"ГОСТ 13496.22-90. Государственный стандарт Союза ССР. Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Метод определения цистина и метионина"
(утв. и введен в действие Постановлением Госстандарта СССР от 05.12.1990 N 3052)

1. Разработан и внесен ВПНО "Союзсельхозхимия".

Разработчики: Д.Д. Степанов, канд. биол. наук (руководитель темы); З.П. Силкина; Е.И. Синягин; Т.Б. Громова; Г.И. Гордиенко, канд. биол. наук; А.С. Полякова, канд. биол. наук; В.Г. Маковка; А.И. Фицев, канд. биол. наук; Ф.В. Воронкова, канд. биол. наук.

2. Утвержден и введен в действие Постановлением Государственного комитета СССР по управлению качеством продукции и стандартам от 05.12.90 N 3052.

3. Срок проверки - 1994 г.

Периодичность проверки - 5 лет.

4. Введен впервые.

5. Ссылочные нормативно-технические документы

Настоящий стандарт распространяется на все виды кормов, комбикормов и комбикормовое сырье и устанавливает метод определения цистина и метионина.

Метод основан на окислении цистина и метионина смесью перекиси водорода с муравьиной кислотой до цистеиновой кислоты и метионинсульфона и последующем их разделении на ионообменной хроматографической колонке после гидролиза соляной кислотой концентрации c(HCl) = 6 моль/дм3. Интенсивность окрашенного комплекса при реакции с нингидриновым реактивом пропорциональна содержанию аминокислоты в растворе.

Стандарт применяют в научно-исследовательских учреждениях, лабораториях агрохимической службы, республиканских и зональных лабораториях комбикормовой промышленности.

Отбор проб - по ГОСТ 13496.0, ГОСТ 13586.3, ГОСТ 13979.0, ГОСТ 17681, ГОСТ 27262.

Измельчитель проб растений ИПР-2 или соломорезка марки ИСР-1.

Сушилка проб кормов СК-2 или шкаф сушильный лабораторный с погрешностью поддержания температуры не более 5 °C.

Шкаф сушильный типа СЭШ-3М или аналогичный с рабочей температурой 110 °C, максимальным перепадом температуры 2 °C и периодическим колебанием температур в рабочей зоне не более 0,5 °C.

Мельница лабораторная МРП-2.

Сито с круглыми отверстиями диаметром 1 мм.

Весы лабораторные 2-го и 3-го классов точности с наибольшим пределом взвешивания 200 и 500 г по ГОСТ 24104.

Автоклав по ГОСТ 14106.

Термоблок многопозиционный для гидролиза кормов ТМ-1.

Автоанализатор аминокислот.

Устройство для выпаривания гидролизатов УВГ-1 или баня водяная.

pH-метр.

Дозатор стеклянный вместимостью 10 см3.

Ампулы стеклянные с перетяжкой вместимостью 20 см3 по ГОСТ 21400.

Колбы мерные вместимостью 50, 100, 1000 см3 по ГОСТ 1770.

Пробирки стеклянные вместимостью 20 см3 по ГОСТ 1770.

Пипетки градуированные вместимостью 1, 2, 5, 10 см3 по ГОСТ 20292.

Воронки стеклянные диаметром 2 - 3 см по ГОСТ 25336.

Чашки фарфоровые по ГОСТ 9147.

Бюксы стеклянные диаметром не менее 5 см по ГОСТ 25336.

Палочки стеклянные оплавленные.

Набор реактивов к автоанализатору.

Стандартные растворы аминокислот.

Кислота соляная концентрированная по ГОСТ 3118, х.ч.

Раствор соляной кислоты концентрации c(HCl) = 6 моль/дм3; готовят смешиванием равных объемов концентрированной соляной кислоты и дистиллированной воды.

Натрий лимоннокислый трехзамещенный по ГОСТ 22280, х.ч. или ч.д.а.

Фенол.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, х.ч., раствор с массовой долей 50%.

Кислота муравьиная по ГОСТ 5848, ч.д.а.

Водорода перекись по ГОСТ 10929.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709 двойного перегона.

Фильтры беззольные с синей полосой по ГОСТ 12026.

Допускается использовать аппаратуру, мерную посуду и другие средства измерений, имеющие такие же или лучшие метрологические характеристики.

3.1. Подготовка проб

Среднюю пробу сена, сенажа, зеленой массы измельчают на отрезки длиной 1 - 3 см. Корнеплоды разрезают на пластинки (ломтики) толщиной до 0,8 см. Методом квартования выделяют часть средней пробы, масса которой после высушивания должна быть не менее 100 г. Высушивание проб проводят в сушильном шкафу при температуре 60 - 65 °C до воздушно-сухого состояния. После высушивания пробу размалывают на мельнице и просеивают через сито. Остаток на сите дополнительно измельчают, добавляют к просеянной части и тщательно перемешивают.

Средние пробы комбикормов, зерна, жмыхов, шротов, гранул травяной муки или витаминной муки из древесной зелени размалывают без предварительного подсушивания и просеивают через сито. Корма с содержанием жира более 10% предварительно обезжиривают.

Подготовленные пробы хранят в стеклянной или пластмассовой банке с крышкой в сухом темном месте не более двух лет.

