"ГОСТ 32249-2013. Межгосударственный стандарт. Продукция соковая. Определение этилового спирта ферментативным методом"
(введен в действие Приказом Росстандарта от 22.11.2013 N 1746-ст)

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"

1 РАЗРАБОТАН Некоммерческой организацией "Российский союз производителей соков" (РСПС) при участии открытого акционерного общества "Вимм-Биль-Данн" (ОАО "Вимм-Биль-Данн")

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстандарт)

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 28 августа 2013 г. N 58-П)

За принятие проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22 ноября 2013 г. N 1746-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 32249-2013 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2015 г.

5 В настоящем стандарте учтены основные положения метода IFU-Analyses Nr. 52 (2005) Determination of Alcohol. Enzymatic (ИФУ 52:2005 Метод ферментативного определения этанола, разработанного Международной федерацией производителей фруктовых соков IFU "International Federation of Fruit Juice Produces"

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Настоящий стандарт распространяется на фруктовые и овощные соки, нектары, сокосодержащие напитки, фруктовые и овощные концентрированные соки, пюре и концентрированные пюре, морсы и концентрированные морсы, в т.ч. обогащенные и для детского питания (далее - соковая продукция) и устанавливает метод ферментативного определения массовой концентрации или массовой доли этилового спирта.

Диапазон измерения массовой концентрации (массовой доли) этилового спирта от 50 до 50000 мг/дм³ (млн^-1) включительно.

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

ГОСТ 12.0.004-90 Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ OIML R 76-1-2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ ИСО 5725-6-2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 18300-87 Спирт этиловый ректификованный технический. Технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26313-84 Продукты переработки плодов и овощей. Правила приемки, методы отбора проб

ГОСТ 26671-84 Продукты переработки плодов и овощей, консервы мясные и мясорастительные. Подготовка проб для лабораторных анализов

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или ежегодному информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты" за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3.1 В настоящем стандарте применен следующий термин с соответствующим определением:

3.1.1 Е - стандартная единица, определяющая количество (активность) ферментов, которые служат катализаторами при температуре 25 °C для превращения 1 мкмоля вещества в минуту.

НАД (NAD) - никотинамидадениндинуклеотид, окисленная форма.

НАДН (NADH) - никотинамидадениндинуклеотид, восстановленная форма.

АДГ (ADH) - алкогольдегидрогеназа.

АЛДГ (Al-DH) - альдегиддегидрогеназа.

Метод определения этилового спирта в соковой продукции основан на проведении нижеприведенных ферментативных реакций:

Этиловый спирт окисляется алкогольдегидрогеназой (ADH) до ацетальдегида:

Образующийся ацетальдегид в присутствии альдегиддегидрогеназы (Al-DH) количественно окисляется никотинамидадениндинуклеотидом (NAD⁺) до уксусной кислоты:

Массовая концентрация (массовая доля) этилового спирта эквивалентна количеству образовавшегося НАДН, что определяется по изменению оптической плотности, измеренной при длинах волн: 334, 340 или 365 нм.

5.1 Спектрофотометр, позволяющий проводить измерения оптической плотности при длинах волн 334, 340 и 365 нм с допустимой абсолютной погрешностью измерения коэффициента пропускания +/- 1%, и пределами допускаемой воспроизводимости измерений по шкале длин волн +/- 0,3 нм.

5.2 Иономер или pH-метр с погрешностью измерения не более +/- 0,05 ед. pH.

5.3 Весы неавтоматического действия по ГОСТ OIML R 76-1 с пределами допускаемой абсолютной погрешности +/- 0,001 г.

5.4 Термометр ТЛ-2 с диапазоном измерения от 0 °C до +150 °C с погрешностью +/- 1 °C.

5.5 Секундомер или секундомер-часы с ценой деления 0,2 с.

5.6 Кюветы кварцевые или полимерные для спектрофотометрии с длиной оптического пути от 5 до 20 мм и вместимостью от 2 до 10 см³.

5.7 Фильтры мембранные с размером диаметра пор 0,20 или 0,45 мкм и диаметром 47 мм для фильтрования проб.

5.8 Центрифуга лабораторная с величиной фактора разделения (g-фактор) не менее 1000.

5.9 Мешалка магнитная угловой скоростью вращения от 400 до 1200 мин^-1.

