"ГОСТ 31709-2012 (ISO 14674:2005). Межгосударственный стандарт. Молоко и сухое молоко. Определение содержания афлатоксина M1. Очистка с помощью иммуноаффинной хроматографии и определение с помощью тонкослойной хроматографии"
(введен в действие Приказом Росстандарта от 29.11.2012 N 1772-ст)

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены".

1. Подготовлен ОАО "Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации" (ОАО "ВНИИС") на основе аутентичного перевода на русский язык международного стандарта, указанного в пункте 4.

2. Внесен Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии.

3. Принят Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (Протокол от 1 октября 2012 г. N 51).

За принятие проголосовали:

4. Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 ноября 2012 г. N 1772-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 31709-2012 (ISO 14674:2005) введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2013 г.

5. Настоящий стандарт модифицирован по отношению к международному стандарту ISO 14674:2005 Milk and milk powder. Determination of aflatoxin content. Clean-up by immunoaffinity chromatography and determination by thin-layer chromatography (Молоко и сухое молоко. Определение содержания афлатоксина . Очистка с помощью иммуноаффинной хроматографии и определение с помощью тонкослойной хроматографии).

При этом дополнительные слова, фразы, абзацы, включенные в текст стандарта для учета потребностей национальной экономики и особенностей межгосударственной стандартизации, выделены курсивом.

Сведения о соответствии межгосударственных стандартов ссылочным международным стандартам приведены в дополнительном Приложении ДА.

Степень соответствия - модифицированная (MOD).

Стандарт подготовлен на основе применения ГОСТ Р 52831-2007.

6. Введен впервые.

Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта публикуется в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты".

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемых информационных указателях "Национальные стандарты". В случае пересмотра или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты".

Настоящий стандарт распространяется на молоко и сухое молоко и устанавливает метод определения содержания афлатоксина с помощью тонкослойной хроматографии с предварительной очисткой с использованием иммуноаффинной хроматографии.

Минимально определяемое количество афлатоксина составляет 2 нг, что соответствует приблизительно 0,10 мкг/дм3 для молока или разбавленного сухого молока.

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ ISO 5725-1-2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения

ГОСТ ISO 5725-2-2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений

ГОСТ 1770-74 (ISO 1042-83, ISO 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 2603-79 Реактивы. Ацетон. Технические условия

ГОСТ 5789-78 Реактивы. Толуол. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 6995-77 Реактивы. Метанол-яд. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 20015-88 Хлороформ. Технические условия

ГОСТ 22300-76 Реактивы. Эфиры этиловый и бутиловый уксусной кислоты. Технические условия

ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26809-86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу

ГОСТ 29227-91 (ISO 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

Примечание. При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов (и классификаторов) на территории государства по соответствующему указателю стандартов (и классификаторов), составленному по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

В настоящем стандарте применяют следующие термины с соответствующими определениями:

3.1. Содержание афлатоксина : массовая концентрация афлатоксина , выраженная в мкг/дм3 для молока, или массовая доля афлатоксина , выраженная в мкг/кг для сухого молока, определенная методом, установленным в настоящем стандарте.

3.2. Аналитический выход (recovery): отношение массы, массовой доли или массовой концентрации определяемого компонента, найденное данным методом, к действительному значению соответствующей величины в исходном образце.

Афлатоксин экстрагируют, пропуская пробу через иммуноаффинную колонку, содержащую специфические антитела, связанные с твердым материалом субстрата. Когда проба проходит через колонку, антитела селективно связываются с любым присутствующим афлатоксином (антигеном) и образуют комплекс антитело-антиген. Все другие компоненты основного состава пробы вымываются из колонки водой. Затем афлатоксин элюируют из колонки смесью ацетонитрил/метанол. В соответствии с концентрацией элюата количество афлатоксина определяют методом однонаправленной тонкослойной хроматографии. В случае возникновения помех проводят двунаправленную тонкослойную хроматографию, чтобы отделить афлатоксин от примесей.

При отсутствии специальных указаний используют реактивы только признанных аналитических марок.

Вода должна соответствовать требованиям ГОСТ 6709. Вода не должна содержать органические примеси.

5.1. Чистые растворители

5.1.1. Хлороформ по ГОСТ 20015.

5.1.2. Ацетонитрил.

5.1.3. Диэтиловый эфир по ГОСТ 22300.

5.1.4. Метанол по ГОСТ 6995.

5.1.5. Толуол по ГОСТ 5789.

5.1.6. Ацетон по ГОСТ 2603.

