"ГОСТ 10444.8-2013. Межгосударственный стандарт. Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод подсчета презумптивных бактерий Bacillus cereus. Метод подсчета колоний при температуре 30 °C"
(введен в действие Приказом Росстандарта от 22.11.2013 N 2130-ст)

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены".

1. Подготовлен Государственным научным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом консервной и овощесушильной промышленности Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИКОП Россельхозакадемии) на основе собственного аутентичного перевода на русский язык международного стандарта, указанного в пункте 4.

2. Внесен Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (ТК 335).

3. Принят Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (Протокол N 44-2013 от 14 ноября 2013 г.).

За принятие проголосовали:

4. Настоящий стандарт модифицирован по отношению к международному стандарту ISO 7932:2004 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the enumeration of presumptive Bacillus cereus - Colony-count technique at 30 °C (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод подсчета презумптивных бактерий Bacillus cereus. Метод подсчета колоний при температуре 30 °C) путем внесения дополнительных положений, а также путем исключения пункта 10.3, приложений A и B международного стандарта, требования которых нецелесообразно применять, что обусловлено потребностями национальных экономик государств, указанных выше.

Содержание исключенных пункта 10.3, приложений A и B приведено в Приложении А.

Дополнительные положения приведены в разделе 2, пунктах 5.4 - 5.10, подпунктах 9.4.4, 9.4.5 и 9.4.6, разделе 12 и заключены в рамки из тонких линий.

Международный стандарт разработан подкомитетом ISO/TC 34/SC 9 "Микробиология" технического комитета по стандартизации ISO/TC 34 "Пищевые продукты" Международной организации по стандартизации (ISO).

Перевод с английского языка (en).

Официальный экземпляр международного стандарта, на основе которого подготовлен настоящий межгосударственный стандарт, и межгосударственных стандартов, на которые даны ссылки, имеются в Федеральном агентстве по техническому регулированию и метрологии Российской Федерации.

Степень соответствия - модифицированная (MOD).

Ссылки на международные стандарты, которые приняты в качестве межгосударственных стандартов, заменены в разделе "Нормативные ссылки" и тексте стандарта ссылками на соответствующие идентичные межгосударственные стандарты.

Информация о замене ссылок приведена в Приложении Б.

Сравнение структуры международного стандарта со структурой межгосударственного стандарта приведено в дополнительном Приложении ДВ.

5. Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22 ноября 2013 г. N 2130-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 10444.8-2013 (ISO 7932:2004) введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2015 г.

6. Взамен ГОСТ 10444.8-88.

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет.

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и корма для животных и устанавливает горизонтальный метод подсчета жизнеспособных презумптивных Bacillus cereus путем подсчета выросших на плотной питательной среде колоний при температуре 30 °C. Метод применим также для испытания проб окружающей среды, отобранных из зоны производства и переработки пищевых продуктов.

Термин "презумптивный" указывает на то, что данный метод не предусматривает дифференциацию B. cereus от других тесно связанных с ними, но менее часто встречаемых видов Bacillus, таких как B. anthracis, B. thuringiensis, B. weihenstephanensis, B. mycoides.

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ISO 6887-1:1999 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Приготовление проб для испытаний, исходных суспензий и десятичных разведений для микробиологических исследований. Часть 1. Общие правила приготовления исходной суспензии и десятичных разведений <*>

ГОСТ ISO 7218-2011 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям <*>

ГОСТ ISO 11133-2-2011 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие указания по приготовлению и производству культуральных сред. Часть 2. Практические руководящие указания по эксплуатационным испытаниям культуральных сред

Примечание. При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты" за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

--------------------------------

<*> Действует до введения ГОСТ, разработанного на основе ИСО 6887-1:1999. Перевод стандарта имеется в Федеральном агентстве по техническому регулированию и метрологии Российской Федерации.

<**> В международном стандарте дана ссылка на ИСО 7218:1996/Amd. 1:2001, который заменен на ISO 7218:2007.

В настоящем стандарте применен следующий термин с соответствующим определением:

3.1. Презумптивный Bacillus cereus (presumptive Bacillus cereus): микроорганизм, который образует типичные колонии на поверхности селективной питательной среды, и который дает характерную реакцию при подтверждении в условиях, устанавливаемых в настоящем стандарте.

4.1. Определенное количество пробы для испытания, если исходный продукт жидкий, или определенное количество исходной суспензии в случае использования продуктов других консистенций, высевают на поверхность плотной селективной питательной среды, находящейся в чашках Петри.