5.10 Ванна ультразвуковая.

5.11 Посуда мерная лабораторная стеклянная:

- цилиндры мерные 2-50-2 и 2-1000-2 по ГОСТ 1770;

- колбы мерные 2-50-2, 2-100-2 и 2-1000-2 по ГОСТ 1770;

- пипетки градуированные 1-2-1-1, 1-2-1-5, 1-2-1-25 по ГОСТ 29227;

- пробирки мерные П-2-20-14/23 по ГОСТ 1770.

5.12 Микродозаторы пипеточные одноканальные переменного объема от 100 до 1000 мм³ с относительной погрешностью дозирования +/- 1% с соответствующими наконечниками по ГОСТ 28311.

5.13 Посуда лабораторная стеклянная по ГОСТ 25336:

- воронки лабораторные;

- стаканы высокие или низкие вместимостью 100, 400 и 1000 см³;

- пробирки типа П-2-15-160.

5.14 Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.

5.15 Вода дистиллированная по ГОСТ 6709 свежеприготовленная.

5.16 Шпатели пластиковые или палочки стеклянные оплавленные длиной от 2 до 5 см для перемешивания содержимого кюветы при проведении фотометрических измерений.

5.17 Калия пирофосфат K₄P₂O₇, ч.

5.18 Кислота соляная, х.ч. по ГОСТ 3118, раствор молярной концентрации 1 моль/дм³.

5.19 Натриевая соль никотинамидадениндинуклеотида, НАДН-Na₂, с массовой долей основного вещества не менее 98%.

5.20 Альдегиддегидрогеназа (АЛДГ), лиофилизированная, активностью не менее 75 Е.

5.21 Алкогольдегидрогеназа (АДГ), суспензия, активностью не менее 300 Е.

5.22 Спирт этиловый по ГОСТ 18300 с объемной долей не менее 96,2%.

5.23 Комплект реагентов для ферментативного определения этилового спирта <1>, включающий:

--------------------------------

<1> Комплекты реагентов для определения этилового спирта фирм R-Biopharm GmHb, Roche Diagnostics и Megazyme обеспечивают требуемую эффективность метода. Данная информация не является рекламой указанных реагентов и не исключает возможность применения комплектов реагентов других фирм.

- реагент 1 - 100 см³ пирофосфатного буфера с pH 9,0;

- реагент 2 - 30 таблеток сухого препарата, каждая таблетка должна содержать по 4,0 мг НАД и альдегиддегидрогеназу с активностью 0,8 Е;

- реагент 3 - 1,6 см³ суспензии АДГ (ADH) активностью 7000 Е;

- реагент 4 - контрольный раствор этилового спирта (массовой концентрации 50 - 60 мг/дм³. Точное значение указано на упаковке).

5.24 Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, х.ч.

5.25 Поливинилпирролидон (Е1202) с массовой долей основного вещества не менее 95%.

5.26 Фильтр обеззоленный "белая лента".

Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования и реактивов, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающим необходимую точность измерения, а также реактивов и материалов по качеству не хуже вышеуказанных.

6.1 Отбор проб - по ГОСТ 26313, подготовка проб - по ГОСТ 26671.

Реагент 1 (см. 5.23) применяют как реактив, без разбавления. Перед проведением определения реагент 1 доводят до температуры от 20 °C до 25 °C любым доступным способом.

Срок хранения реактива 1 при температуре 4 °C - не более одного года.

Для приготовления реактива 2 растворяют одну таблетку реагента 2 (см. 5.23) в 3 см³ реактива 1 в колбе с притертой пробкой или в стеклянной пробирке (см. 5.11) на каждое измерение, в зависимости от количества измерений.

Срок хранения реактива 2 при температуре 4 °C - не более семи дней.

Реагент 3 (см. 5.23) применяют без разбавления.

Срок хранения реактива 3 при температуре 4 °C - не более одного года.

Реагент 4 (см. 5.23) используют без разбавления. Точное значение концентрации этилового спирта указано на упаковке.

Срок годности указан на упаковке. Раствор используют в качестве контрольной пробы, показывающей работоспособность метода, реактивов и оборудования.

Растворяют 5,0 г пирофосфата калия в 40 см³ воды в химическом стакане (мензурке). Полученный раствор доводят до (9,0 +/- 0,1) ед. pH с помощью раствора соляной кислоты (см. 5.18). Раствор переносят в мерную колбу вместимостью 50 см³ и доводят его объем до метки дистиллированной водой.

