"ГОСТ 30627.6-98. Межгосударственный стандарт. Продукты молочные для детского питания. Методы измерений массовой доли витамина B2 (рибофлавина)"
(введен в действие Постановлением Госстандарта России от 28.04.1999 N 147)

1. Разработан Межгосударственным техническим комитетом по стандартизации МТК 186 и Научно-исследовательским институтом детского питания.

Внесен Госстандартом России.

2. Принят Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (Протокол N 11 от 12 ноября 1998 г.).

За принятие проголосовали:

3. Постановлением Государственного комитета Российской Федерации по стандартизации и метрологии от 28 апреля 1999 г. N 147 межгосударственный стандарт ГОСТ 30627.6-98 введен в действие непосредственно в качестве государственного стандарта Российской Федерации с мая 2000 г.

4. Введен впервые.

Настоящий стандарт распространяется на молочные продукты для детского питания и устанавливает методы измерений массовой доли витамина - люмифлавиновый и прямой флюорометрии.

Люмифлавиновый метод основан на использовании свойства витамина (рибофлавина) при облучении в щелочной среде переходить в люмифлавин и измерении интенсивности флюоресценции последнего после извлечения его хлороформом.

Метод прямой флюорометрии основан на способности рибофлавина восстанавливаться в нефлюоресцирующее соединение под действием гидросульфита натрия и измерении интенсивности флюоресценции до и после восстановления рибофлавина. Метод неприменим для продуктов, содержащих злаковые компоненты.

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 61-75 Кислота уксусная. Технические условия

ГОСТ 199-78 Натрий уксуснокислый 3-водный. Технические условия

ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Технические условия

ГОСТ 3118-77 Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ 3145-84 Часы механические с сигнальным устройством. Общие технические условия

ГОСТ 4166-76 Натрий сернокислый. Технические условия

ГОСТ 4204-77 Кислота серная. Технические условия

ГОСТ 4212-76 Реактивы. Приготовление растворов для колориметрического и нефелометрического анализа

ГОСТ 4328-77 Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 4919.1-77 Реактивы и особо чистые вещества. Методы приготовления растворов индикаторов

ГОСТ 4919.2-77 Реактивы и особо чистые вещества. Методы приготовления буферных растворов

ГОСТ 5789-78 Толуол. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия

ГОСТ 10929-76 Водорода пероксид. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 14919-83 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 19881-74 Анализаторы потенциометрические для контроля pH молока и молочных продуктов. Общие технические условия

ГОСТ 20015-88 Хлороформ. Технические условия

ГОСТ 20490-75 Калий марганцовокислый. Технические условия

ГОСТ 24104-88 Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26809-86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовки проб к анализу

ГОСТ 28498-90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 29227-91 Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

Отбор проб и подготовка их к измерению - по ГОСТ 26809.

4.1. Аппаратура, материалы и реактивы

Анализатор потенциометрический диапазоном измерения от 3,5 до 8 ед. pH ценой деления шкалы 0,05 ед. pH по ГОСТ 19881.

Баня водяная с обогревом, позволяющая поддерживать температуру от 0 до 100 °C с погрешностью +/- 2 °C.

Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.

Вакуумный сушильный шкаф, обеспечивающий поддержание заданного температурного режима в диапазоне от 0 до 200 °C с погрешностью +/- 2 °C.

Вакуум-эксикатор по ГОСТ 25336.

Весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.

Весы лабораторные общего назначения 4-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 500 г по ГОСТ 24104.

Воронки делительные номинальной вместимостью 250 см3 по ГОСТ 25336.

Воронки стеклянные лабораторные типа B по ГОСТ 25336.

Колбы мерные исполнения 1 2-го класса точности номинальной вместимостью 100, 250, 500, 1000 см3 по ГОСТ 1770.

Колбы типа Кн исполнения 2 номинальной вместимостью 100, 250 см3 по ГОСТ 25336.

Лампа настольная.

Пипетки исполнений 6, 7 2-го класса точности номинальной вместимостью 5, 10, 20 см3 по ГОСТ 29227.

Пипетки исполнений 4, 5 2-го класса точности номинальной вместимостью 1, 2 см3 по ГОСТ 29227.

Пробирки номинальной вместимостью 25 см3 исполнения 1 по ГОСТ 25336.

Секундомер 2-го класса [1] или часы 2-го класса по ГОСТ 3145.

Стаканы типа B исполнения 1 номинальной вместимостью 50, 600 см3 по ГОСТ 25336.

Стакан фарфоровый номинальной вместимостью 500 см3 по ГОСТ 9147.

