"ФС.2.3.0004. Фармакопейная статья. Лизоцима гидрохлорид. Лизоцим"
(утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 20.07.2023 N 377)
("Государственная фармакопея Российской Федерации. XV издание")

Пептидогликан N-ацетилмурамоилгидролаза из яичного белка, гидрохлорид.

Лизоцима гидрохлорид является основным пептидом, получаемым из белка куриного яйца, и обладает способностью гидролизовать мукополисахариды. Для получения исходного сырья используют животных, у которых отсутствуют опасные для человека заболевания вирусной, бактериальной и микоплазменной этиологии.

Содержит не менее 0,9 мг/мг (по активности) лизоцима C₆₁₆H₉₆₃N₁₉₃O₁₈₂S₁₀ в пересчете на сухое вещество.

Описание. Белый или почти белый порошок.

<*> Гигроскопичен.

--------------------------------

<*> Приводится для информации.

Растворимость. Легко растворим в воде, практически нерастворим в спирте 95%.

1. Спектрофотометрия (ОФС "Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях").

Раствор уксусной кислоты. В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 5,78 мл уксусной кислоты ледяной и доводят объем раствора водой до метки.

Раствор натрия ацетата. В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 8,2 г натрия ацетата безводного, растворяют в воде и доводят объем раствора тем же растворителем до метки.

Буферный раствор. В мерной колбе вместимостью 1000 мл смешивают 176 мл раствора уксусной кислоты и 824 мл раствора натрия ацетата, доводят значение pH раствором уксусной кислоты или раствором натрия ацетата до 5,40.

Испытуемый раствор. В мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 10 мг субстанции, растворяют в буферном растворе и доводят объем раствора тем же растворителем до метки. В мерную колбу вместимостью 20 мл помещают 1,0 мл полученного раствора и доводят объем раствора буферным раствором до метки.

Раствор стандартного образца лизоцима. В мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 10 мг фармакопейного стандартного образца лизоцима, растворяют в буферном растворе и доводят объем раствора тем же растворителем до метки. В мерную колбу вместимостью 20 мл помещают 1,0 мл полученного раствора и доводят объем буферным раствором до метки.

Спектр поглощения испытуемого раствора в области длин волн от 220 до 400 нм должен соответствовать спектру раствора стандартного образца лизоцима.

Раствор нингидрина. В мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 0,2 г нингидрина, растворяют в воде и доводят объем раствора водой до метки.

Растворяют 10 мг субстанции в 5 мл буферного раствора, прибавляют 1,0 мл раствора нингидрина и нагревают на водяной бане в течение 10 мин; должно появиться сине-фиолетовое окрашивание.

Прозрачность раствора. Раствор 0,15 г субстанции в 10 мл воды должен быть прозрачным (ОФС "Прозрачность и степень опалесценции (мутности) жидкостей"). При необходимости доводят значение pH хлористоводородной кислотой разведенной 8,3% до 3,00.

Цветность раствора. Раствор, полученный в испытании "Прозрачность раствора", должен быть бесцветным (ОФС "Степень окраски жидкостей", метод 2).

pH раствора. От 3,0 до 5,0 (1,5% раствор, ОФС "Ионометрия", метод 3).

Азот. От 16,8 до 18,6%, в пересчете на сухое вещество (ОФС "Определение азота в органических соединениях методом Кьельдаля", метод 2). Для определения используют 15 мг (точная навеска) субстанции.

Потеря в массе при высушивании. Не более 8,0% (ОФС "Потеря в массе при высушивании", способ 1). Высушивают до постоянной массы 0,1 г (точная навеска) субстанции при температуре 105 °C в течение 2 часов.

Сульфатная зола. Не более 2,0% (ОФС "Сульфатная зола"). Для определения используют 0,5 г (точная навеска) субстанции.

Остаточные органические растворители. В соответствии с ОФС "Остаточные органические растворители".