Срок хранения раствора в колбе с притертой пробкой при температуре 4 °C - не более 2 мес.

В химическом стакане растворяют 103 мг препарата НАДН-Na₂ (см. 5.19) в 3 см³ дистиллированной воды.

Срок хранения раствора в колбе с притертой пробкой при температуре 4 °C - не более 28 дней.

Растворяют необходимое количество лиофилизата АЛДГ (см. 5.20) в 0,5 см³ дистиллированной воды для получения раствора с активностью фермента 75 Е в 1 см³.

Срок хранения суспензии в колбе с притертой пробкой при температуре 4 °C - не более 8 ч, при температуре 20 °C - не более двух дней.

Используют 0,5 см³ суспензии АДГ (см. 5.21) без разбавления или растворяют 25 мг суспензии АДГ в 0,5 см³ дистиллированной воды.

Срок хранения суспензии в колбе с притертой пробкой при температуре 4 °C - не более 6 мес, водного раствора при температуре 4 °C не более одной недели.

Мерную колбу вместимостью 500 см³ помещают на аналитические весы (см. 5.4) и взвешивают в ней 500 мг этилового спирта (см. 5.22). Точную массу этилового спирта рассчитывают по разности результатов взвешивания полной и пустой колбы.

Приливают небольшое количество дистиллированной воды, перемешивают. Раствор доводят дистиллированной водой до метки.

В мерную колбу на 100° см³ отбирают 10 см³ полученного раствора и доводят до метки дистиллированной водой.

Раствор используют в качестве контрольной пробы, показывающего работоспособность метода, реактивов, оборудования.

Срок хранения раствора при температуре 6 °C в герметичной упаковке - не более 3 сут.

7.3.1 Определение массовой концентрации этилового спирта в осветленных соках и сокосодержащих напитках, не содержащих нерастворимые в воде вещества, проводят без разбавления пробы дистиллированной водой.

7.3.2 Определение массовой концентрации этилового спирта в осветленных соках и сокосодержащих напитках, содержащих нерастворимые в дистиллированной воде вещества, проводят после фильтрования пробы через обеззоленный фильтр "белая лента" или ее центрифугированием с фактором разделения не менее 990g в течение 15 мин.

7.3.3 Пробы соков и сокосодержащих напитков, содержащие углекислый газ, дегазируют фильтрацией или, для уменьшения возможной потери этанола, добавлением гидроокиси натрия.

7.3.4 Пробы соков и сокосодержащих напитков с высокой кислотностью доводят до 8 - 9 ед. pH добавлением раствора гидроокиси натрия и выдерживают 15 мин.

7.3.5 Определение массовой концентрации этилового спирта в соках и сокосодержащих напитках с объемной долей мякоти до 10% включительно или содержащих нерастворимые в воде вещества, проводят после тщательного перемешивания пробы стеклянной палочкой, а затем ее центрифугирования с фактором разделения не менее 990g в течение 15 мин.

7.3.6 Соки и сокосодержащие напитки с объемной доли мякоти свыше 10% и более предварительно разбавляют дистиллированной водой в соотношении 1 : 5 для осветления раствора. Для этого в мерную колбу вместимостью 50 см³ мерным цилиндром отбирают 10 см³ пробы и доводят дистиллированной водой до метки. После этого пробу гомогенизируют, тщательно перемешивая содержимое стеклянной палочкой, и центрифугируют с фактором разделения не менее 990g в течение 15 мин. В случае неполного осаждения нерастворимых в дистиллированной воде частиц пробу вновь фильтруют через обеззоленный фильтр "белая лента" или центрифугируют с фактором разделения не менее 990g в течение 15 мин.

7.3.7 Определение массовой доли этилового спирта в концентрированных соках и пюре проводят после предварительного разбавления пробы дистиллированной водой весовым методом в соотношении 1 : 5.