Ступка фарфоровая с пестиком по ГОСТ 9147.

Термометр жидкостный (нертутный) диапазоном измерения от 0 до 100 °C ценой деления шкалы 1 °C по ГОСТ 28498.

Термостат с поддержанием заданного температурного режима от 0 до 60 °C с погрешностью +/- 0,8 °C.

Флюорометр любого типа с набором светофильтров.

Цилиндры исполнения 1 вместимостью 50, 250, 500 см3 по ГОСТ 1770.

Шкаф вытяжной.

Эксикатор исполнения 2 по ГОСТ 25336.

Электроплитка бытовая по ГОСТ 14919.

Амилоризин [2].

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Калий марганцовокислый х.ч. по ГОСТ 20490.

Кислота серная х.ч. по ГОСТ 4204.

Кислота соляная х.ч. по ГОСТ 3118.

Ледяная уксусная кислота х.ч. по ГОСТ 61.

Натрий уксуснокислый 3-водный по ГОСТ 199.

Натрия гидроокись х.ч. по ГОСТ 4328.

Натрия сульфат безводный х.ч. по ГОСТ 4166.

Перекись водорода х.ч. по ГОСТ 10929.

Рибофлавин кристаллический (витамин ) [3].

Толуол ч.д.а. по ГОСТ 5789.

Хлороформ для наркоза х.ч. по ГОСТ 20015.

Допускается применение других средств измерения с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками не хуже, а также реактивов и материалов по качеству не ниже вышеуказанных.

Хранение растворов - по ГОСТ 4212.

Хранение реактивов и особо чистых веществ - по ГОСТ 4919.1 и ГОСТ 4919.2.

4.2. Подготовка к выполнению измерений

4.2.1. Приготовление основного стандартного раствора рибофлавина массовой концентрации 20 мкг/см3

Взвешивают (0,100 +/- 0,004) г кристаллического рибофлавина, на весах 2-го класса точности, высушивают в вакуумном сушильном шкафу не менее 2 ч при (60 +/- 5) °C или в вакуум-эксикаторе над концентрированной серной кислотой в течение 10 дней.

(0,0200 +/- 0,001) г высушенного рибофлавина, взвешенного на весах 2-го класса точности, помещают в мерную колбу вместимостью 1000 см3, добавляют 750 см3 дистиллированной воды и 1 см3 ледяной уксусной кислоты, слегка нагревают на водяной бане для лучшего растворения. После полного растворения рибофлавина раствор охлаждают до (20 +/- 5) °C, доводят объем до метки дистиллированной водой и перемешивают. Переносят раствор в склянку из темного стекла с притертой пробкой.

Раствор хранят при (6 +/- 2) °C не более 2 мес.

4.2.2. Приготовление рабочего стандартного раствора рибофлавина массовой концентрации 1 мкг/см3

5 см3 основного стандартного раствора, нагретого в темноте до (20 +/- 5) °C, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, доводят объем до метки дистиллированной водой и перемешивают.

4.2.3. Приготовление водного раствора соляной кислоты молярной концентрации c (HCl) = 0,1 моль/дм3

6,3 см3 концентрированной соляной кислоты плотностью 1,185 г/см3 растворяют в 300 - 500 см3 дистиллированной воды в мерной колбе вместимостью 1000 см3, доводят объем той же водой до метки и перемешивают.

4.2.4. Приготовление насыщенного раствора уксуснокислого натрия

(200,00 +/- 0,04) г уксуснокислого натрия, взвешенного на весах 4-го класса точности, растворяют в 200 - 300 см3 дистиллированной воды в мерной колбе вместимостью 500 см3, доводят объем дистиллированной водой до метки и перемешивают.

4.2.5. Приготовление водного раствора марганцовокислого калия массовой концентрации 0,03 г/см3

(3,00 +/- 0,04) г перманганата калия, взвешенного на весах 4-го класса точности, растворяют в 30 - 50 см3 дистиллированной воды в мерной колбе вместимостью 100 см3, доводят объем до метки дистиллированной водой и перемешивают.

Раствор хранят в темном месте при (20 +/- 5) °C не более 7 сут.

4.2.6. Приготовление водного раствора перекиси водорода массовой концентрации 0,03 г/см3

10 см3 перекиси водорода массовой концентрации 0,3 г/см3 растворяют в 30 - 50 см3 дистиллированной воды в мерной колбе вместимостью 100 см3, доводят объем до метки дистиллированной водой и перемешивают.

