;

W_h - ширина пика на его полувысоте, мин.

Колонка считается удовлетворительной при значении числа теоретических тарелок не ниже 10% от указанного в таблице.

А.5 Коэффициент асимметрии вычисляют по формуле

где A - "левый" отрезок, образованный на горизонтальной линии, проведенной на высоте 10% от основания пика и разделенной вертикалью, опущенной из вершины пика;

B - "правый" отрезок, образованный на горизонтальной линии, проведенной на высоте 10% от основания пика и разделенной вертикалью, опущенной из вершины пика.

Колонка считается удовлетворительной при значении коэффициента асимметрии, не превышающем 1,75.

А.6 Разрешение R_s вычисляют по формуле

где t_R2, t_R1 - значения времени удерживания разделяемых полностью или критически (не полностью) компонентов, мин;

W_b1, W_b2 - ширина пиков у основания, мин.

А.7 По результатам двух параллельных измерений вычисляют средние значения R_s для пары разделяемых полностью или критически (не полностью) компонентов (n, n + 1). Колонка считается удовлетворительной при значениях R_{s n, n + 1} >= 1,25.

Контроль стабильности хроматографической колонки в процессе эксплуатации проводят не реже одного раза в две недели.

Б.1 Примеры хроматограмм аминокислот приведены на рисунках Б.1, Б.2.