"МР 4.1.0213-20. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Проведение пробоподготовки пищевых продуктов для определения жирнокислотного состава и трансизомеров жирных кислот. Методические рекомендации"
(утв. Роспотребнадзором 16.09.2020)

1. Разработаны ФБУЗ "Федеральный центр гигиены и эпидемиологии" Роспотребнадзора (В.Ю. Ананьев, А.А. Гарбузова, М.В. Зароченцев, О.В. Андросова, А.А. Константинов, В.В. Бояркина, М.М. Дударев, С.А. Мокренская).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 16 сентября 2020 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические рекомендации (далее - МР) устанавливают порядок применения методики пробоподготовки образцов пищевых продуктов путем выделения жира для дальнейшего определения жирнокислотного состава и трансизомеров жирных кислот.

1.2. МР распространяются на следующие пищевые продукты:

- кондитерские изделия, содержащие масла растительные, жиры животные и продукты их переработки;

- масла растительные, жиры животные и продукты их переработки;

- молоко, молочные продукты и продукты их переработки;

- мясо, мясные продукты и продукты их переработки;

- яйца и яичные продукты.

1.3. МР предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также могут быть использованы организациями, аккредитованными в установленном порядке на проведение исследований продовольственного сырья, пищевых продуктов.

--------------------------------

<1> Примечание. Допускается использование средств измерений, вспомогательного оборудования, посуды, материалов и реактивов с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать технику безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, пожаровзрывобезопасности по ГОСТ 12.1.018, электробезопасности по ГОСТ Р 12.1.019, а также условия, изложенные в технической документации на применяемое вспомогательное оборудование.

К выполнению методики допускаются лица с высшим или средним специальным образованием, прошедшие соответствующую подготовку и имеющие навыки работы в области химического анализа. Исполнители должны быть проинструктированы об основных мерах техники безопасности при работе с органическими растворителями, а также с основными правилами безопасности при работе в химической лаборатории.

4.1. Отбор проб пищевой продукции проводят с учетом условий нормативно-технической документации на конкретный вид пищевого продукта.

5.1.1.1. Продукты без пищевкусовых добавок или с пищевкусовыми добавками, образующими с продуктом однородную структуру, кисломолочные продукты (например, с ароматизаторами).

Продукт максимально полно освобождают от упаковки, помещают в стакан вместимостью 600 см³, тщательно растирают и нагревают на водяной бане до температуры 35 °C, тщательно перемешивая шпателем до получения однородной смеси. Подготовленную пробу переносят в колбу вместимостью 500 см³ с притертой пробкой и охлаждают до температуры (20 +/- 2) °C.

5.1.1.2. Продукты с отделяемыми пищевкусовыми компонентами (орехами, карамелью, фруктовыми наполнителями в виде кусочков, начинки и другими наполнителями).

Из продукта максимально полно удаляют пищевкусовые компоненты и далее проводят подготовку в соответствии с п. 5.1.1.1.

5.1.1.3. Продукты в глазури и/или декорированные.

С поверхности глазированного и/или декорированного продукта полностью удаляют покрытие и/или декоративные пищевые продукты и далее проводят подготовку в соответствии с п. 5.1.1.1.

5.1.1.4. Продукты с неотделяемыми пищевкусовыми компонентами.

Продукт массой 100 - 150 г помещают в стакан вместимостью 600 см³, нагревают на водяной бане до температуры 32 °C и гомогенизируют с помощью гомогенизатора в течение 1 - 3 мин при частоте вращения ножей от 2000 до 4000 мин^-1 до получения однородной массы. Пробу переносят в колбу с притертой пробкой вместимостью 500 см³ и охлаждают до температуры (20 +/- 2) °C.

Во избежание расслоения пробу для анализа отбирают сразу же после гомогенизации.

5.1.1.5. Многослойные продукты.

При необходимости проведения определений в каждом отдельном слое многослойного продукта его замораживают и аккуратно разрезают на слои при температуре продукта не выше минус 12 °C. Каждый слой продукта помещают в отдельную колбу с притертой пробкой и далее проводят подготовку в соответствии с п. 5.1.1.1.