3.2. Приготовление окислительной смеси

Окислительную смесь готовят смешиванием перекиси водорода и муравьиной кислоты в соотношении 1:9; готовят в день проведения испытания.

3.3. Приготовление буферного раствора (2,20 +/- 0,02) ед. pH

19,6 г лимоннокислого трехзамещенного натрия растворяют в 200 - 300 см3 дистиллированной воды, приливают 16,6 см3 концентрированной соляной кислоты, 1 см3 фенола и доводят объем до 1 дм3 в мерной колбе дистиллированной водой. Концентрацию водородных ионов контролируют на pH-метре и при необходимости корректируют раствором гидроокиси натрия с массовой долей 50% или концентрированной соляной кислотой.

3.4. Приготовление стандартного раствора аминокислот

Готовят из основного раствора, содержащего 187 мг цистеиновой кислоты и 181 мг метионинсульфона в 100 см3 раствора соляной кислоты концентрации c(HCl) = 0,1 моль/дм3.

Стандартный раствор аминокислот готовят разведением 25 см3 основного раствора в 100 см3 раствора соляной кислоты концентрации c(HCl) = 0,1 моль/дм3. 1 см3 такого раствора содержит 0,47 мг цистеиновой кислоты и 0,45 кг метионинсульфона, что соответствует 2,5 мкмоль каждой кислоты в стандартном растворе, прилагаемом к автоанализаторам. Стандартный раствор хранят в герметично закрытых флаконах в холодильнике в течение нескольких лет.

Рабочий раствор аминокислот готовят разведением стандартного раствора аминокислот в буфере 2,20 ед. pH до концентрации, рекомендуемой для конкретного типа аминокислотного анализатора.

Навеску воздушно-сухого корма массой (100,0 +/- 0,1) мг помещают в чашку устройства для выпаривания гидролизатов УВГ-1 (или фарфоровую чашку при выпаривании на водяной бане), приливают 5 см3 свежеприготовленной окислительной смеси и выпаривают при постоянном помешивании при температуре 60 °C. Сухой остаток количественно переносят в ампулу термоблока ТМ-1 или в пробирку с перетяжкой, используя 10 см3 раствора соляной кислоты концентрации c(HCl) = 6 моль/дм3. Ампулу термоблока герметично закрывают тефлоновой крышкой и устанавливают в термоблок для гидролизата при температуре 110 °C. На блоке управления включают тумблер "Перемешивание" и устанавливают время гидролиза 4 ч.

При гидролизе в термостате ампулу запаивают в пламени газовой горелки в месте перетяжки и помещают в предварительно нагретый до температуры 110 °C сушильный шкаф на 16 ч.

При гидролизе в автоклаве содержимое количественно переносят в пробирки вместимостью 20 см3, закрывают стеклянными колпачками или воронками для предотвращения разбрызгивания кислоты во время гидролиза и устанавливают в автоклав. Гидролиз проводят при температуре 137 °C и давлении 0,25 МПа в течение 3 ч.

После завершения гидролиза гидролизаты охлаждают до комнатной температуры, перемешивают и содержимое фильтруют через беззольный фильтр (первую порцию фильтрата для анализа не используют). 1 - 2 см3 фильтрата выпаривают досуха на УВГ-1 или водяной бане и осадок растворяют в 10 см3 буферного раствора 2,20 ед. pH. Раствор гидролизата хранят в течение месяца в холодильнике в герметично закрытых пробирках.

Испытуемый гидролизат пробы вводят автоматически или при помощи шприца в верхнюю часть колонки анализатора аминокислот. Для идентификации аминокислот и их количественного определения на колонку наносят стандартный раствор аминокислот. Порядок работы на аминоанализаторах регламентируется прилагаемой инструкцией.

Содержание аминокислот рассчитывают по соотношению площадей пиков на хроматограмме соответствующих кислот в стандартном растворе и гидролизатах испытуемых проб.

5.1. Массу аминокислоты (X) в граммах на 1 кг воздушно-сухого вещества корма вычисляют по формуле

где c - массовая концентрация стандартного рабочего раствора, мг/см3;

- интегрируемая величина площади пика аминокислоты испытуемой пробы;

V - объем гидролизата, см3;

- интегрируемая величина площади пика аминокислоты, стандартного рабочего раствора;

m - масса навески пробы, мг.

Полученный результат корректируют с учетом разведения гидролизата и потери массы навески корма после обезжиривания.

Для пересчета цистеиновой кислоты и метионинсульфона в цистин и метионин используют переводные коэффициенты 0,710 и 0,023 соответственно.

За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений. Результаты вычисляют до третьего десятичного знака и округляют до второго десятичного знака. Допускаемые расхождения между результатами двух параллельных определений при доверительной вероятности P = 0,95 не должны превышать значений:

для цистеина ;

для метионина ,

где - среднее арифметическое результатов двух параллельных определений.

Допускается проведение анализа без параллельных определений при наличии в партии испытуемых проб стандартных образцов (СО). В этом случае за результат испытания принимают результат единичного определения, если разница между воспроизведенным и аттестованным значением содержания аминокислоты находится в пределах погрешности анализа.

5.2. Массу аминокислоты в граммах на 1 кг сухого вещества корма вычисляют по формуле

где X - масса аминокислоты в испытуемой пробе воздушно-сухого корма, г/кг;

W - влажность испытуемой пробы, %.