Для посева десятичных разведений используют дополнительные чашки Петри, приготовленные так же, как для посева пробы для испытания или исходной суспензии.

4.2. Чашки инкубируют в аэробных условиях при температуре 30 °C в течение 18 - 48 ч.

4.3. Количество B. cereus на грамм или кубический сантиметр пробы рассчитывают в зависимости от количества подтвержденных колоний, выросших на чашках Петри, и уровня разведений, выбранных для посева таких, чтобы получить достоверный результат.

5.1. Растворы для разведений

Используют растворы для разведений по ISO 6887-1 и ГОСТ 26669 или любому другому стандарту, касающемуся исследуемого продукта.

5.2. Плотная среда MYP-агар

5.2.1. Основа среды

5.2.1.1. Состав

--------------------------------

<а> В зависимости от желирующих свойств.

<б> Для приготовления питательных сред и реактивов используют дистиллированную воду по ГОСТ 6709.

5.2.1.2. Приготовление

Растворяют компоненты или готовую дегидратированную питательную среду в воде, при необходимости подогревают.

Если необходимо, устанавливают уровень pH приготовленной среды (5.2.4) так, чтобы после стерилизации он соответствовал (7,2 +/- 0,2) ед. pH при температуре 25 °C.

Разливают среду по 90 см3 в колбы соответствующей вместимости.

Стерилизуют в автоклаве (6.1) в течение 15 мин при температуре 121 °C.

5.2.2. Раствор полимиксина B

5.2.2.1. Состав

5.2.2.2. Приготовление

Растворяют сульфат полимиксина B в воде. Стерилизуют путем фильтрации.

5.2.3. Яично-желточная эмульсия

Используют свежие куриные яйца с неповрежденной скорлупой. Моют яйца жидким моющим средством, используя щетку. Промывают под проточной водой, погружают в 95%-ный (по объему) этиловый спирт на 30 с и высушивают. Соблюдая правила асептики, разбивают каждое яйцо и отделяют желток от белка, переливая его несколько раз из одной половинки скорлупы в другую. Помещают желтки в стерильный измерительный цилиндр и добавляют четыре части стерильной воды (по объему). Переносят, соблюдая правила асептики, в стерильные колбы и энергично перемешивают.

Нагревают смесь на водяной бане (6.4) в течение 2 ч при температуре от 44 °C до 47 °C. Затем оставляют смесь для образования осадка на 18 - 24 ч при температуре (5 +/- 3) °C. Собирают надосадочную эмульсию, соблюдая правила асептики.

Срок хранения эмульсии при температуре (5 +/- 3) °C - не более 72 ч.

5.2.4. Готовая среда (MYP агар)

5.2.4.1. Состав

5.2.4.2. Приготовление

Расплавляют основу среды и охлаждают на водяной бане (6.4) при температуре от 44 °C до 47 °C. Добавляют другие жидкости, хорошо перемешивая после каждого добавления. Охлаждают готовую среду на водяной бане (6.4) при температуре от 44 °C до 47 °C.

5.2.5. Приготовление чашек с агаром

Разливают по 15 - 20 см3 готовой среды (5.2.4) в стерильные чашки Петри (6.6) и оставляют для застывания на горизонтальной поверхности.

Перед подсушкой поверхности питательной среды чашки хранят при температуре 5 °C +/- 3 °C до четырех дней.

Непосредственно перед использованием среду подсушивают, предпочтительно со снятыми крышками, перевернув их агаровой поверхностью вниз. Подсушивают в сушильном шкафу или инкубаторе (6.2) при температуре от 37 °C до 55 °C до тех пор, пока поверхность агара не станет сухой.

5.2.6. Проверка рабочих характеристик

Проверку рабочих характеристик проводят по ГОСТ ISO 11133-2 (приложение B).

5.3. Агар с бараньей кровью

5.3.1. Кровяная агаровая основа среды

5.3.1.1. Состав

--------------------------------

<а> В зависимости от желирующих свойств.

5.3.1.2. Приготовление

Растворяют компоненты или дегидратированную питательную среду в воде при кипячении. Если необходимо, устанавливают уровень pH среды так, чтобы после стерилизации он соответствовал (7,2 +/- 0,2) ед. pH при температуре 25 °C.

Разливают среду в колбы и стерилизуют при температуре 121 °C в течение 15 мин.

5.3.2. Дефибринированная баранья кровь

5.3.2.1. Готовая среда

Состав

Приготовление

К основе среды (5.3.1) после охлаждения до температуры 44 °C - 47 °C добавляют дефибринированную баранью кровь. Перемешивают.

