"ГОСТ 33615-2015. Межгосударственный стандарт. Продукты пищевые, продовольственное сырье. Иммуноферментный метод определения остаточного содержания метаболита фуразолидона"
(введен в действие Приказом Росстандарта от 18.01.2016 N 4-ст)

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены".

1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением "Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" (ФГБУ "ВГНКИ")

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстандарт)

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 27 октября 2015 г. N 81-П)

За принятие проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 18 января 2016 г. N 4-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 33615-2015 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2017 г.

5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет.

Настоящий стандарт распространяется на мясо, мясо птицы, яйца, яичный порошок, яичный меланж, молоко, рыбу, мед и устанавливает иммуноферментный метод определения остаточного содержания метаболита фуразолидона (3-амино-2-оксазолидинона) в диапазоне измерений от 0,7 до 62,5 мкг/кг, для сухого молока - от 7 до 625 мкг/кг.

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019-79 <1> Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

--------------------------------

<1> В Российской Федерации действует ГОСТ Р 12.1.019-2009 "Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты".

ГОСТ OIML R 76-1-2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 334-73 Бумага масштабно-координатная. Технические условия

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 2652-78 Калия бихромат технический. Технические условия

ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ 4204-77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия

ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ ИСО 5725-6-2003 <2> Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике

--------------------------------

<2> В Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике".

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 7269-79 Мясо. Методы отбора образцов и органолептические методы определения свежести

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 19792-2001 <1> Мед натуральный. Технические условия

--------------------------------

<1> В Российской Федерации действует ГОСТ Р 54644-2011 "Мед натуральный. Технические условия".

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26809-86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу

ГОСТ 31339-2006 Рыба, нерыбные объекты и продукция из них. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ 31467-2012 Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты из мяса птицы. Методы отбора проб и подготовка их к испытаниям

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов по указателю "Национальные стандарты", составленному по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3.1 В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1.1 тест-система: Набор (комплект) специально подобранных реагентов (реактивов) и составных частей, предназначенный для определения одного или нескольких конкретных веществ.

3.1.2 вспомогательный раствор: Раствор, приготовляемый заблаговременно и необходимый для приготовления других типов растворов.

3.1.3 рабочий раствор: Раствор одного или нескольких реактивов, приготовляемый непосредственно перед использованием и необходимый для выполнения процедуры анализа.

3.2 В настоящем стандарте применены следующие сокращения:

AOZ - 3-амино-2-оксазолидинон (метаболит фуразолидона);

АГ - антиген;

АТ - антитела;

ИФА - иммуноферментный анализ;

ОП - оптическая плотность;

П - относительное поглощение;

ТМБ - 3,3',5,5'-тетраметилбензидин;

ФК - ферментный конъюгат.

4.1 Иммуноферментный метод основан на измерении массовой концентрации AOZ в растворах экстрактов исследуемых проб с помощью прямого твердофазного конкурентного ИФА.

4.2 Прямой твердофазный конкурентный ИФА основан на способности маркерного метаболита AOZ и ФК в условиях конкуренции взаимодействовать со специфичными АТ, нанесенными на поверхность лунок планшета.

4.3 Связавшийся с АТ AOZ, меченный пероксидазой хрена, выявляют путем измерения интенсивности окрашивания продукта реакции окисления 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (раствор N 5, см. приложение А) перекисью водорода.

Аналитический сигнал (регистрируемое значение ОП), характеризующий степень взаимодействия АТ с АГ, обратно пропорционален массовой концентрации AOZ в растворе.

5.1 Установленный в настоящем стандарте метод обеспечивает выполнение измерений массовой концентрации (содержания) AOZ с расширенной неопределенностью результатов аналитических измерений при коэффициенте охвата k = 2, указанной в таблице 1.

6.1 При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007.

6.2 Помещения, в которых проводится анализ и подготовка проб, должны быть оборудованы приточно-вытяжной вентиляцией, и соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и электробезопасности по ГОСТ 12.1.019.

6.3 К выполнению измерений допускаются лица, владеющие техникой ИФА и изучившие инструкции по применению тест-систем и инструкции по эксплуатации используемых приборов.