5.1.1.6. Творог и творожные продукты.

В фарфоровую ступку помещают 100 - 150 г продукта. Тщательно перемешивают, растирая продукт пестиком, и сразу же проводят процедуру выделения жировой фазы.

5.1.1.7. Сыры.

Образец массой 100 - 150 г сыра измельчают на мелкой терке.

5.1.2. Выделение жировой фракции.

5.1.2.1. Метод Фолча.

В центрифужную пробирку на 50 см² отбирают около 1 г предварительно гомогенизированного образца (при низком содержании жира навеску можно увеличить). Приливают 10 см³ смеси хлороформ:метанол (соотношение 2:1 по объему) соответственно массе навески (масса навески:требуемый объем растворителя - 1:10). Образцы перемешивают и помещают на встряхиватель на 2 часа при 200 об./мин. Затем приливают от 2,5 до 5 см³ дистиллированной воды (количество воды должно составлять не менее трети объема смеси растворителей). Образцы центрифугируют 5 минут при 4000 об./мин. Нижний (хлороформный) слой отбирают в круглодонные колбы. К оставшимся образцам приливают 10 - 20 см³ хлороформа и повторяют экстракцию еще раз. Объединенные экстракты упаривают на роторном испарителе <2> при температуре не выше 40 °C и давлении 200 - 300 мбар до исчезновения запаха растворителя.

--------------------------------

<2> Примечание. Также экстракт можно упаривать с помощью термостатируемого нагревательного модуля в токе азота.

5.1.2.2. Молоко и жидкие молочные продукты. Альтернативный метод.

Анализируемую пробу продукта с массовой долей жира более 3% объемом 100 см³ помещают в две центрифужные пробирки (по 50 см³ в каждую). Для продуктов с массовой долей жира менее 3% объем пробы увеличивают.

Пробирки помещают в центрифугу и центрифугируют при 4 000 мин^-1 в течение (15 +/- 1) мин.

Для молока по окончании центрифугирования отбирают верхнюю жировую фракцию и помещают в гомогенизатор, добавляют 150 см³ гексана и гомогенизируют в течение 3 - 5 мин при частоте вращения ножей от 2000 до 5000 мин^-1. Отделяют гексановый слой с растворенным в нем жиром и переносят его в круглодонную колбу вместимостью 250 см³. И далее проводят процедуры по п. 5.1.2.4.

Для жидких кисломолочных продуктов декантируют отделившуюся сыворотку, а всю оставшуюся фракцию переносят в гомогенизатор, используя 150 см³ гексана. Полученную смесь аккуратно гомогенизируют в течение 3 - 5 мин при частоте вращения ножей от 2000 до 5000 мин^-1, отделяют гексановый слой с растворенным в нем жиром и переносят его в круглодонную колбу вместимостью 250 см³. Далее проводят процедуры по п. 5.1.2.4.

5.1.2.3. Молочная продукция и продукты переработки. Альтернативный метод.

Продукт помещают в гомогенизатор в количестве, обеспечивающем получение не менее 1 г жира: для продуктов с массовой долей жира более 15% - масса пробы 20,0 г; для продуктов с массовой долей жира менее 15% - 50,0 г.

Добавляют 150 см³ гексана, аккуратно гомогенизируют в течение 3 - 5 мин при частоте вращения ножей от 2000 до 5000 мин^-1, отделяют гексановый слой с растворенным в нем жиром и полностью переносят его в круглодонную колбу вместимостью 250 см³.

5.1.2.4. Круглодонную колбу подсоединяют к ротационному испарителю и полностью отгоняют растворитель не выше 40 °C и давлении 200 - 300 мбар.

5.1.3. Метод с предварительным выделением жира.

5.1.3.1. Жир молочный, масло сливочное и топленое, пасты масляные.

Пробу продукта массой (40 - 50) г расплавляют в химическом стакане вместимостью 100 см³ в сушильном шкафу при температуре 45 °C для расслоения на жировую и водную фазу. Затем жировую фазу фильтруют через сухую фильтровальную бумагу так, чтобы водная фаза не попадала на фильтр. Если отфильтрованный жир будет прозрачным, то продолжают подготовку пробы. При наличии в отфильтрованном жире мути его фильтруют повторно.