Разливают порциями по 12 см3 готовой среды в стерильные чашки Петри (6.6) и оставляют на горизонтальной поверхности до застывания.

Приемлемой альтернативой посуды многоразового применения является одноразовая посуда, если она отвечает соответствующим требованиям и одноразовая посуда предпочтительнее многоразовой.

Применяют микробиологическое лабораторное оборудование по ГОСТ ISO 7218 и ГОСТ 10444.1.

6.1. Оборудование для сухой стерилизации (сушильный шкаф) или стерилизации паром (автоклавы) по ГОСТ ISO 7218.

6.2. Сушильный шкаф или инкубатор с конвекционной вентиляцией для сушки агаровых пластин, поддерживающий температуру от (37 +/- 1) °C до (55 +/- 1) °C.

6.3. Инкубаторы (термостаты), поддерживающие температуру (30 +/- 1) °C.

6.4. Водяные бани, поддерживающие температуру от 44 °C до 47 °C.

6.5. pH-метр с точностью +/- 0,1 ед. pH при температуре 25 °C.

6.6. Чашки Петри стеклянные или пластмассовые диаметром от 90 до 100 мм или, если необходимо, 140 мм по ГОСТ 25336.

6.7. Пипетки градуированные, калиброванные только для бактериологического применения, номинальной вместимостью 10,2 и 1 см3, с ценой деления 0,5 и 0,1 см3 и с выходным отверстием с номинальным диаметром от 2 до 3 мм по ГОСТ 29228.

6.8. Шпатели из стеклянного или пластмассового стержня диаметром приблизительно 3,5 мм и длиной 20 см, изогнутые под прямым углом на расстоянии около 3 см от одного конца; обрезанные концы должны быть ровными (оплавленными).

Отбор проб по нормативным документам, действующим на территории государства, принявшего стандарт.

Важно, чтобы в лабораторию поступала представительная проба, которая не была повреждена или изменена при транспортировке или хранении.

Отбор проб не является частью метода, установленного в настоящем стандарте. В случае отсутствия конкретного стандарта на отбор проб продукта рекомендуется, чтобы заинтересованные стороны достигли согласия по процедуре отбора проб.

Пробы для испытания приготавливают в соответствии со стандартами ИСО 6887 (все части), ИСО 6887-5-, ГОСТ 26669 или стандартом, распространяющимся на конкретный продукт. При отсутствии соответствующего стандарта рекомендуется, чтобы заинтересованные стороны достигли согласия по этому вопросу.

9.1. Пробы, исходная суспензия и разведения

По ISO 6887 (все части), ГОСТ 26669 или соответствующему стандарту на конкретный продукт.

9.2. Инокуляция и инкубация

9.2.1. В каждую из двух чашек Петри с агаром (5.2.5) переносят с помощью стерильной пипетки (6.7) 0,1 или 0,2 см3 пробы для испытания, если продукт жидкий, или исходную суспензию в случае испытания продукта другой консистенции.

Если необходимо, повторяют процедуру, используя последующие десятичные разведения.

9.2.2. Если для некоторых продуктов необходимо определить небольшое количество B. cereus, пределы обнаружения могут быть увеличены в 10 раз в результате исследования 1,0 см3 пробы для испытания, если исходный продукт жидкий, или 1,0 см3 исходной суспензии для продуктов других консистенций. В этом случае распределяют 1 см3 инокулята или на поверхности большой чашки Петри (диаметром 140 мм), или на поверхности пяти маленьких чашек (диаметром 90 мм) с помощью стерильного шпателя (6.8). В обоих случаях посевы проводят в двух повторностях, используя две большие чашки или десять маленьких чашек.

9.2.3. Тщательно и быстро распределяют инокулят по поверхности чашки с агаром, не касаясь сторон чашки шпателем (6.8). Используют новый стерильный шпатель для каждой чашки. Оставляют чашки с закрытыми крышками на 15 мин при температуре окружающей среды для впитывания инокулята агаром.

9.2.4. Переворачивают засеянные чашки Петри (9.2.3) и инкубируют их в течение 18 - 24 ч в инкубаторе (6.3) при температуре (30 +/- 1) °C. Если после инкубирования выросшие колонии видны неотчетливо, то посевы инкубируют перед подсчетом еще 24 ч.

9.3. Подсчет колоний

После инкубации (9.2.4) отбирают чашки, предпочтительно двух последовательных разведений, содержащие менее 150 колоний.