6.4 При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

7.1 При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, аппаратуру, материалы и посуду:

- весы неавтоматического действия высокого класса точности по ГОСТ OIML R 76-1 с пределом допускаемой абсолютной погрешности +/- 0,05 г;

- pH-метр любой марки, позволяющий проводить измерения в диапазоне от 3 до 10 ед. pH с погрешностью +/- 0,05 ед. pH;

- фотометр вертикального типа фотометрирования с диапазоном измерений ОП от 0 до 3 в комплекте с интерференционными светофильтрами для длин волн 450 и 620 нм;

- баню водяную с терморегулятором, позволяющим поддерживать температуру от 40 °C до 100 °C, с отклонением от заданной температуры +/- 5 °C;

- измельчитель-гомогенизатор лабораторный;

- калькулятор любого типа с логарифмической функцией;

- микроцентрифугу любого типа с частотой вращения 7000 об/мин;

- морозильную камеру любого типа, обеспечивающую среднюю температуру в холодильной камере не выше минус 20 °C.

- роторный испаритель любого типа или устройство для испарения экстрактов, с термостатируемым нагревательным модулем с системой отдувки растворителей инертным газом;

- термостат любого типа, поддерживающий температуру (37 +/- 1) °C;

- холодильник бытовой с цифровым контроллером температуры и рабочим диапазоном температур от 0 °C до 8 °C;

- центрифугу с бакет-ротором и адаптером для пробирок вместимостью 15 см³, частотой вращения не менее 4000 об/мин;

- шейкер переворачивающий вертикального вращения 360° в одной плоскости с адаптером для пробирок и диапазоном скорости от 20 до 100 об/мин;

- шейкер вортексного типа, с вставкой для одной пробирки и диапазоном скорости от 150 до 2500 об/мин;

- шкаф сушильный любого типа, обеспечивающий поддержание температуры не менее (95 +/- 5) °C;

- бумагу индикаторную универсальную, pH 0 - 12;

- бумагу масштабно-координатную по ГОСТ 334, марки Н-1;

- бумагу фильтровальную лабораторную по ГОСТ 12026;

- колбы 1-100 (1000)-2 по ГОСТ 1770;

- колбы конические Кн-1-25(50)-24/29 ТС по ГОСТ 25336;

- пипетки многоканальные переменной вместимости 0,03 - 0,3 см³, с допустимой относительной погрешностью дозирования по метанолу и ацетонитрилу не более +/- 1,0%;

- пипетки одноканальные переменной вместимости 0,005 - 0,05; 0,1 - 1,0; 0,5 - 5,0 см³ с допустимой относительной погрешностью дозирования по карбинолу и ацетонитрилу не более +/- 1%;

- пробирки стеклянные типа П-1-10-0,1 ХС по ГОСТ 25336;

- пробирки стеклянные типа "Фалькон" вместимостью 50 см³ с завинчивающимися крышками;

- пробирки типа "Эппендорф" вместимостью 1,5 см³;

- цилиндры 1(2,3)-10(250, 500)-1 по ГОСТ 1770.

7.2 При выполнении измерений применяют следующие реактивы:

- воду дистиллированную по ГОСТ 6709;

- калия бихромат по ГОСТ 2652;

- кислоту серную по ГОСТ 4204, концентрированную;

- кислоту соляную по ГОСТ 3118, концентрированную, плотностью 1,19 г/см³, х.ч.;

- метанол с содержанием основного вещества не менее 99%, х.ч.;

- натрия гидроокись по ГОСТ 4328, х.ч.,

- натрия фосфат додекагидрат с содержанием основного вещества не менее 98%;

- н-гексан с содержанием основного вещества не менее 98%, х.ч.;

- тест-систему для прямого твердофазного конкурентного ИФА в комплектации (приложение А), которая предназначена для определения AOZ;

- этилацетат с содержанием основного вещества не менее 98%, х.ч.

8.1.1 При подготовке к проведению измерений лабораторную стеклянную посуду моют смесью водного раствора бихромата калия с концентрированной серной кислотой, многократно промывают водопроводной водой, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают в сушильном шкафу.

8.1.2 Подготовку и проверку фотометра и pH-метра проводят в соответствии с руководством по эксплуатации приборов.

8.2.1 Приготовление раствора фосфата натрия с молярной концентрацией 0,3 моль/дм³

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ вносят 11,4 г натрия фосфата додекагидрата, растворяют в 500 см³ дистиллированной воды и доводят объем раствора до метки водой.