5.1.3.2. Сырое молоко и сырые сливки, питьевое молоко и питьевые сливки.

5.1.3.2.1. Первый вариант пробоподготовки.

В коническую колбу вместимостью 500 см³ помещают 400 см³ пробы продукта. Пробу нагревают на водяной бане до температуры 75 °C, добавляют 15 см³ осадительного реактива (70,0 г сернокислой меди растворяют в 1000 см³ дистиллированной воды) и продолжают нагревать до получения сгустка, который фильтруют через фильтровальную бумагу, промывают его теплой водой. Осадок переносят в фарфоровую ступку, перемешивают его с достаточным количеством безводного сульфата натрия до получения зернистой массы.

5.1.3.2.2. Второй вариант пробоподготовки.

Пробу продукта помещают в химический стакан вместимостью 1000 см³ и оставляют до скисания. Затем снимают верхний жировой слой, помещают в фарфоровую ступку и тщательно перемешивают с безводным сернокислым натрием, взятым в количестве, достаточном для образования зернистой массы.

5.1.3.3. Концентрированное молоко, сгущенное молоко и мороженое.

В конической колбе вместимостью 250 см³ взвешивают 100,0 г продукта.

Мороженое предварительно освобождают от глазури и других отделяемых компонентов. В пробу продукта добавляют 100 см³ дистиллированной воды, нагревают смесь на водяной бане до температуры 75 °C, добавляют 15 см³ осадительного реактива (70,0 г сернокислой меди растворяют в 1000 см³ дистиллированной воды) и продолжают нагревать до получения сгустка, который фильтруют через фильтровальную бумагу, промывают его теплой водой до обесцвечивания фильтрата. Осадок переносят в фарфоровую ступку и тщательно перемешивают с безводным сернокислым натрием, взятым в количестве, достаточном для образования зернистой массы.

5.1.3.4. Сметана и продукты на ее основе.

Образец массой 100 г тщательно перемешивают с безводным сернокислым натрием, взятым в количестве, достаточном для образования зернистой массы.

5.1.3.5. Сухие молочные продукты.

В фарфоровой ступке взвешивают 300,0 г пробы продукта и добавляют 300 см³ дистиллированной воды. Смесь тщательно перемешивают стеклянной палочкой до однородной консистенции и оставляют на 60 мин до набухания белков и перемешивают в фарфоровой ступке с безводным сернокислым натрием, взятым в количестве, достаточном для образования зернистой массы.

5.1.3.6. Творог и творожные продукты.

Образец массой 100 г пробы продукта перемешивают в фарфоровой ступке с безводным сернокислым натрием, взятым в количестве, достаточном для образования зернистой массы.

5.1.3.7. Сыр.

Образец массой 100 г продукта измельчают с помощью терки, помещают в фарфоровую ступку и растирают с безводным сернокислым натрием, взятым в количестве, достаточном для образования зернистой массы.

5.1.3.8. Выделение жира.

Пробу продукта, полученную в соответствии с п.п. 5.1.3.1 - 5.1.3.7, переносят в колбу на 250 см³ и добавляют 100 - 150 см³ н-гексана, встряхивают на перемешивающем устройстве или вручную и экстрагируют жир. Растворитель полностью удаляют на роторном испарителе при температуре не выше 40 °C.

В случае если дальнейший анализ пробы не может быть проведен сразу, то жир, выделенный по 5.1.3.8, хранят в холодильнике при температуре 4 °C не более 3 месяцев.

5.2.1. Метод Фолча.