Аномальная токсичность. Субстанция должна быть нетоксичной (ОФС "Аномальная токсичность"). Тест-доза - 5 мг лизоцима гидрохлорида в 0,5 мл воды для инъекций на мышь, внутривенно. Срок наблюдения - 48 ч.

Микробиологическая чистота. В соответствии с ОФС "Микробиологическая чистота".

Определение проводят методом спектрофотометрии (ОФС "Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях").

Раствор калия дигидрофосфата. В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 9,08 г калия дигидрофосфата, растворяют в воде и доводят объем раствора водой до метки.

Раствор динатрия гидрофосфата. В мерную колбу вместимостью 250 мл помещают 2,365 г динатрия гидрофосфата безводного, растворяют в воде и доводят объем раствора водой до метки.

Буферный раствор. В мерной колбе вместимостью 1000 мл смешивают 800 мл раствора калия дигидрофосфата и 200 мл раствора динатрия гидрофосфата, при необходимости доводят значение pH раствором калия дигидрофосфата или раствором динатрия гидрофосфата до 6,2.

Испытуемый раствор. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 25 мг (точная навеска) в пересчете на сухое вещество субстанции, растворяют в буферном растворе и доводят объем раствора тем же растворителем до метки. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 2,0 мл полученного раствора и доводят объем раствора буферным раствором до метки. Раствор используют свежеприготовленным и хранят при температуре от 2 до 8 °C.

Раствор стандартного образца лизоцима. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 25 мг (точная навеска) в пересчете на сухое вещество фармакопейного стандартного образца лизоцима, растворяют в буферном растворе и доводят объем раствора тем же растворителем до метки. Раствор используют свежеприготовленным и хранят при температуре от 2 до 8 °C.

Раствор сравнения А. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 1,0 мл раствора стандартного образца лизоцима и доводят объем раствора буферным раствором до метки. Раствор используют свежеприготовленным и хранят при температуре от 2 до 8 °C.

Раствор сравнения Б. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 2,0 мл раствора стандартного образца лизоцима и доводят объем раствора буферным раствором до метки. Раствор используют свежеприготовленным и хранят при температуре от 2 до 8 °C.

Раствор субстрата. Готовят раствор лиофилизата клеток Micrococcus lysodeikticus в буферном растворе с концентрацией около 0,3 мг/мл.

В три флакона с завинчивающимися крышками добавляют по 4,0 мл раствора субстрата, предварительно нагретого при 36 +/- 1 °C в течение 10 мин, с интервалом в одну минуту прибавляют 0,1 мл испытуемого раствора в первый флакон, 0,1 мл раствора сравнения А во второй флакон и 0,1 мл раствора сравнения Б в третий флакон. Смеси выдерживают в течение ровно 12 мин на водяной бане при 36 +/- 1 °C, прибавляют в первый флакон 0,5 мл хлористоводородной кислоты раствора 1 М и перемешивают. С интервалом в одну минуту прибавляют по 0,5 мл хлористоводородной кислоты раствора 1 М во второй и в третий флакон.

Измеряют оптическую плотность полученных растворов на спектрофотометре в максимуме поглощения при длине волны 640 нм в кювете с толщиной слоя 1 см, используя в качестве раствора сравнения воду.

Содержание (по активности) лизоцима C₆₁₆H₉₆₃N₁₉₃O₁₈₂S₁₀ в субстанции в пересчете на сухое вещество в мг/мг (X), вычисляют по формуле:

где A₁ - оптическая плотность испытуемого раствора;

A_0А - оптическая плотность раствора сравнения А;

A_0Б - оптическая плотность раствора сравнения Б;

a₁ - навеска субстанции в пересчете на сухое вещество, мг;

a₀ - навеска фармакопейного стандартного образца лизоцима в пересчете на сухое вещество, мг;

P - активность фармакопейного стандартного образца лизоцима, мг/мг.

В герметично укупоренной упаковке.