4.2.7. Приготовление водного раствора гидроокиси натрия молярной концентрации c (NaOH) = 7 моль/дм3

(140,00 +/- 0,04) г гидроокиси натрия, взвешенного на весах 4-го класса точности, растворяют при перемешивании в 300 см3 дистиллированной воды в фарфоровом стакане, охлаждают до (20 +/- 5) °C, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 500 см3, доводят объем дистиллированной водой до метки и перемешивают.

4.2.8. Приготовление водного раствора серной кислоты массовой концентрации 0,3 г/см3

170 см3 концентрированной серной кислоты плотностью 1,84 г/см3 осторожно приливают к 500 см3 дистиллированной воды в фарфоровом стакане, перемешивают, охлаждают до (20 +/- 5) °C, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см3, доводят объем дистиллированной водой до метки и вновь перемешивают.

4.2.9. Гидролиз

(6,00 +/- 0,01) г продукта, взвешенного на весах 4-го класса точности, растворяют в 150 см3 водного раствора соляной кислоты молярной концентрации c (HCl) = 0,1 моль/дм3 в конической колбе вместимостью 250 см3 и кипятят на водяной бане (40 +/- 1) мин.

Параллельно готовят холостую пробу на содержание рибофлавина в ферментных препаратах, используя те же количества ферментных препаратов и реактивов.

Затем колбы охлаждают до (20 +/- 5) °C, доводят активную кислотность гидролизатов до pH = 4,5 с помощью насыщенного раствора уксуснокислого натрия (5 - 7 см3), добавляют (0,10 +/- 0,01) г амилоризина или пектофоэтидина, взвешенных на весах 4-го класса точности, приливают 0,5 см3 толуола и выдерживают в термостате 14 - 16 ч при (37 +/- 1) °C.

Полученные гидролизаты охлаждают до (20 +/- 5) °C, переносят в мерную колбу вместимостью 250 см3, доводят объем до метки дистиллированной водой и фильтруют.

Если есть необходимость прервать анализ на 1 - 2 дня, то перед доведением объема до 250 см3 гидролизаты кипятят 5 мин на водяной бане.

До проведения измерений фильтраты хранят в плотно закрытых колбах в темном месте при (6 +/- 2) °C.

4.2.10. Окисление примесей

В коническую колбу вместимостью 250 см3 вносят 100 см3 фильтрата, в другую такую же колбу вносят 100 см3 холостой пробы, приготовленной по 4.2.9. В обе колбы добавляют по 2 см3 раствора серной кислоты массовой концентрации 0,3 г/см3 и из пипетки по каплям добавляют водный раствор перманганата калия массовой концентрации 0,03 г/см3, постоянно перемешивая, до получения малинового окрашивания, не исчезающего 20 с.

Через 1 мин избыток перманганата калия удаляют добавлением по каплям раствора перекиси водорода массовой концентрации 0,03 г/см3. Израсходованные объемы растворов перманганата и перекиси водорода приплюсовывают к первоначально взятому на окисление объему фильтрата, чтобы определить конечный объем раствора.

Полученный раствор переносят в делительную воронку, добавляют 30 - 50 см3 хлороформа и осторожно встряхивают 1 мин, избегая образования эмульсии.

После разделения слоев нижний хлороформенный слой отбрасывают, а верхний (водная фаза) используют для дальнейшего определения.

4.2.11. Фотолиз

В четыре конические колбы вместимостью 100 см3 вносят по 20 см3 анализируемого образца, полученного по 4.2.10. В две из них добавляют по 2 см3 рабочего стандартного раствора рибофлавина массовой концентрации 1 мкг/см3. В пятую коническую колбу вместимостью 100 см3 вносят 20 см3 холостой пробы. Во все колбы добавляют по 4 см3 водного раствора гидроокиси натрия молярной концентрации 7 моль/дм3, закрывают пробками, перемешивают и облучают их 40 мин светом двух настольных ламп по 100 Вт с расстояния 30 см при температуре окружающего воздуха (20 +/- 5) °C. Во избежание перегревания проб используют настольный вентилятор.

Немедленно после окончания облучения все растворы подкисляют 4 см3 ледяной уксусной кислоты, добавляют по 20 см3 хлороформа, закрывают притертыми пробками и встряхивают колбы 2 мин, избегая образования эмульсии.

Оставляют все колбы на (12 +/- 2) мин для расслоения водной и хлороформенной фаз.

Пипеткой с резиновой грушей или небольшой делительной воронкой отбирают 10 - 12 см3 хлороформенного раствора и фильтруют в отдельную сухую пробирку через слой безводного сернокислого натрия 20 - 30 г.