Срок хранения раствора при температуре от 2 °C до 8 °C - не более 1 мес.

8.2.2 Приготовление раствора соляной кислоты с молярной концентрацией 1 моль/дм³

В мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 8,5 см³ концентрированной соляной кислоты, доводят объем раствора дистиллированной водой до метки, закрывают пробкой и тщательно перемешивают.

Срок хранения раствора в вытяжном шкафу при комнатной температуре - не более 1 мес.

8.2.3 Приготовление раствора гидроокиси натрия молярной концентрацией 0,1 моль/дм³

В мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 0,4 г гидроокиси натрия, растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, перемешивают и доводят до метки дистиллированной водой.

Срок хранения раствора при комнатной температуре - не более 1 мес.

8.2.4 Приготовление рабочих градуировочных растворов AOZ К₁ - К₅

8.2.4.1 Приготовление исходного раствора К₀

В пробирку типа "Эппендорф" вносят 0,9 см³ дистиллированной воды, добавляют 0,1 см³ реактива N 1 (см. приложение А), перемешивают на шейкере в течение 30 с.

8.2.4.2 Приготовление рабочих градуировочных растворов AOZ К₁ - К₅

Рабочие градуировочные растворы К₁ - К₅ готовят в стеклянных пробирках типа "Фалькон" согласно таблице 2.

Пробирки закрывают крышками и перемешивают на шейкере в течение 20 с.

Используют свежеприготовленные растворы.

8.2.5 Приготовление рабочего раствора буфера для промывки

В колбу вместимостью 50 см³ вносят 28 см³ дистиллированной воды, добавляют 1,47 см³ реактива N 3 (см. приложение А), перемешивают.

Срок хранения раствора при температуре от 2 °C до 8 °C - не более 1 мес.

8.2.6 Приготовление рабочего раствора реакционного буфера

В стеклянную пробирку вносят 10 см³ реактива N 4 (см. приложение А) и 0,0065 см³ реактива N 7 (см. приложение А), перемешивают на шейкере в течение 30 с.

Срок хранения раствора при температуре от 2 °C до 8 °C - не более 1 сут.

8.2.7 Приготовление 20% раствора метанола в рабочем растворе реакционного буфера

В колбу вместимостью 25 см³ вносят 8 см³ рабочего раствора реакционного буфера (см. 8.2.6), добавляют 2 см³ метанола, перемешивают.

Срок хранения раствора при температуре от 2 °C до 8 °C - не более 1 сут.

8.2.8 Приготовление рабочего раствора ферментного конъюгата

В стеклянную пробирку вносят 2,25 см³ реактива N 4 (см. приложение А) и 0,25 см³ реактива N 2 (см. приложение А), перемешивают на шейкере в течение 10 с.

Используют свежеприготовленный раствор.

8.3.1 Отбор проб мяса - по ГОСТ 7269.

8.3.2 Отбор проб мяса птицы - по ГОСТ 31467.

8.3.3 Отбор проб молока - по ГОСТ 26809.

8.3.4 Отбор проб яиц, яичного меланжа и яичного порошка - по нормативным документам, действующим на территории государства, принявшего стандарт.

8.3.5 Отбор проб рыбы - по ГОСТ 31339.

8.3.6 Отбор проб меда - по ГОСТ 19792.

8.3.7 Срок хранения отобранных проб при температуре от 2 °C до 8 °C - 2 сут. При отсутствии возможности исследования проб в течение двух суток они должны быть заморожены при температуре минус 20 °C со сроком хранения не более 2 мес.

8.4.1 Мышечную ткань предварительно очищают от жира, грубой соединительной ткани и измельчают на гомогенизаторе.

8.4.2 Яйца отделяют от скорлупы и перемешивают на гомогенизаторе. Меланж, яичный порошок тщательно перемешивают.

8.4.3 При подготовке питьевого молока проводят его обезжиривание с помощью центрифугирования в течение 15 мин при 4000 об/мин. Верхний слой удаляют.

При подготовке сухого молока 1 г пробы перемешивают с 10 см³ дистиллированной воды до полного растворения. Далее проводят обезжиривание, как описано выше.

8.4.4 1,00 г гомогенизированной пробы или 1 см³ обезжиренного молока помещают в стеклянные пробирки типа "Фалькон". Затем обрабатывают испытуемые пробы и градуировочные растворы, приготовленные по 8.2.4.2, как указано на рисунке 1.

