"ФС.2.3.0006. Фармакопейная статья. Апротинин"
(утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 20.07.2023 N 377)
("Государственная фармакопея Российской Федерации. XV издание")

S⁵,S⁵⁵:S¹⁴,S³⁸:S³⁰,S⁵¹-Трицикло(L-аргинил-L-пролил-L-аспартил-L-фенилаланил-L-цистеинил-L-лейцил-L-глутамил-L-пролил-L-пролил-L-тирозил-L-треонилглицил-L-пролил-L-цистеинил-L-лизил-L-аланил-L-аргинил-L-изолейцил-L-изолейцил-L-аргинил-L-тирозил-L-фенилаланил-L-тирозил-L-аспарагинил-L-аланил-L-лизил-L-аланилглицил-L-лейцил-L-цистеинил-L-глутаминил-L-треонил-L-фенилаланил-L-валил-L-тирозилглицилглицил-L-цистеинил-L-аргинил-L-аланил-L-лизил-L-аргинил-L-аспарагинил-L-аспарагинил-L-фенилаланил-L-лизил-L-серил-L-аланил-L-глутамил-L-аспартил-L-цистеинил-L-метионил-L-аргинил-L-треонил-L-цистеинилглицилглицил-L-аланин).

Содержит не менее 90,0% и не более 110,0% заявленной активности апротинина C₂₈₄H₄₃₂N₈₄O₇₉S₇ на сухое вещество.

Описание. Белый или почти белый порошок.

<*> Гигроскопичен.

--------------------------------

<*> Приводится для информации.

Растворимость. Растворим в воде и натрия хлорида растворе 0,9%, практически нерастворим в хлороформе.

1. ТСХ (ОФС "Тонкослойная хроматография").

Пластинка. ТСХ пластинка со слоем силикагеля 60 F₂₅₄.

Подвижная фаза (ПФ). Вода - уксусная кислота ледяная, содержащая 100 г/л натрия ацетата безводного 40:50.

Испытуемый раствор. Готовят раствор, содержащий 27 000 КИЕ/мл апротинина.

Раствор стандартного образца апротинина. Фармакопейный стандартный образец апротинина разводят водой до получения раствора с активностью 27 000 КИЕ/мл.

Реактив для детектирования. Растворяют 0,1 г нингидрина в смеси 6 мл раствора меди(II) хлорида с концентрацией 10 г/л, 21 мл уксусной кислоты ледяной и 70 мл этанола.

На линию старта пластинки наносят по 10 мкл испытуемого раствора и раствора фармакопейного стандартного образца апротинина. Пластинку с нанесенными пробами сушат при температуре 60 °C, помещают в камеру с ПФ и хроматографируют восходящим способом. Когда фронт ПФ пройдет около 80 - 90% длины пластинки от линии старта, ее вынимают из камеры, сушат до удаления следов растворителей, опрыскивают реактивом для детектирования и просматривают в видимом свете.

Результат. Основная зона адсорбции на хроматограмме испытуемого раствора по положению, величине и окраске должна соответствовать зоне адсорбции апротинина на хроматограмме раствора стандартного образца апротинина.

2. Субстанция должна обладать антитрипсиновой активностью.

Испытуемый раствор. Готовят раствор, содержащий 27 000 КИЕ/мл апротинина. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 1,0 мл полученного раствора и доводят объем раствора буферным раствором pH 7,2 до метки.

Раствор хлористоводородной кислоты 0,002 М. Разбавляют 2,0 мл хлористоводородной кислоты раствора 0,1 М водой до 100,0 мл.

Раствор стандартного образца трипсина. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 10 мг фармакопейного стандартного образца трипсина, растворяют в растворе хлористоводородной кислоты 0,002 М и доводят объем раствора тем же растворителем до метки.

Растворитель. Уксусная кислота ледяная - вода - этанол 1:49:50.

Раствор казеина. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 0,2 г казеина, растворяют в буферном растворе pH 7,2 и доводят объем раствора тем же растворителем до метки.

Смешивают 1,0 мл испытуемого раствора с 1,0 мл раствора стандартного образца трипсина, оставляют на 10 мин и прибавляют 1,0 мл раствора казеина. Полученный раствор термостатируют при температуре 35 °C в течение 30 мин, затем охлаждают в ледяной воде и прибавляют 0,5 мл растворителя, встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 15 мин. Раствор должен мутнеть.