Для этого на весах (см. 5.3) в стакане вместимостью 50 см³ взвешивают 5 - 7 г концентрированного сока с записью результата до третьего десятичного знака, прибавляют дистиллированную воду до получения общей массы пробы 25 - 35 г с записью результата до третьего десятичного знака. Делением общей массы пробы на массу концентрированного сока до разбавления водой, вычисляют величину разбавления (разведения), которую учитывают при обработке результатов. В случае, если концентрированная соковая продукция представляет собой пюре, при разбавлении которого образуются нерастворимые в дистиллированной воде вещества, пробу дополнительно центрифугируют в соответствии с аналогичными требованиями 7.3.2. Необходимо учитывать предварительное разведение пробы по 7.3.6 при расчете фактора разбавления F в соответствии с таблицей 1.

7.3.8 Для обесцвечивания окрашенной соковой продукции к 5 см³ пробы добавляют примерно 0,1 г поливинилполипирролидона, перемешивают в течение 2 мин и затем фильтруют.

Для обеспечения достоверности результатов определения этилового спирта в кювете спектрофотометра с анализируемой пробой должно находиться от 1,0 до 6,0 мкг (измерение при 365, 340 и 334 нм) соответственно.

Для достижения этого условия пробу разбавляют дистиллированной водой с помощью мерных колб и пипеток подходящих вместимостей в соответствии с таблицей 1.

Измерения проводят в следующих лабораторных условиях:

В кювету спектрофотометра (см. 5.6) с длиной оптического пути 1 см приливают реактив 1 и реактив 2, дистиллированную воду и анализируемую пробу в порядке и количествах, указанных в таблице 2.

Для определения используют только свежеприготовленную дистиллированную воду.

Измеряемой величиной является разность в оптической плотности растворов до и после обработки ферментом при длинах волн 334, 340 или 365 нм, которая пропорциональна массовой концентрации (массовой доле) этилового спирта в анализируемой пробе.

Разность значений оптических плотностей вычисляют по формуле

где (A₂ - A₁)_проба - разность оптических плотностей раствора анализируемой пробы;

(A₂ - A₁)_{контроль} - разность оптических плотностей раствора сравнения.

Разность оптических плотностей должна находиться в интервале от 0,1 до 0,5 единиц оптической плотности (измерения при длине волны 365 нм) или от 0,1 до 0,8 единиц оптической плотности (измерения при длинах волн 334 и 340 нм). При превышении указанных значений разности оптических плотностей раствор анализируемой пробы дополнительно разбавляют дистиллированной водой. При меньшей разности оптических плотностей (менее 0,1) объем анализируемой пробы, дозируемый в кювету, увеличивают, а количество дистиллированной воды, соответственно, уменьшают так, чтобы объем анализируемой пробы в кювете оставался постоянным в соответствии с таблицей 2.

Массовую концентрацию C_спирт этилового спирта в пробе, мг/дм³, вычисляют по формуле

где V - окончательный объем растворов в кювете по таблице 2, см³;

M - молярная масса этанола, M = 46,07 г/моль;

F - фактор разбавления в соответствии с таблицей 1;

- разность оптических плотностей;

- молярный коэффициент поглощения НАДН, дм³·ммоль^-1·см^-1:

- при длине волны 340 нм ,

- при длине волны 365 нм (ртутная лампа),

- при длине волны 334 нм (ртутная лампа);

d - толщина поглощающего слоя в кювете, см;

v - объем анализируемой пробы (см. таблицу 2), см³.

При проведении анализа по 8.2, толщине поглощающего слоя в кювете 1 см и объеме анализируемой пробы 0,100 см³ формула для расчета массовой концентрации этилового спирта , мг/дм³, преобразуется следующим образом

Если проба предварительно была разбавлена по 7.4, результат необходимо умножить на фактор разбавления F (см. таблицу 1):

Массовую долю этилового спирта в пробе, подготовленной по 7.3.7, X_спирт, млн^-1, вычисляют по формуле

где V_к - объем мерной колбы, использовавшейся при подготовке пробы, см³;

C_спирт - массовая концентрация этилового спирта в растворе, полученного в результате подготовки пробы и определяемая по формуле (2), мг/дм³;

m_к - масса концентрированного продукта, взятого для проведения анализа и подготовленного по 7.3.7, г;

Дополнительно для контроля качества реактивов и работы спектрофотометра вместе с каждой серией анализируемых проб проводят определение содержания этилового спирта в контрольном растворе по 7.2.5.

Вычисляют массовую концентрацию этилового спирта в контрольном растворе по формуле (2).

Относительное отклонение измеренной величины содержания этилового спирта в стандартном растворе не должно превышать 5% от номинального значения массовой концентрации этилового спирта в стандартном растворе, в противном случае результаты измерения всей серии образцов признаются неудовлетворительными.

Расхождение между результатами двух параллельных определений, выполненных в условиях повторяемости, не должно превышать предела повторяемости (сходимости) r, приведенного в таблице 3, при доверительной вероятности P = 0,95.

Границы относительной погрешности определения массовой доли (концентрации) этилового спирта , %, при соблюдении условий, регламентированных настоящим стандартом, при доверительной вероятности P = 0,95, не должны превышать значений, приведенных в таблице 3.

Пределы обнаружения метода приведены в таблице 4.

За результат измерений принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, если выполняется условие приемлемости

где C(X) - результаты параллельных определений содержания этилового спирта, мг/дм³ (млн^-1);

r - значение предела повторяемости, % (таблица 3).

Если условие (6) не выполняется, выясняют причины превышения критического диапазона, устраняют их и повторяют выполнение измерений.

Результат анализа при P = 0,95 представляют в виде

где - среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, признанных приемлемыми по условию (6), мг/дм³ (млн^-1);

- границы относительной погрешности измерений, % (таблица 3).

В случае, если содержание этилового спирта ниже нижней (выше верхней) границы диапазона измерений, проводят следующую запись в журнале: "содержание этилового спирта менее 50 мг/дм³ (млн^-1) (более 50000 мг/дм³ (млн^-1)".

10.1 Проверку приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости проводят:

- при возникновении спорных ситуаций между двумя лабораториями;

- при проверке совместимости результатов измерений, полученных при сличительных испытаниях.

Для проведения проверки приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости каждая лаборатория использует пробы, оставленные на хранение.

Приемлемость результатов измерений, полученных в двух лабораториях, оценивают сравнением разности этих результатов с критической разностью CD_0,95 по формуле

где - средние значения содержания этилового спирта в соковой продукции, полученные в первой и второй лабораториях, мг/дм³; (млн^-1);

CD_0,95 - значение критической разности для содержания этилового спирта в соковой продукции, мг/дм³; (млн^-1), вычисляемое по формуле

где 2,77 - коэффициент критического диапазона для двух параллельных определений по ГОСТ ИСО 5725-6;

0,01 - множитель для перехода от процентов к абсолютным значениям;

- среднеарифметическое значение результатов содержания этилового спирта, мг/дм³; (млн^-1), полученных в первой и второй лабораториях;

- показатель воспроизводимости (таблица 3), %;

- показатель повторяемости (таблица 3), %.

n₁ = n₂ = 2 - количество параллельных определений в условиях повторяемости в каждой лаборатории в соответствии с методикой.

Если критическая разность не превышена, то приемлемы оба результата измерений, проводимых двумя лабораториями, и в качестве окончательного результата используют их среднеарифметическое значение. Если критическая разность превышена, то выполняют процедуры в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-6 (пункт 5.3.3).

При разногласиях руководствуются ГОСТ ИСО 5725-6 (пункт 5.3.4).

10.2 Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют ГОСТ ИСО 5725-6 (пункт 6.2.3), используя контроль стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения промежуточной прецизионности. Проверку стабильности осуществляют с применением контрольных карт Шухарта.

При неудовлетворительных результатах контроля, например, при превышении предела действия или регулярном превышении предела предупреждения, выясняют причины этих отклонений, в том числе проводят смену реактивов, проверяют работу оператора.

При выполнении измерений массовой концентрации (массовой доли) этилового спирта соблюдают следующие требования.

11.1.1 Требования электробезопасности при работе с приборами по ГОСТ 12.1.019 и в соответствии с инструкцией по эксплуатации прибора.

11.1.2 При работе с чистыми веществами соблюдают требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.007. Контроль за содержанием вредных веществ в воздухе рабочей зоны проводят в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005.

11.1.3 Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и должно быть оборудовано средствами пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.

11.1.4 Организация обучения работающих - по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений, обработке и оформлению результатов допускаются инженер-химик, техник или лаборант, имеющие высшее или среднее специальное образование, опыт работы в химической лаборатории и изучившие инструкцию по эксплуатации спектрофотометра. Первое применение метода в лаборатории следует проводить под руководством специалиста, владеющего теорией и имеющего практические навыки в этой области.