В центрифужную пробирку на 50 см³ отбирают около 1 г предварительно гомогенизированного образца (при низком содержании жира навеску можно увеличить). Приливают 10 см³ смеси хлороформ:метанол (соотношение 2:1 по объему) соответственно массе навески (масса навески:требуемый объем растворителя - 1:10). Образцы перемешивают и помещают на встряхиватель на 2 часа при 200 об./мин. Затем приливают 2,5 - 5 см³ дистиллированной воды (количество воды должно составлять не менее трети объема смеси растворителей). Образцы центрифугируют 5 минут при 4000 об./мин. Нижний (хлороформный) слой отбирают в круглодонные колбы. К оставшимся образцам приливают 10 - 20 см³ хлороформа и повторяют экстракцию еще раз. Объединенные экстракты упаривают на роторном испарителе <3> при температуре не выше 40 °C и давлении 200 - 300 мбар до исчезновения запаха растворителя. Также экстракт можно упаривать с помощью термостатируемого нагревательного модуля в токе азота.

--------------------------------

<3> Примечание. Также экстракт можно упаривать с помощью термостатируемого нагревательного модуля в токе азота.

5.2.2. Альтернативный метод.

Образец массой 100 г помещают в колбу с притертой пробкой вместимостью 100 см³, заливают смесью 10 см³ метанола и 10 см³ хлороформа и выдерживают при комнатной температуре в течение 24 ч для полного растворения липидов.

Перемешиванием смеси с помощью гомогенизатора можно сократить срок экстракции до 1 ч.

При малом количестве пробы (менее 1 г), с содержанием жира не менее 100 мг, допускается растирание пробы со смесью метанола и хлороформа 1:1 в ступке под тягой в течение 10 - 15 мин. Затем смесь фильтруют через бумажный фильтр. Из нижнего прозрачного хлороформного слоя отбирают аликвоту объемом 1 - 3 см³ (объем аликвоты должен содержать около 100 мг жира) и переносят в пробирку с притертой пробкой. Пробирку присоединяют к ротационному испарителю и упаривают смесь досуха при температуре 40 °C.

5.2.3. При очень низком содержании жира в образце его предварительно выделяют из пробы экстракцией органическим растворителем (например, гексаном).

5.3.1. Метод Фолча.

В центрифужную пробирку на 50 см³ отбирают около 1 г предварительно гомогенизированного образца (при низком содержании жира навеску можно увеличить). Приливают 10 см³ смеси хлороформ:метанол (соотношение 2:1 по объему) соответственно массе навески (масса навески:требуемый объем растворителя - 1:10). Образцы перемешивают и помещают на встряхиватель на 2 часа при 200 об./мин. Затем приливают 2,5 - 5 см³ дистиллированной воды (количество воды должно составлять не менее трети объема смеси растворителей). Образцы центрифугируют 5 минут при 4000 об./мин. Нижний (хлороформный) слой отбирают в круглодонные колбы. К оставшимся образцам приливают 10 - 20 см³ хлороформа и повторяют экстракцию еще раз. Объединенные экстракты упаривают на роторном испарителе <4> при температуре не выше 40 °C и давлении 200 - 300 мбар до исчезновения запаха растворителя. Также экстракт можно упаривать с помощью термостатируемого нагревательного модуля в токе азота.

--------------------------------

<4> Примечание. Также экстракт можно упаривать с помощью термостатируемого нагревательного модуля в токе азота.

5.3.2. Альтернативный метод.

5.3.2.1. Приготовление растворов.

Приготовление смеси хлороформа и этилового спирта в объемном соотношении 95:5.

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 50 см³ этилового спирта. Объем раствора доводят до метки хлороформом и перемешивают.

5.3.2.2. Выделение жира.

Массу анализируемой пробы рассчитывают так, чтобы она содержала от 1 до 3 г жира. Измельченную анализируемую пробу взвешивают с записью результата в граммах до третьего десятичного знака, помещают в патрон из фильтровальной бумаги, который сворачивают таким образом, чтобы предотвратить переход анализируемой пробы в раствор. Патрон с образцом помещают в прибор Сокслета и проводят экстракцию смесью хлороформ:этиловый спирт в соотношении 95:5 в течение 5 ч. После экстракции раствор жира выпаривают с помощью ротационного испарителя при температуре не выше 40 °C и давлении 200 - 300 мбар.