5.1.7. Изопропанол.

5.2. Смесь ацетонитрил/метанол, в объемном соотношении 3:2

Смесь приготовляют, добавляя 30 см3 ацетонитрила (см. 5.1.2) к 20 см3 метанола (см. 5.1.4), и перемешивают.

5.3. Смесь толуол/ацетонитрил, в объемном соотношении 9:1

Смесь приготовляют, добавляя 9 см3 толуола (см. 5.1.5) к 1 см3 ацетонитрила (см. 5.1.2), и перемешивают. Этот раствор используют для повторного суспендирования стандартных растворов афлатоксина (см. 5.5) и выпаренного элюата перед проведением анализа методом тонкослойной хроматографии.

5.4. Растворители для проведения тонкослойной хроматографии

5.4.1. Раствор для однонаправленной тонкослойной хроматографии

Приготовляют 100 см3 раствора для однонаправленной тонкослойной хроматографии путем добавления 4 см3 метанола (см. 5.1.4) и 1 см3 воды к 95 см3 диэтилового эфира (см. 5.1.3) и тщательно перемешивают (объемное отношение 95:4:1).

5.4.2. Раствор для двунаправленной тонкослойной хроматографии

Приготовляют 100 см3 раствора для двунаправленной тонкослойной хроматографии путем добавления 10 см3 ацетона (см. 5.1.6) и 3 см3 изопропанола (см. 5.1.7) к 87 см3 хлороформа (см. 5.1.1) и тщательно перемешивают (объемное отношение 87:10:3).

5.5. Стандартный раствор афлатоксина 

5.5.1. Основной стандартный раствор афлатоксина 

Приготовляют основной стандартный раствор афлатоксина с номинальной концентрацией афлатоксина 10 мкг/см3 (см 5.1.1) путем повторного суспендирования 10 мкг лиофилизированной пленки афлатоксина в 1 см3 хлороформа.

Согласно протоколу AOAC [1] концентрацию основного стандартного раствора афлатоксина определяют путем измерения его оптической плотности при длине волны максимального поглощения в диапазоне длин волн 200 - 400 нм относительно хлороформа (см. 5.1.1), применяемого в качестве образца сравнения.

Контролируют чистоту афлатоксина , регистрируя спектр в интервале 200 - 400 нм. Измеряют оптическую плотность (A) при длине волны максимума поглощения , близкой к 365 нм. Вычисляют массовую концентрацию c, мкг/см3, по формуле

где A - числовое значение оптической плотности, измеренной при ;

M - числовое значение молярной массы афлатоксина , г/моль (M = 328 г/моль);

- числовое значение молярного коэффициента поглощения афлатоксина в хлороформе, м2/моль .

Основной стандартный раствор афлатоксина хранят в хорошо закупоренном пузырьке из темного стекла, защищенном от света, при температуре ниже 0 °C.

Срок хранения основного стандартного раствора афлатоксина - один год.

5.5.2. Рабочий стандартный раствор афлатоксина 

5.5.2.1. Рабочий раствор A

Используют мерную пипетку или микрошприц (см. 6.2) для помещения 50 мм3 рабочего стандартного раствора афлатоксина (см. 5.5.1) в пузырек. Раствор упаривают досуха. Повторно суспендируют сухой остаток с 500 мм3 смеси толуол/ацетонитрил (см. 5.3), чтобы получить рабочий стандартный раствор афлатоксина с концентрацией 1 мкг/см3 (рабочий раствор A). Раствор A используют для нанесения его на пластинки для тонкослойной хроматографии при исследовании проб с высоким уровнем загрязнения или когда массовая концентрация афлатоксина близка к 0,50 мкг/дм3.

5.5.2.2. Рабочий раствор B

Помещают 100 мм3 раствора A в пузырек. Добавляют 900 мм3 смеси толуол/ацетонитрил (см 5.3), чтобы получить рабочий стандартный раствор афлатоксина с концентрацией 0,1 мкг/см3 (рабочий раствор B). Раствор B используют для нанесения его на пластинки тонкослойной хроматографии при исследовании проб с низким уровнем загрязнения или когда массовая концентрация афлатоксина близка к 0,10 мкг/дм3.

Используют обычное лабораторное оборудование и, в частности:

6.1. Мерные пипетки требуемой вместимости по ГОСТ 29227.

6.2. Микрошприцы.

6.3. Лабораторную стеклянную посуду: стеклянные колбы и воронки соответствующей вместимости по ГОСТ 25336.

6.4. Колбу мерную с одной меткой вместимостью 200 см3 по ГОСТ 1770.