Контрольный раствор готовят в тех же условиях, используя буферный раствор pH 7,2 вместо испытуемого раствора. Контрольный раствор не должен мутнеть.

Прозрачность раствора. Раствор субстанции, содержащий 27 000 КИЕ/мл, должен быть прозрачным (ОФС "Прозрачность и степень опалесценции (мутности) жидкостей").

Цветность раствора. Раствор, полученный в испытании "Прозрачность раствора", должен выдерживать сравнение с эталоном Y₇ (ОФС "Степень окраски жидкостей", метод 2).

pH раствора. От 5,0 до 7,0 (раствор субстанции, содержащий 10 000 КИЕ/мл, ОФС "Ионометрия", метод 3).

Оптическая плотность. Оптическая плотность раствора субстанции, содержащего 5400 КИЕ/мл, измеренная при длине волны 277 нм в кювете с толщиной слоя 1 см, должна быть не более 0,80 (ОФС "Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях").

1. Дез-Ала-апротинин и дез-Ала-дез-Гли-апротинин. Определение проводят методом капиллярного зонного электрофореза с процедурой нормализации (ОФС "Капиллярный электрофорез").

Ведущий электролит. Растворяют 8,21 г калия дигидрофосфата в 400 мл воды и доводят pH раствора фосфорной кислотой до 3,0. Количественно переносят полученный раствор в мерную колбу вместимостью 500 мл и доводят объем раствора водой до метки.

Испытуемый раствор. Готовят раствор субстанции в воде, содержащий не менее 1800 КИЕ/мл.

Раствор стандартного образца апротинина. Готовят раствор фармакопейного стандартного образца апротинина в воде с концентрацией, равной концентрации апротинина в испытуемом растворе.

Примечание

Примесь A: апротинин-(1-56)-пептид.

Примесь B: апротинин-(1-57)-пептид.

Относительное время миграции соединений. Апротинин - 1 (около 22 мин); примесь A - около 0,98; примесь B - около 0,99.

Идентификация примесей. Для идентификации пиков примесей A и B используются электрофореграмма раствора стандартного образца апротинина и электрофореграмма, прилагаемая к фармакопейному стандартному образцу апротинина.

На электрофореграмме раствора стандартного образца апротинина:

- абсолютное время миграции апротинина должно составлять от 19 до 25 мин;

- разрешение (R_S) между пиками примесей A и B должно быть не менее 0,8;

- разрешение (R_S) между пиками примеси B и апротинина должно быть не менее 0,5;

- распределение пиков: электрофореграмма испытуемого раствора должна быть качественно и количественно аналогична электрофореграмме раствора стандартного образца апротинина;

- отношение сигнал/шум (S/N) для пика апротинина должно быть не менее 1000. При необходимости изменяют концентрацию испытуемого раствора для получения пиков достаточной высоты.

На электрофореграмме испытуемого раствора основная зона по положению должна совпадать с положением зоны апротинина на электрофореграмме раствора стандартного образца апротинина.

- примесь A - не более 8,0%;

- примесь B - не более 7,5%.

2. Пироглутамил-апротинин и другие. Определение проводят методом ВЭЖХ (ОФС "Высокоэффективная жидкостная хроматография").

Подвижная фаза А (ПФА). В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 3,52 г калия дигидрофосфата и 7,26 г динатрия гидрофосфата гептагидрата, растворяют в 500 мл воды и доводят объем раствора водой до метки.

Подвижная фаза Б (ПФБ). В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 3,52 г калия дигидрофосфата, 7,26 г динатрия гидрофосфата гептагидрата и 66,07 г аммония сульфата, растворяют в 500 мл воды и доводят объем раствора водой до метки.

Испытуемый раствор. Готовят раствор субстанции в ПФА, содержащий около 9000 КИЕ/мл.

Раствор для проверки пригодности хроматографической системы. Содержимое флакона фармакопейного стандартного образца апротинина для проверки пригодности хроматографической системы растворяют в 2,0 мл ПФА.

Раствор для проверки чувствительности хроматографической системы. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 1,0 мл испытуемого раствора и доводят объем раствора ПФА до метки. В мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 0,5 мл полученного раствора и доводят объем раствора ПФА до метки.