4.3. Проведение измерений

Измеряют флюоресценцию полученных хлороформенных растворов на флюорометре со светофильтрами, используемыми для витамина , имеющими максимум пропускания в области от 350 до 480 нм ( - первичный) и от 510 до 650 нм ( - вторичный).

Интервал определяемых концентраций рибофлавина составляет от 0,5 до 2,0 мкг/см3 раствора, поступающего на измерение флюоресценции.

4.4. Обработка результатов измерений

Массовую долю витамина (рибофлавина) , вычисляют по формуле

где A - среднее арифметическое значение показаний интенсивности флюоресценции для анализируемого образца без добавления стандартного раствора витамина ;

- среднее арифметическое значение показаний интенсивности флюоресценции для холостой пробы на реактивы;

m - масса добавленного витамина ;

V - общий объем гидролизата, см3;

- объем фильтрата после окисления, см3;

- среднее арифметическое значение показаний интенсивности флюоресценции для анализируемого образца с добавлением стандартного раствора витамина ;

- масса продукта, взятая для анализа, г;

- объем гидролизата, взятого на окисление, см3;

- объем гидролизата, взятого на облучение, см3.

За окончательный результат измерения принимают среднее арифметическое значение результатов двух параллельных измерений. Вычисления проводят до второго десятичного знака и округляют до первого десятичного знака.

Относительная погрешность измерения массовой доли витамина - +/- 30% при доверительной вероятности P = 0,95.

Расхождение между результатами двух параллельных измерений не должно превышать 30% среднего арифметического значения результатов измерений.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать 30% среднего арифметического значения результатов измерений.

5.1. Аппаратура, материалы и реактивы

Анализатор потенциометрический диапазоном измерения от 3,5 до 8 ед. pH ценой деления шкалы 0,05 ед. pH по ГОСТ 19881.

Баня водяная с обогревом, позволяющая поддерживать температуру от 0 до 100 °C с погрешностью +/- 2 °C.

Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.

Вакуумный сушильный шкаф, обеспечивающий температурный режим в диапазоне от 0 до 200 °C с погрешностью +/- 2 °C.

Вакуум-эксикатор по ГОСТ 25336.

Весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.

Весы лабораторные общего назначения 4-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 500 г по ГОСТ 24104.

Воронки делительные номинальной вместимостью 250 см3 по ГОСТ 25336.

Воронки стеклянные лабораторные типа B по ГОСТ 25336.

Колбы мерные исполнения 1 2-го класса точности номинальной вместимостью 100, 250, 500, 1000 см3 по ГОСТ 1770.

Колбы типа Кн исполнения 2 номинальной вместимостью 100, 250 см3 по ГОСТ 25336.

Лампа настольная.

Пипетки исполнений 6, 7 2-го класса точности номинальной вместимостью 5, 10, 20 см3 по ГОСТ 29227.

Пипетки исполнений 4, 5 2-го класса точности номинальной вместимостью 1, 2 см3 по ГОСТ 29227.

Пробирки номинальной вместимостью 25 см3 исполнения 1 по ГОСТ 25336.

Секундомер 2-го класса [1] или часы 2-го класса по ГОСТ 3145.

Стакан фарфоровый номинальной вместимостью 500 см3 по ГОСТ 9147.

Ступка фарфоровая с пестиком по ГОСТ 9147.

Термометр жидкостный (нертутный) диапазоном измерения от 0 до 100 °C ценой деления шкалы 1 °C по ГОСТ 28498.

Термостат с поддержанием заданного температурного режима от 0 до 60 °C с погрешностью +/- 0,8 °C.

Флюорометр любого типа с набором светофильтров.

Цилиндры исполнения 1 вместимостью 50, 250, 500 см3 по ГОСТ 1770.

Шкаф вытяжной.

Эксикатор исполнения 2 по ГОСТ 25336.

Электроплитка бытовая по ГОСТ 14919.

Амилоризин [2].

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Калий марганцовокислый х.ч. по ГОСТ 20490.

Кислота серная х.ч. по ГОСТ 4204.

Кислота соляная х.ч. по ГОСТ 3118.

Ледяная уксусная кислота х.ч. по ГОСТ 61.

Натрия гидросульфит х.ч. [4].

Натрия гидроокись х.ч. по ГОСТ 4328.

Натрий сульфат безводный х.ч. по ГОСТ 4166.

Натрий уксуснокислый 3-водный по ГОСТ 199.

Перекись водорода х.ч. по ГОСТ 10929.

Рибофлавин кристаллический (витамин ) [3].

Толуол ч.д.а. по ГОСТ 5789.

Хлороформ для наркоза х.ч. по ГОСТ 20015.