6.5. Цилиндр мерный вместимостью 100 см3 по ГОСТ 1770.

6.6. Одноразовые шприцы вместимостью 10 и 100 см3.

6.7. Стеклянную пробирку с коническим дном вместимостью 5 см3 для сбора экстракта после этапа очистки по ГОСТ 1770.

6.8. Испарительную систему, испаритель роторный или оборудование, позволяющее получать слабый поток азота.

6.9. Спектрометр с диапазоном измерения, позволяющим проводить исследования при длинах волн от 200 до 400 нм, снабженный кварцевыми кюветами с длиной оптического пути 10 мм.

6.10. Термостат водяной, поддерживающий температуру от 35 °C до 37 °C.

6.11. Центрифугу, обеспечивающую радиальное ускорение не менее 2000 g и охлаждение до 4 °C.

6.12. Бумагу фильтровальную по ГОСТ 12026.

6.13. Иммуноаффинные колонки.

Иммуноаффинные колонки должны содержать антитела относительно афлатоксина . Максимальная емкость колонок должна быть не менее 100 нг афлатоксина (что соответствует 1 мкг/дм3 или 10 мкг/кг, когда используют 100 см3 пробы для анализа). Они должны давать выход афлатоксина не менее 80% для массы 4 нг токсина (что соответствует 0,04 мкг/дм3 или 0,40 мкг/кг на 100 см3 пробы для анализа). Допускается использовать любую иммуноаффинную колонку, удовлетворяющую вышеуказанным рабочим характеристикам.

6.14. Весы лабораторные с точностью взвешивания до 0,1 г по ГОСТ 24104.

6.15. Магнитную мешалку.

6.16. Мешалку вихревого типа.

6.17. Вакуумную систему для иммуноаффинного картриджа.

6.18. Шкаф сушильный (термостат), обеспечивающий поддержание температуры 50 °C.

6.19. Камеру для тонкослойной хроматографии.

6.20. Пластинки для тонкослойной хроматографии, размером 10 x 10 см или 20 x 20 см, с силикагелем 60, сделанные из стекла или алюминия.

6.21. Ультрафиолетовую лампу, излучающую при длине волны 365 нм.

6.22. Денситометр.

7.1. Отбор проб - по ГОСТ 26809 и [2].

В лабораторию направляют представительные пробы, которые не были повреждены в процессе хранения и транспортирования.

8.1. Молоко

Пробу нагревают в термостате (см. 6.10) до (35 +/- 2) °C, чтобы растворить слой жира для получения хорошей гомогенизации пробы для анализа, при умеренном перемешивании.

Гомогенизированную пробу для анализа центрифугируют (см. 6.11) при радиальном ускорении 2000 g не менее 15 мин. Пробу охлаждают для лучшего отделения жира и верхний тонкий слой жира удаляют. При необходимости проводят фильтрование через один или более листов фильтровальной бумаги (см. 6.12). Собирают не менее 100 см3 приготовленной таким образом пробы для анализа.

8.2. Сухое молоко

20,0 г навески пробы с точностью до 0,1 г помещают в мерную колбу вместимостью 250 см3 и растворяют со 150 см3 воды, предварительно нагретой при температуре от 50 °C до 60 °C. Полученный раствор перемешивают магнитной мешалкой (см. 6.15) в течение 10 мин.

Испытуемый раствор оставляют охлаждаться до комнатной температуры. Затем осторожно переносят весь раствор в мерную колбу вместимостью 200 см3 (см. 6.4). Разбавляют до метки водой. Закрывают колбу и встряхивают ее содержимое для получения хорошо гомогенизированного раствора.

Центрифугируют (см. 6.11) испытуемый раствор при радиальном ускорении 2000 g не менее 15 мин. Раствор охлаждают для лучшего отделения жира и удаляют верхний тонкий слой жира. При необходимости проводят фильтрование через один или более листов фильтровальной бумаги (см. 6.12). Собирают не менее 100 см3 приготовленной пробы для испытания.

8.3. Иммуноаффинная очистка

Иммуноаффинной колонке (см. 6.13) дают достигнуть комнатной температуры. Присоединяют шприц к верхней части иммуноаффинного картриджа. Отбирают 100 см3 приготовленного испытуемого раствора (см. 8.1 или 8.2), используя мерный цилиндр вместимостью 100 см3 (см. 6.5) или пипетку.