Подсчитывают презумптивные колонии B. cereus на каждой чашке. Презумптивные колонии большие, розового цвета (указывающего на отсутствие ферментации маннита) и обычно окружены зоной выпадения осадка (указывающей на присутствие лецитиназы).

Если на чашках, инокулированных жидким продуктом или наименьшим разведением для продуктов других консистенций, выросло менее 15 характерных колоний, то возможно провести приблизительный подсчет, как описано в разделе 10.

Примечания.

1. Если на чашках Петри выросли микроорганизмы, способные ферментировать маннитол с образованием кислоты, то в этом случае характерного розового цвета колоний B. cereus может не быть. Колонии могут быть очень бледными или полностью бесцветными.

2. Некоторые штаммы B. cereus образуют небольшое количество лецитиназы или совсем ее не образуют. Колонии этих штаммов не будут окружены зоной выпадения осадка. Такие атипичные колонии также отбирают для подтверждения принадлежности к B. cereus.

Если 1,0 см3 инокулята был распределен на поверхности пяти чашек (9.2.2), то эти чашки считают за одну для последующего подсчета и подтверждения.

9.4. Подтверждение

9.4.1. Отбор колоний для подтверждения

С каждой чашки, отобранной согласно 9.3, отбирают пять типичных или атипичных колоний. Если на чашке менее пяти колоний, берут все имеющиеся колонии. Подтверждают эти колонии, как указано в 9.4.2 - 9.4.5

Если чашки Петри содержат большое количество колоний и нет возможности отобрать хорошо изолированные колонии, то делают посев штрихом пяти колоний на чашки со средой (5.2.4). Посевы инкубируют при температуре (30 +/- 1) °C в течение 18 - 24 ч.

Отбирают с каждой чашки по крайней мере одну хорошо изолированную колонию, окрашенную в розовый цвет. Подтверждают эту колонию, как указано в 9.4.2 - 9.4.5.

9.4.2. Гемолитический тест на агаре с бараньей кровью

Засевают штрихом отобранные колонии (9.4.1) на поверхность агара с бараньей кровью (5.3) так, чтобы можно было правильно интерпретировать гемолитическую реакцию.

Посевы инкубируют при температуре (30 +/- 1) °C в течение (24 +/- 2) ч и интерпретируют гемолитическую реакцию. Гемолитический тест является арбитражным.

9.4.3. Биохимическая интерпретация

10.1. Подсчет презумптивных B. cereus

Подсчет презумптивных B. cereus проводят по ГОСТ ISO 7218 и ГОСТ 26670.

Если две чашки с соответствующей пробой при испытании (жидких продуктов) или исходной суспензии (других продуктов) содержат менее 15 типичных колоний B. cereus, то допускается проведение приблизительного подсчета. Результат записывают по ГОСТ 26670 с указанием нижнего и верхнего предела для 95% доверительного интервала.

10.2. Отсутствие в посевах колоний

Если две чашки с соответствующей пробой при испытании (жидких продуктов) или исходной суспензии (других продуктов) не содержат типичных колоний B. cereus, результат записывают следующим образом:

- менее 1 микроорганизма на кубический сантиметр (жидкие продукты);

- менее 1/d микроорганизмов на грамм (другие продукты), где d - коэффициент разведения исходной суспензии.

Протокол испытаний должен включать:

a) всю информацию, необходимую для полной идентификации пробы;

b) применяемый метод отбора проб, если известен;

c) применяемый метод испытания со ссылкой на настоящий стандарт;

d) температуру инкубации;

e) все рабочие подробности, не установленные в настоящем стандарте, или считающиеся необязательными, вместе с подробностями всех инцидентов, которые могли бы повлиять на результат(ы) испытания, указание на метод подсчета презумптивных B. cereus;

f) полученный(ые) результат(ы) испытания.

А.1. Содержание исключенного пункта 10.3

"10.3. Прецизионность

10.3.1. Межлабораторные испытания

Подробности межлабораторных испытаний, касающиеся прецизионности метода, опубликованы (см. [7] и [8]) и суммированы в приложении B. Пределы повторяемости и воспроизводимости определялись с использованием трех видов пищевых продуктов, загрязненных разными уровнями, с помощью эталонных материалов. Полученные в результате межлабораторных испытаний значения могут быть неприменимы к диапазонам концентраций и матрицам, отличным от установленных в этом стандарте.