Допускается применение других средств измерения с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками не хуже, а также реактивов и материалов по качеству не ниже вышеуказанных.

Хранение растворов по ГОСТ 4212.

Хранение реактивов и особо чистых веществ по ГОСТ 4919.1 и ГОСТ 4919.2.

5.2. Подготовка к выполнению измерений

5.2.1. Приготовление основного стандартного раствора рибофлавина массовой концентрации 20 мкг/см3

Согласно 4.2.1.

5.2.2. Приготовление рабочего стандартного раствора рибофлавина массовой концентрации 1 мкг/см3

Согласно 4.2.2.

5.2.3. Приготовление водного раствора соляной кислоты молярной концентрации c (HCl) = 0,1 моль/дм3

Согласно 4.2.3.

5.2.4. Приготовление насыщенного раствора уксуснокислого натрия

Согласно 4.2.4.

5.2.5. Приготовление водного раствора марганцовокислого калия массовой концентрации 0,03 г/см3

Согласно 4.2.5.

5.2.6. Приготовление водного раствора перекиси водорода массовой концентрации 0,03 г/см3

Согласно 4.2.6.

5.2.7. Приготовление водного раствора гидроокиси натрия молярной концентрации c (NaOH) = 7 моль/дм3

Согласно 4.2.7.

5.2.8. Приготовление водного раствора серной кислоты массовой концентрации 0,3 г/см3

Согласно 4.2.8.

5.2.9. Гидролиз

Согласно 4.2.9.

5.2.10. Окисление примесей

В четыре пробирки наливают по 10 см3 фильтрата анализируемого образца, полученного по 4.2.9. В две из них добавляют по 1 см3 дистиллированной воды. В две другие - по 1 см3 стандартного раствора рибофлавина массовой концентрации 1 мкг/см3. В пятую пробирку наливают 10 см3 фильтрата холостой пробы и 1 см3 дистиллированной воды. Во все пробирки добавляют по 1 см3 ледяной уксусной кислоты и перемешивают. Затем вносят 0,5 см3 раствора перманганата калия массовой концентрации 0,03 г/см3, смешивают и оставляют на 2 мин. Добавляют в каждую пробирку по 0,5 см3 раствора перекиси водорода массовой концентрации 0,03 г/см3 и энергично встряхивают не более 30 с.

5.3. Проведение измерений

Измеряют флюоресценцию всех растворов согласно 4.3.

Интервал определяемых концентраций рибофлавина составляет от 0,02 до 0,20 мкг/см3 раствора, поступающего на измерение флюоресценции.

После этого добавляют в каждую пробирку небольшими порциями по (20 +/- 5) мг порошкообразного гидросульфита натрия и быстро (не более 10 с) вновь измеряют интенсивность флюоресценции растворов. Повторяют операцию добавления гидросульфита, не допуская помутнения растворов за счет выделения свободной серы, до наименьших значений интенсивности флюоресценции, полученных при повторном восстановлении рибофлавина гидросульфитом натрия.

5.4. Обработка результатов измерений

Массовую долю витамина (рибофлавина) , вычисляют по формуле

где A - среднее арифметическое значение показаний интенсивности флюоресценции для анализируемого образца без добавления стандартного раствора рибофлавина массовой концентрации 1 мкг/см3;

- среднее арифметическое значение показаний интенсивности флюоресценции для анализируемого образца без добавления стандартного раствора рибофлавина массовой концентрации 1 мкг/см3 после восстановления рибофлавина гидросульфитом натрия;

C - интенсивность флюоресценции холостой пробы;

- интенсивность флюоресценции холостой пробы после добавления гидросульфита натрия;

V - общий объем гидролизата, см3;

m - масса добавленного витамина ;

B - среднее арифметическое значение показаний интенсивности флюоресценции для анализируемого образца с добавлением стандартного раствора рибофлавина;

- среднее арифметическое значение показаний интенсивности флюоресценции для анализируемого образца с добавлением стандартного раствора рибофлавина после восстановления гидросульфитом натрия;

- объем фильтрата, взятый для окисления перманганатом калия, см3;

- масса продукта, взятая для анализа, г.

За окончательный результат измерения принимают среднее арифметическое значение результатов двух параллельных измерений. Вычисления проводят до второго десятичного знака и округляют до первого десятичного знака.

Относительная погрешность измерения массовой доли витамина - +/- 30% при доверительной вероятности P = 0,95.

Расхождение между результатами двух параллельных измерений не должно превышать 30% среднего арифметического значения результатов измерений.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать 30% среднего арифметического значения результатов измерений.