Переводят анализируемую пробу в шприц и пропускают через иммуноаффинную колонку с постоянной медленной скоростью потока около 2 - 3 см3/мин. Используют гравитационную или вакуумную системы (см. 6.17) для контроля скорости потока. Не следует допускать высыхания колонки. Промывают колонку, используя 40 см3 воды при постоянной медленной скорости потока. После промывки колонку продувают досуха, промывочный раствор выбрасывают.

Устанавливают другой сухой чистый шприц на картридж. Медленно элюируют афлатоксин из колонки, пропуская 2,5 см3 смеси ацетонитрил/метанол (см. 5.2) и затем 2,5 см3 чистого метанола (5.1.4). Дают этим растворам контактировать с колонкой не менее 1 мин при соблюдении постоянной медленной скорости потока. Затем продувают колонку досуха.

Собирают элюат в пробирку с коническим дном и выпаривают до минимального объема (1 - 2 капли), используя роторный испаритель (см. 6.8) при температуре <= 40 °C или используя слабый поток азота. Не следует испарять элюат до полной сухости, это позволит достичь хорошего повторного суспендирования афлатоксина , присутствующего в остатке пробы.

Добавляют 200 мм3 чистого ацетонитрила (см. 5.1.2) к остатку пробы. Закрывают пробирку и интенсивно перемешивают, используя мешалку вихревого типа (см. 6.16), в течение 1 мин. Испаряют снова до минимального объема (1 - 2 капли), используя роторный испаритель (см. 6.8) при температуре <= 40 °C или слабый поток азота.

Примечание. Предыдущий этап необходим, чтобы избежать образования эмульсии и получить хорошее повторное суспендирование при добавлении смеси толуол/ацетонитрил.

Открывают пробирку и добавляют 100 мм3 смеси толуол/ацетонитрил (см. 5.3) к остатку пробы. Закрывают пробирку и снова интенсивно перемешивают, используя мешалку вихревого типа (см. 5.16), в течение 1 мин. Очищенную таким образом пробу для анализа хранят до начала процедуры.

9.1. Однонаправленная тонкослойная хроматография

На пластинку тонкослойной хроматографии (см. 6.20) наносят 10 - 20 мм3 очищенной пробы по 8.3. Добавляют аликвоты, например, по 5, 10, 20 мм3 соответствующего рабочего стандартного раствора афлатоксина , приготовленного по 5.5.2 (раствор A или B).

Пластинку помещают в камеру для тонкослойной хроматографии (см. 6.19), содержащую раствор для однонаправленной тонкослойной хроматографии (см. 5.4.1). Хроматографию проводят до тех пор, пока фронт растворителя не достигнет высоты примерно 10 см.

Удаляют пластинку из камеры и оставляют ее сохнуть на воздухе. Считывают полученные пятна, используя ультрафиолетовую лампу (см. 6.21) или денситометр (см. 6.22) при 365 нм. Сравнивают интенсивность флуоресценции пятна на хроматограмме пробы с интенсивностями, полученными для рабочих стандартных растворов афлатоксина .

Вычисляют содержание афлатоксина в анализируемой пробе, как описано в разделе 10.

Если интенсивность флуоресценции пятна на хроматограмме пробы выше по сравнению с рабочим стандартным раствором афлатоксина самой высокой интенсивности флуоресценции, то оценивают уровень загрязнений. Исходя из этого уровня, разбавляют очищенную пробу для анализа (см. 8.3) подходящим объемом смеси толуол/ацетонитрил (см. 5.3).

Повторяют процедуру с разбавленной очищенной пробой, описанную в настоящем подразделе.

9.2. Двунаправленная тонкослойная хроматография

При появлении на хроматограмме помех вблизи флуоресцирующих пятен проводят двунаправленную тонкослойную хроматографию. Наносят на пластинку для тонкослойной хроматографии (см. 6.20) 20 мм3 очищенной пробы для анализа (см. 8.3). Добавляют по 5, 10, 20 мм3 рабочего стандартного раствора афлатоксина , приготовленного, как описано в 5.5.2, чтобы пропустить его в направлении 1, и по 5, 10, 20 мм3 того же самого рабочего стандартного раствора афлатоксина (см. 5.5.2), чтобы пропустить его в направлении 2 (см. рисунок 1).

Помещают пластинку в камеру тонкослойной хроматографии (см. 6.19), содержащую раствор для однонаправленной тонкослойной хроматографии (см. 5.4.1). Хроматографируют (элюируют) пластинку в первом направлении до тех пор, пока фронт подвижной фазы не достигнет высоты примерно 7 см. Удаляют пластинку из камеры и оставляют ее сохнуть на воздухе.