Примечание

Примесь C ((5-оксопролил)апротинин): S⁶,S⁵⁶:S¹⁵,S³⁹:S³¹,S⁵²-трицикло(5-оксопролил-L-аргинил-L-пролил-L-аспартил-L-фенилаланил-L-цистеинил-L-лейцил-L-глутамил-L-пролил-L-пролил-L-тирозил-L-треонилглицил-L-пролил-L-цистеинил-L-лизил-L-аланил-L-аргинил-L-изолейцил-L-изолейцил-L-аргинил-L-тирозил-L-фенилаланил-L-тирозил-L-аспарагинил-L-аланил-L-лизил-L-аланилглицил-L-лейцил-L-цистеинил-L-глутаминил-L-треонил-L-фенилаланил-L-валил-L-тирозилглицилглицил-L-цистеинил-L-аргинил-L-аланил-L-лизил-L-аргинил-L-аспарагинил-L-аспарагинил-L-фенилаланил-L-лизил-L-серил-L-аланил-L-глутамил-L-аспартил-L-цистеинил-L-метионил-L-аргинил-L-треонил-L-цистеинилглицилглицил-L-аланин).

Хроматографируют раствор для проверки чувствительности хроматографической системы, раствор для проверки пригодности хроматографической системы и испытуемый раствор.

Относительное время удерживания соединений. Апротинин - 1 (17 - 20 мин); примесь C - около 0,9.

На хроматограмме раствора для проверки чувствительности хроматографической системы отношение сигнал/шум (S/N) для пика апротинина должно быть не менее 10.

На хроматограмме раствора для проверки пригодности хроматографической системы:

- разрешение (R_S) между пиками примеси C и апротинина должно быть не менее 1,5;

- фактор асимметрии пика (A_S) апротинина должен быть не более 1,3.

Допустимое содержание примесей. Содержание каждой из примесей в субстанции в процентах вычисляют согласно методу нормирования (ОФС "Хроматография"):

- примесь C - не более 1,0%;

- любая другая примесь - не более 0,5%;

- сумма примесей - не более 1,0%.

Не учитывают пики, площадь которых менее площади основного пика на хроматограмме раствора для проверки чувствительности хроматографической системы (менее 0,1%).

3. Олигомеры апротинина. Определение проводят методом эксклюзионной хроматографии (ОФС "Эксклюзионная хроматография").

Подвижная фаза (ПФ). Ацетонитрил - уксусная кислота - вода 200:200:600.

Испытуемый раствор. Готовят раствор субстанции в воде, содержащий около 9000 КИЕ/мл.

Раствор для проверки пригодности хроматографической системы. В стеклянный флакон с завинчивающейся крышкой помещают 30 мг субстанции, выдерживают в сушильном шкафу при температуре 110 +/- 5 °C в течение 4 ч, охлаждают. В мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 18 мг субстанции, растворяют в воде и доводят объем раствора водой до метки.

Раствор для проверки чувствительности хроматографической системы. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 1,0 мл испытуемого раствора и доводят объем раствора водой до метки. В мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 1,0 мл полученного раствора и доводят объем раствора водой до метки.

Хроматографируют раствор для проверки чувствительности хроматографической системы, раствор для проверки пригодности хроматографической системы и испытуемый раствор.

Относительное время удерживания соединений. Мономер апротинина - 1 (около 25 мин); димер апротинина - около 0,9.

Идентификация примесей. Для идентификации пика димера апротинина используют хроматограмму раствора для проверки пригодности хроматографической системы.

Пригодность хроматографической системы. На хроматограмме раствора для проверки пригодности хроматографической системы:

- разрешение (R_S) между пиками димера и мономера апротинина должно быть не менее 1,3;

- фактор асимметрии пика (A_S) мономера апротинина должен быть не более 2,5.

Допустимое содержание примесей. Содержание каждой из примесей в субстанции в процентах вычисляют согласно методу нормирования (ОФС "Хроматография"):

- сумма примесей - не более 1,0%.

Не учитывают пики, площадь которых менее площади основного пика на хроматограмме раствора для проверки чувствительности хроматографической системы (менее 0,1%).

Потеря в массе при высушивании. Не более 6,0% (ОФС "Потеря в массе при высушивании", способ 2). Для определения 0,1 г (точная навеска) субстанции сушат до постоянной массы не менее 24 ч.