5.4.1. Пробы твердых жиров должны быть полностью расплавлены на водяной бане при температуре не более чем на 10 °C выше их точки плавления и тщательно перемешаны. При наличии в жире мути его фильтруют через складчатый фильтр из фильтровальной бумаги.

5.4.2. Выделение жира из эмульсионных жировых продуктов (спреды, маргарины).

Пробы эмульсионных жировых продуктов массой 40 - 50 г расплавляют в химическом стакане вместимостью 150 см³ на водяной бане или в сушильном шкафу при температуре от 40 °C до 60 °C, выдерживают при этой температуре до полного расслоения. Жировой слой отделяют от водного и фильтруют при температуре от 40 °C до 60 °C через складчатый фильтр из фильтровальной бумаги. Если отфильтрованный жир будет прозрачен, то приступают к выполнению измерений. При наличии в жире мути его повторно фильтруют.

5.4.3. Выделение жира из БАД.

В случае необходимости выделения жира из БАД используют метод Фолча. В центрифужную пробирку на 50 см³ отбирают около 1 г предварительно очищенного и гомогенизированного образца (при низком содержании жира навеску можно увеличить). Приливают 10 см³ смеси хлороформ:метанол (соотношение 2:1 по объему) соответственно массе навески (масса навески:требуемый объем растворителя - 1:10). Образцы перемешивают и помещают на встряхиватель на 2 ч при 200 об./мин. Затем приливают 2,5 - 5 см³ дистиллированной воды (количество воды должно составлять не менее трети объема смеси растворителей). Образцы центрифугируют 5 минут при 4000 об./мин. Нижний (хлороформный) слой отбирают в круглодонные колбы. К оставшимся образцам приливают 10 - 20 см³ хлороформа и повторяют экстракцию еще раз. Объединенные экстракты упаривают на роторном испарителе при температуре не выше 40 °C и давлении 200 - 300 мбар до исчезновения запаха растворителя. Также экстракт можно упаривать с помощью термостатируемого нагревательного модуля в токе азота.

5.5.1. Подготовка проб.

5.5.1.1. Яйца.

В стакан вместимостью 600 см³ осторожно разбивают пять - семь куриных или индюшиных яиц или 10 - 12 перепелиных или цесариных яиц, или два-три страусиных яйца, не допуская попадания в стакан частиц скорлупы. Стеклянной палочкой смешивают желтки <5> с белками и полученную массу гомогенизируют с помощью гомогенизатора или миксера при средней скорости, не допуская вспенивания. Для удаления пленок и мембран гомогенат фильтруют через два слоя марли.

--------------------------------

<5> Примечание. В случае необходимости допускается использовать для анализа только желтки.

5.5.1.2. Яичные продукты.

Подготовку лабораторных проб яичных продуктов проводят по ГОСТ 31720.

Подготовленные пробы хранят до окончания испытания в плотно закрытой стеклянной емкости в холодильнике при температуре от 4 °C до 8 °C.

5.5.2. Метод Фолча.

В центрифужную пробирку на 50 см³ отбирают около 1 г предварительно гомогенизированного образца (при низком содержании жира навеску можно увеличить). Приливают 10 см³ смеси хлороформ:метанол (соотношение 2:1 по объему) соответственно массе навески (масса навески:требуемый объем растворителя - 1:10). Образцы перемешивают и помещают на встряхиватель на 2 часа при 200 об./мин. Затем приливают 2,5 - 5 см³ дистиллированной воды (количество воды должно составлять не менее трети объема смеси растворителей). Образцы центрифугируют 5 минут при 4000 об./мин. Нижний (хлороформный) слой отбирают в круглодонные колбы. К оставшимся образцам приливают 10 - 20 см³ хлороформа и повторяют экстракцию еще раз. Объединенные экстракты упаривают на роторном испарителе <6> при температуре не выше 40 °C и давлении 200 - 300 мбар до исчезновения запаха растворителя.

--------------------------------

<6> Примечание. Также экстракт можно упаривать с помощью термостатируемого нагревательного модуля в токе азота.

5.5.2. Альтернативный метод.

5.5.2.1. Кислотный гидролиз пробы.

Навеску подготовленной по 5.5.2 пробы массой:

- 5 г жидкого меланжа или перемешанного яйца (яичной массы);

- 3 г жидкого желтка;

- 2 г яичного сухого меланжа или сухого желтка взвешивают каждого продукта соответственно в конической колбе вместимостью 100 см³. Медленно добавляют с постоянным энергичным встряхиванием колбы 10 см³ неразбавленной (жидкие яичные продукты) или разбавленной (сухие яичные продукты) соляной кислоты (смешивают по объему четыре части концентрированной соляной кислоты и одну часть дистиллированной воды), смывая все частицы яичного продукта, приставшие к стенкам колбы, подсоединяют холодильник и помещают в водяную баню, нагретую до температуры 40 °C, греют в течение 30 мин, встряхивая колбу через каждые 5 мин. После окончания гидролиза колбу снимают с водяной бани, добавляют 10 см³ дистиллированной воды и охлаждают до комнатной температуры.

5.5.2.2. Выделение жира.

Содержимое колбы переносят в цилиндр вместимостью 100 см³, смывая остатки пробы с колбы в цилиндр с помощью 10 см³ дистиллированной воды. В колбу добавляют 25 см³ диэтилового эфира, встряхивают, промывая стенки колбы, и добавляют в цилиндр. Цилиндр с гидролизованной пробой закрывают стеклянной пробкой и энергично встряхивают с переворачиванием цилиндра в течение примерно 1 мин, периодически открывая пробку для сброса давления. Затем осторожно вынимают пробку и добавляют в цилиндр 25 см³ петролейного эфира. Цилиндр закрывают пробкой и встряхивают с переворачиванием в течение примерно 30 с. Цилиндр оставляют в покое до полного разделения на водную и прозрачную эфирную фазы с четкой границей между ними. Отбирают как можно больше верхнего эфирного слоя с помощью дозатора и переносят через воронку с безводным сернокислым натрием (в нижнюю часть носика помещают тампон из обезжиренной стекловаты и насыпают безводный сернокислый натрий слоем высотой примерно 30 мм) в грушевидную колбу вместимостью 100 см³, в которую предварительно добавляют несколько кристаллов бутилокситолуола.

5.6.1. На всех этапах подготовки пробы и экстракции жира необходимо предохранять пробу от прямого попадания солнечных и ультрафиолетовых лучей.

Упаривание полученных экстрактов выполняют при температуре не выше 40 °C до влажного остатка.

6.1. Приготовление метиловых эфиров жирных кислот может быть проведено по ГОСТ 31665 или иному документу.

7.1. Проведение измерений для жирнокислотного состава проводят по ГОСТ 30418; ГОСТ 31663; ГОСТ 32915.

7.2. Проведение измерений для определения трансизомеров жирных кислот проводят по ГОСТ 31754.

8.1. Полученные экстракты не следует хранить в течение долгого времени в связи с возможностью их окисления. При хранении экстрактов в течение непродолжительного времени (от нескольких дней до нескольких недель) их растворяют в смеси свежеперегнанных хлороформа и метанола (2:1) или в хлороформе, помещают в пробирки с притертыми пробками, поддерживая температуру от 0 до 15 °C. При длительных сроках хранения к раствору липидов добавляют антиоксиданты.

1. ГОСТ 32915 Молоко и молочная продукция. Определение жирнокислотного состава жировой фазы методом газовой хроматографии.

2. ГОСТ 33490 Молоко и молочная продукция. Обнаружение растительных масел и жиров на растительной основе методом газожидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием.

3. ГОСТ Р 55483 Мясо и мясные продукты. Определение жирнокислотного состава методом газовой хроматографии.

4. ГОСТ Р 54686 Изделия кондитерские. Метод определения массовой доли насыщенных жирных кислот.

5. ГОСТ 31754 Масла растительные, жиры животные и продукты их переработки. Методы определения массовой доли трансизомеров жирных кислот.

6. ГОСТ 32150 Пищевые продукты переработки яиц сельскохозяйственной птицы. Метод определения жирнокислотного состава.