Нагревают сухую пластинку в сушильном шкафу (термостате) (см. 6.18) при температуре 50 °C в течение 5 мин. Охлаждают пластинку и помещают ее в другую камеру для тонкослойной хроматографии для элюирования в направлении 2. Хроматографируют (элюируют) пластинку во втором направлении до тех пор, пока фронт растворителя не достигнет высоты около 7 см.

Удаляют пластинку из камеры и оставляют ее сохнуть на воздухе. Считывают полученные пятна, используя ультрафиолетовую лампу (см. 6.21) или денситометр (см. 6.22) при 365 нм. Сравнивают интенсивность флуоресценции пятна на испытательном образце с интенсивностями, полученными для рабочих стандартных растворов афлатоксина .

Вычисляют содержание афлатоксина в анализируемой пробе, как описано в разделе 10. Если интенсивность флуоресценции пятна на хроматограмме пробы выше по сравнению с рабочим стандартным раствором афлатоксина самой высокой интенсивности флуоресценции, то повторяют процедуру с очищенной пробой меньшего объема (см. 8.3), как описано в настоящем подразделе.

После анализа методом тонкослойной хроматографии оставшуюся очищенную пробу для анализа хранят в закрытом пузырьке или морозильной камере для дальнейшего количественного анализа или подтверждения идентичности.

10.1. Вычисление

Вычисляют массовую концентрацию или массовую долю афлатоксина в пробе (см. 8.1 или 8.2) или мкг/кг, используя следующее уравнение

где - численное значение объема рабочего стандартного раствора A или B (см. 5.5.2), сравнимое с объемом анализируемой пробы (см. 9.1 или 9.2) и используемое в вычислении, мм3;

- массовая концентрация афлатоксина используемого рабочего стандартного раствора A или B (см. 5.5.2), сравнимая с объемом анализируемой пробы (см. 9.1 или 9.2) и используемая в вычислении, нг/мм3;

- объем растворенного остатка, мм3 ;

- объем (см. 9.1 или 9.2) очищенной анализируемой пробы, сопоставимый с объемом рабочего стандартного раствора A или B (см. 5.5.2) и используемый в вычислении, мм3;

- объем (см. 8.1) или масса (см. 8.2) пробы, см3 или г.

10.2. Оценка результатов

За окончательный результат измерения принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных измерений, округленное до двух значащих цифр.

11.1. Межлабораторные испытания

Подробная информация о межлабораторных испытаниях для определения прецизионности метода приведена в Приложении А. Применение результатов межлабораторных испытаний возможно только для указанных в таблице А.1 уровней загрязнения афлатоксином проб молока, сырого и сухого молока.

11.2. Пределы повторяемости и воспроизводимости

Значения пределов повторяемости (абсолютной разности между двумя независимыми результатами единичных испытаний, полученных одним и тем же оператором при использовании одного и того же оборудования в пределах короткого интервала времени) и воспроизводимости (абсолютной разности между двумя результатами испытаний, полученных одним и тем же методом на идентичном испытуемом материале в разных лабораториях) для доверительной вероятности 0,95 приведены в таблице 1.

В протоколе испытания должны быть указаны:

a) вся информация, необходимая для полной идентификации пробы;

b) метод отбора проб (если известен);

c) используемый метод испытания со ссылкой на настоящий стандарт;

d) все рабочие подробности, не установленные в этом стандарте или рассматриваемые как факультативные, с особенностями, которые могли повлиять на окончательный(е) результат(ы) испытания;

e) полученные результаты или, в случае проверки повторяемости, конечный объявленный результат.

В международных испытаниях проб жидкого молока участвовало девять лабораторий, проб сухого молока - одиннадцать лабораторий, испытания проводились на параллельных пробах. Пробы жидкого молока для анализа имели два уровня загрязнения: 0,13 мкг/дм3 (L1) и 0,68 мкг/дм3 (L2). Пробы сухого молока для анализа имели также два уровня загрязнения: 1,17 мкг/кг (P1) и 5,49 мкг/кг (P2). Статистический анализ проводился по нескорректированным результатам и по результатам, которые были скорректированы для аналитического выхода.

Испытания были организованы AFSSA-LERHQA (Франция). Содержание афлатоксина в пробах загрязненного молока, разосланных участникам, определяли с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, описанного в [3].

Для нахождения данных по прецизионности, приведенных в таблице А.1, полученные результаты подвергали статистическому анализу согласно ГОСТ ISO 5725-1 и ГОСТ ISO 5725-2.