9.1.1 При проведении испытаний следует использовать реагенты и компоненты, входящие в один и тот же набор (тест-систему). Разбавление или замена реагентов из набора (тест-системы) другой серии не допускается.

9.1.2 Наборы (тест-системы) следует хранить при температуре от 2 °C до 8 °C в пределах срока хранения.

9.1.3 Окрашивание раствора субстрата N 5 (см. приложение А) является признаком его порчи и делает невозможным его применение для анализа.

9.2.1 Перед использованием тест-систему вынимают из холодильника и выдерживают при комнатной температуре не менее 30 мин, после чего аккуратно встряхивают каждый флакон. Реактив N 3 (см. приложение А) необходимо прогреть в термостате при температуре 37 °C до полного растворения кристаллов солей и тщательно перемешать.

9.2.2 После использования реагенты тест-системы сразу убирают в холодильник.

9.2.3 На всех стадиях необходимо избегать воздействия прямого солнечного света.

9.2.4 Для каждого реактива и раствора используют отдельные съемные наконечники пипеток переменной вместимости. Внесение растворов в лунки проводят осторожно, не касаясь наконечниками их дна и стенок.

9.2.5 Каждый исследуемый раствор экстрактов испытуемых проб (см. 8.4) и градуировочных растворов (см. 8.2.4.2) анализируют в двух повторностях.

Примечание - Далее приведены расходы реактивов на два стрипа <1>, что достаточно для анализа трех исследуемых проб. Для другого числа проб количество используемых стрипов и смешиваемых объемов реагентов изменяют в соответствии с количеством исследуемых проб.

--------------------------------

<1> Стрип - полоска из восьми лунок.

9.3.1 Из планшета извлекают необходимое число стрипов. Неиспользованные стрипы хранят в закрытом фольгированном полиэтиленовом пакете с зип-локом <2> при температуре от 2 °C до 8 °C в течение всего срока годности тест-системы.

--------------------------------

<2> Зип-лок - замок, обеспечивающий герметизацию пакета.

9.3.2 В лунки планшета вносят по 0,05 см³ экстрактов рабочих градуировочных растворов К₁ - К₅ (см. 8.2.4.2) и растворов испытуемых проб.

Каждый раствор вносят в двойной повторности (лунки-дубли).

Внесение растворов проводят согласно приложению Б.

Далее в каждую лунку вносят по 0,05 см³ рабочего раствора ферментного конъюгата (см. 8.2.8). Стрипы заклеивают пленкой или закрывают крышкой, инкубируют в термостате при температуре от 2 °C до 8 °C в течение 1 ч, после чего содержимое лунок сливают.

9.3.3 В лунки планшета вносят по 0,2 см³ раствора буфера для промывки (см. 8.2.5), оставляют на 1 - 2 мин и сливают. Процедуру промывки повторяют еще три раза. Остатки жидкости интенсивно стряхивают на чистую фильтровальную бумагу.

9.3.4 В лунки планшета вносят по 0,1 см³ раствора N 5 (см. приложение А) и инкубируют в термостате при температуре 37 °C в течение 10 мин. Добавляют по 0,1 см³ раствора N 6 (см. приложение А), аккуратно перемешивают легким постукиванием по ребру планшета. Помещают планшет в вертикальный фотометр и измеряют значения ОП при длине волны 450 нм.

10.1 По показателям ОП в лунках-дублях находят среднеарифметические значения. Разность значений ОП для них в процентах от среднего не должна превышать 10.

Связывание АТ (или относительное поглощение П, %, рассчитывают по формуле

где ОП_п - среднее значение ОП, измеренной в лунках с экстрактами градуировочных растворов К₂ - К₅ (см. 8.2.4) и с растворами экстрактов испытуемых проб;

ОП_к - среднее значение ОП, измеренной в лунках с нулевым стандартом (экстрактом градуировочного раствора К₁ (см. 8.2.4);

По значениям процентов связывания, вычисленным для градуировочных растворов с соответствующими известными значениями массовой концентрации AOZ, мкг/дм³, строят градуировочный график в полулогарифмической системе координат.