Сульфатная зола. Не более 3,0% (ОФС "Сульфатная зола"). Для определения используют 0,2 г (точная навеска) субстанции.

Аномальная токсичность. Субстанция должна быть нетоксичной (ОФС "Аномальная токсичность"). Тест-доза - 3600 КИЕ апротинина в 0,5 мл воды для инъекций на мышь, внутривенно. Срок наблюдения - 48 ч.

Бактериальные эндотоксины. Не более 0,877 ЕЭ на 1000 КИЕ апротинина (ОФС "Бактериальные эндотоксины").

Гистамин. Не более 0,2 мкг гистамина-основания на 5400 КИЕ апротинина (ОФС "Испытание на гистамин").

Микробиологическая чистота. В соответствии с ОФС "Микробиологическая чистота".

Определение проводят методом титриметрии (ОФС "Титриметрия (титриметрические методы анализа)").

Активность апротинина определяют путем измерения ингибирующего действия на раствор трипсина с известной активностью. Ингибирующую активность апротинина рассчитывают как разность между начальным и остаточным значениями активности трипсина.

1800 единиц ингибитора протеаз (ЕИП) ингибирует 50% ферментной активности 2 микрокаталей трипсина.

Все растворы используют свежеприготовленными.

Испытуемый раствор. Готовят раствор субстанции в 0,0015 М боратном буферном растворе (pH 8,0), содержащий около 3000 КИЕ/мл.

Раствор стандартного образца трипсина. Готовят раствор фармакопейного стандартного образца трипсина с концентрацией 0,8 микрокаталей/мл в 0,001 М растворе хлористоводородной кислоты. Раствор готовят непосредственно перед использованием и хранят на ледяной бане.

Раствор стандартного образца трипсина разбавленный. Разбавляют 0,5 мл раствора стандартного образца трипсина до 10,0 мл 0,0015 М боратным буферным раствором pH 8,0. Полученный раствор выдерживают при температуре 20 - 25 °C в течение 10 мин, затем помещают на ледяную баню.

Раствор бензоиларгинина этилового эфира гидрохлорида 0,69%. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 0,345 г (точная навеска) бензоиларгинина этилового эфира гидрохлорида, растворяют в воде и доводят объем раствора тем же растворителем до метки.

Раствор трипсина и апротинина. К 4,0 мл раствора стандартного образца трипсина прибавляют 1,0 мл испытуемого раствора, немедленно разбавляют до 40,0 мл 0,0015 М боратным буферным раствором pH 8,0. Полученный раствор выдерживают при температуре (20 +/- 5) °C в течение 10 мин, затем помещают на ледяную баню. Раствор используют в течение 6 ч после приготовления.

В ходе проведения испытания в реакторе обеспечивают постоянную атмосферу азота, непрерывное перемешивание и постоянную температуру (25 +/- 0,1) °C.

В реактор помещают 9,0 мл 0,0015 М боратного буферного раствора pH 8,0 с температурой 25 +/- 0,1 °C, прибавляют 1,0 мл раствора бензоиларгинина этилового эфира гидрохлорида 0,69%, доводят pH раствора 0,1 М раствором натрия гидроксида до 8,0. После того как температура достигнет равновесия при 25 +/- 0,1 °C, прибавляют 1,0 мл раствора трипсина и апротинина. Прибавляют 0,1 М раствор натрия гидроксида, поддерживая pH 8,0 и регистрируя расход титранта каждые 30 с. Испытания проводят в течение 6 мин. Определяют ежесекундный расход 0,1 М раствора натрия гидроксида в мл (n₁, мл).

В тех же условиях титруют 1,0 мл раствора стандартного образца трипсина разбавленного, определяя ежесекундный расход 0,1 М раствора натрия гидроксида в мл (n₂, мл).

Активность субстанции в калликреиновых единицах (КИЕ) на мг (X) вычисляют по формуле:

где n₁ - ежесекундный расход 0,1 М раствора натрия гидроксида, израсходованного на титрование раствора трипсина и апротинина, мл;

n₂ - ежесекундный расход 0,1 М раствор натрия гидроксида, израсходованного на титрование раствора стандартного образца трипсина разбавленного, мл.

В герметично укупоренной упаковке, в защищенном от света месте.