10.3.2. Предел повторяемости

Абсолютное расхождение между результатами двух независимых однократных испытаний (выраженными в форме десятичного логарифма ) (количество B. cereus на грамм или кубический сантиметр) или отношение более высокого к более низкому значению из двух результатов по нормальной шкале, полученными за короткий промежуток времени с использованием одного и того же метода на идентичном материале в одной и той же лаборатории одним и тем же оператором на одинаковом оборудовании, не более чем в 5% случаев будет превышать предел повторяемости r.

В качестве общего показателя предела повторяемости (r) в процессе испытания проб пищевых продуктов могут использоваться следующие значения:

r = 0,29 (расхождение между результатами, выраженными в форме десятичного логарифма ), или

r = 2,0 (отношение между результатами испытания).

Для эталонных материалов (см. [4]) могут применяться следующие значения:

r = 0,12 (расхождение между результатами, выраженными в форме десятичного логарифма ), или

r = 1,3 (отношение между результатами испытания).

ПРИМЕР. Был получен первый результат испытания 10000 или B. cereus на грамм пищевого продукта. При условии повторяемости отношение между первым и вторым результатом не должно превышать 2,0. Поэтому второй результат будет находиться между 5000 (= 10000/2,0) и 20000 (10000 x 2,0) B. cereus на грамм.

10.3.3. Предел воспроизводимости

Абсолютное расхождение между результатами двух независимых однократных испытаний (выраженными в форме десятичного логарифма ) (количество B. cereus на грамм или миллилитр) или отношение более высокого к более низкому из двух результатов по нормальной шкале, полученными с использованием одного и того же метода на идентичном материале в разных лабораториях разными операторами на различном оборудовании, не более чем в 5% случаев будет превышать предел воспроизводимости R.

В качестве общего показателя предела воспроизводимости (R) в процессе испытания проб пищевых продуктов могут использоваться следующие значения:

R = 0,42 (расхождение между результатами выраженными в форме десятичного логарифма ), или

R = 2,6 (отношение между результатами испытания).

Для эталонных материалов (см. [4]) могут применяться следующие значения:

R = 0,23 (расхождение между результатами, выраженными в форме десятичного логарифма ), или

R = 1,7 (отношение между результатами испытания).

ПРИМЕР 1. В первой лаборатории был получен результат 10000 или B. cereus на грамм пищевого продукта. При условии воспроизводимости отношение между результатами, полученными в первой и второй лаборатории, не должно превышать 2,6. Поэтому результат, полученный во второй лаборатории, должен находиться между 3800 (= 10000/2,6) и 26000 (10000 x 2,6) B. cereus на грамм.

ПРИМЕР 2. Лаборатория хочет определить максимальный уровень, который она может получить и который все еще соответствует установленному пределу (например, предел 100000 или ). Для этого значение R следует умножить на коэффициент 0,59. Это значение, равное 0,25 (0,42 x 0,59), представлено как расхождение между результатами, выраженными в форме десятичного логарифма , или 1,78 как отношение между результатами испытания. Таким образом, результаты до или 178000 (100000 x 1,78) включительно не показывают на несоответствие с пределом. Коэффициент 0,59 отражает тот факт, что испытание с односторонним 95% доверительным интервалом применяется, чтобы проверить, превышен ли предел. Коэффициент 0,59 получен из следующей формулы

А.2. Содержание исключенного приложения A

Границы доверительного интервала на уровне 95% для оценки небольшого количества колоний, когда количество колоний, выросших на чашках, менее 15, приводятся в таблице A.1.

А.3. Содержание исключенного приложения B

Международные совместные испытания, в которых приняли участие 20 лабораторий из 17 стран, проводились на сыре, мясе, сухом картофельном пюре-концентрате и эталонном материале. Каждая проба пищевых продуктов была проанализирована при разных уровнях загрязнения. Испытание, являющееся частью европейского проекта SMT4 CT-96 2098, субсидируемого Европейской Комиссией, проводилось в октябре 1997 г. Национальным институтом здравоохранения (RIVM).

Метод, представленный для межлабораторных испытаний, соответствует требованиям ISO 7932:1993, включая следующие тесты для подтверждения: MYP агаровую среду, глюкозно-агаровую среду, VP среду и нитратную среду.

В соответствии с ISO 5725-1:1994 [5] были определены следующие параметры для представления данных о прецизионности, которые приводятся в таблицах B.1 - B.4.

Примечание. Сравнение структур стандартов приведено по разделам 5, 9, 10, 12 и приложениям A и B, так как остальные разделы и их структурные элементы идентичны.