10.2 Для построения градуировочного графика используют масштабно-координатную бумагу. На ось абсцисс наносят значения логарифмов концентраций AOZ в градуировочных растворах К₂ - К₅ (см. 8.2.4.2). По оси ординат откладывают значения процентов связывания, рассчитанные для массовых концентраций по формуле (1). Градуировочный график строят с использованием линейной зависимости.

10.3 С помощью градуировочного графика по значению процента связывания, полученного для растворов экстрактов испытуемых проб, находят логарифмы массовой концентрации в них AOZ. С помощью калькулятора вычисляют его обратное значение (антилогарифм), соответствующее массовой концентрации AOZ в растворе экстракта.

10.4 Массовую концентрацию (содержание) AOZ в испытуемой пробе C, мкг/дм³ (мкг/кг), рассчитывают по формуле

где c - массовая концентрация AOZ в рабочем растворе экстракта испытуемой пробы, определяемая по градуировочному графику, мкг/дм³;

K - коэффициент пересчета мкг/дм³ в мкг/кг в экстракте испытуемой пробы, учитывающий ее разведение; для сухого молока равен 10, для остальных проб - единице.

Образец записи результатов измерений приведен в приложении В.

За окончательный результат принимают среднеарифметическое двух измерений, выполненных в условиях повторяемости, если выполняется условие приемлемости

где C₁ и C₂ - результаты определений массовой концентрации (содержания) AOZ, полученные в условиях повторяемости, мкг/дм³ (мкг/кг);

C_ср - среднеарифметическое результатов двух определений массовой концентрации AOZ в испытуемой пробе, мкг/дм³ (мкг/кг);

r_отн - предел повторяемости (%), приведенный в таблице 1.

Результаты измерений массовой концентрации (содержания) AOZ, мкг/дм³ (мкг/кг), округляют до первого знака после запятой.

10.5 Допускается использование программного обеспечения, позволяющего определять массовую концентрацию (содержание) AOZ в испытуемой пробе по средним значениям ОП, измеренным в лунках с экстрактами градуировочных растворов и испытуемых проб.

С помощью компьютерной системы обработки данных строят градуировочную зависимость оптической плотности раствора от массовой концентрации AOZ и аппроксимируют линейной функцией.

Градуировочная зависимость считается приемлемой, если рассчитанное программным обеспечением значение коэффициента корреляции r² >= 0,98.

За результат измерений принимают среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений, если выполняется условие приемлемости

где C₁, C₂ - результаты параллельных определений массовой концентрации AOZ, мкг/дм³;

r - значение предела повторяемости для разных диапазонов измерения (см. таблицу 1).

Результат определения массовой концентрации (содержания) AOZ в анализируемой пробе представляют в виде

где C - массовая концентрация (содержание) AOZ в испытуемой пробе, мкг/дм³ (мкг/кг);

U - значение относительной расширенной неопределенности при коэффициенте охвата k = 2, % (см. таблицу 1).

Проверку приемлемости результатов измерений, полученных в условиях повторяемости (сходимости) и воспроизводимости, проводят с учетом требований ГОСТ ИСО 5725-6 (раздел 5).

--------------------------------

<1> Данный комплект реагентов является рекомендуемым и приведен для удобства пользователей настоящего стандарта.

В комплектацию тест-системы входят:

Планшет 96-луночный полистироловый стрипованный для иммунологических исследований, с иммобилизованными антителами;

Пакет полиэтиленовый фольгированный с зип-локом;

Пленка полиэтиленовая самоклеящаяся для заклеивания планшетов.

Растворы:

N 1 - AOZ - раствор с известным содержанием AOZ (6,25 мкг/см³);

N 2 - ФК - конъюгат AOZ с пероксидазой хрена;

N 3 - раствор фосфатного буфера для промывки (20-кратный концентрат), pH (7,0 - 7,4);

N 4 - реакционный буферный раствор с добавлением бычьего сывороточного альбумина, pH (7,0 - 7,4), стерильный;

N 5 - раствор субстрата на основе 3,3',5,5'-ТМБ с добавлением перекиси водорода;

N 6 - стоп-реагент - раствор серной кислоты молярной концентрации 0,5 моль/дм^-3;

N 7 - раствор натрия ацетата молярной концентрации 3,0 моль/дм³;

N 8 - раствор 2-нитробензальдегида в ДМСО с молярной концентрацией 0,01 моль/дм³.

Внесение реагентов следует проводить согласно следующей схеме: